BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI TRIỆU ANH TUẤN NGHIÊN CỨU PHÁT TRIỂN CHỈ THỊ PHÂN TỬ PHỤC VỤ CHỌN GIỐNG TU HÀI (Lutraria rhynchaena, Jonas 1844) THEO HƯỚNG TĂNG TRƯỞNG LUẬN ÁN TIẾ[.]
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI TRIỆU ANH TUẤN NGHIÊN CỨU PHÁT TRIỂN CHỈ THỊ PHÂN TỬ PHỤC VỤ CHỌN GIỐNG TU HÀI (Lutraria rhynchaena, Jonas 1844) THEO HƯỚNG TĂNG TRƯỞNG LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC Hà Nội – 2023 MỤC LỤ LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT .vi DANH MỤC BẢNG viii DANH MỤC HÌNH .x MỞ ĐẦU 1 Tính cấp thiết đề tài Mục tiêu nghiên cứu Nội dung nghiên cứu .3 Ý nghĩa khoa học thực tiễn đề tài Đối tượng, phạm vi giới hạn luận án Những đóng góp luận án CHƯƠNG TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU .5 1.1 Giới thiệu chung tu hài 1.1.1 Vị trí phân loại học .5 1.1.2 Phân bố tự nhiên 1.1.3 Một số đặc điểm cấu tạo tu hài .6 1.1.4 Tình hình ni khai thác tu hài 1.2 Nghiên cứu chọn giống theo hướng tăng trưởng 14 1.2.1 Chọn lọc dựa kiểu hình 14 1.2.2 Chọn lọc theo kiểu gene 15 1.3 Chỉ thị phân tử ứng dụng nghiên cứu nhuyễn thể hai mảnh vỏ 16 1.3.1 Chỉ thị phân tử 16 1.3.2 Chỉ thị phân tử ứng dụng nghiên cứu phân loại 21 1.3.3 Chỉ thị phân tử ứng dụng nghiên cứuxây dựng mã vạch DNA số loài 22 1.3.4 Chỉ thị SNP ứng dụng nghiên cứu loài hai mảnh vỏ 27 1.3.5 Nghiên cứu giải trình tự hệ gene loài hai mảnh vỏ 28 1.4 Một số nghiên cứu di truyền phân tử tu hài 32 CHƯƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 35 2.1 Vật liệu nghiên cứu 35 2.2 Thời gian địa điểm nghiên cứu 35 2.3 Phương pháp nghiên cứu 36 2.3.1 Điều tra thành phần loài tu hài, trạng nghề nuôi tu hài Vân Đồn, tỉnh Quảng Ninh tiềm phát triển nghề nuôi tu hài 36 2.3.2 Phương pháp xây dựng mã vạch DNA cho tu hài L rhynchaena 38 2.3.3 Phương pháp giải trình tự tồn hệ gene tu hài L rhynchaena .39 2.3.4 Phương pháp giải trình tự hệ gene phiên mã tu hài L rhynchaena 40 2.3.5 Phương pháp phát triển thị SNP liên quan đến tính trạng tăng trưởng tu hài 41 2.3.6 Phương pháp phân tích, xử lý liệu 45 CHƯƠNG KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 53 3.1 Thành phần loài tu hài phân bố tự nhiên huyện Vân Đồn, trạng tiềm phát triển nghề nuôi tu hài huyện Vân Đồn, tỉnh Quảng Ninh 53 3.1.1 Khảo sát thành phần loài tu hài phân bố tự nhiên huyện Vân Đồn 53 3.1.2 Đánh giá trạng tiềm phát triển nghề nuôi tu hài huyện Vân Đồn .55 3.2 Xây dựng mã vạch DNA cho tu hài L rhynchaena 57 3.2.1 Khảo sát liệu để xây dựng mã vạch DNA vùng gen 16S rRNA, COI giống Lutraria hệ thống mã vạch quốc tế 57 3.2.2 Xây dựng phát sinh chủng loại cho loài tu hài .61 3.2.3 Xây dựng mã vạch DNA để nhận dạng tu hài L rhynchaena 64 3.3 Giải trình tự hệ gene hệ gene phiên mã tu hài L rhynchaena 69 3.3.1 Tách chiết tinh DNA .69 3.3.2 Thiết lập thư viện giải trình tự hệ gene hệ gene phiên mã tu hài 70 3.3.3 Ứơc lượng kích thước hệ gene tu hài 71 3.3.4 Lắp ráp hệ gene tu hài L rhynchaena 72 3.3.5 Ước lượng dị hợp tử, trình tự lặp lại tìm kiếm đa hình 74 3.3.6 Lắp ráp hệ gene phiên mã 75 3.3.7 Dự đoán thích hệ gene tu hài 75 3.3.8 So sánh đặc điểm hệ gene L rhynchaena với loài hai mảnh vỏ 76 3.4 Sàng lọc, tuyển chọn phát triển thị SNP liên quan đến tính trạng tăng trưởng tu hài .79 3.4.1 Giải trình tự ezRAD-Seq tu hài tăng trưởng nhanh tăng trưởng chậm 79 3.4.2 Xây dựng sở liệu, sàng lọc SNP nhóm tu hài tăng trưởng nhanh tăng trưởng chậm .84 3.4.3 Sàng lọc outlier loci nhóm tu hài tăng trưởng nhanh tăng trưởng chậm 86 3.4.4 Sàng lọc thị SNP tiềm tu hài tăng trưởng nhanh tăng trưởng chậm 87 3.4.5 Thiết kế mồi nhân đoạn trình tự chứa thị SNP tiềm sàng lọc nhóm tu hài tăng trưởng nhanh tăng trưởng chậm 93 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 96 CƠNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN ĐỀ TÀI LUẬN ÁN 98 TÀI LIỆU THAM KHẢO 99 PHỤ LỤC 1PL DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT Từ viết tắt Từ Tiếng Anh Nghĩa Tiếng Việt BAC Bacterial artificial chromosome bp Base pair BOLDS Barcode Of Life Data Systems Nhiễm sắc thể vi khuẩn nhân tạo Cặp base Hệ thống sở liệu mã vạch BUSCO Benchmarking Universal Single- sống Bộ trình tự tham chiếu BWA COI CS CSDL CSIRO Dam DNA ĐVTM EBV EST EzRAD FAO GWS Hi-C NCS NGS ONT PB PCR QTL RAPD Copy Orthologs Burrowr-Wheerler Alignment Tool Cytochrome C Oxidase subunit I Data base Commonwealth Scientific and Cơng cụ dóng hàng Vùng gene COI Cộng Cơ sở liệu Tổ chức nghiên cứu khoa học Industrial Research Organisation công nghiệp khối thịnh vượng DNA adenine methylase chung Enzyme metyl hóa Adenine Estimated Breeding Value Expressed Sequence Tag Enzyme Restriction-site Associated DNA Axid Đêoxyribônucleic, DNA Động vật thân mềm Giá trị chọn giống ước tính Đoạn trình tự biểu DNA liên kết vị trí enzym cắt DNA Food and Agriculture Organization Genome Wide Selection High-throughput chromosome hạn chế Tổ chức Nông lương giới Chọn lọc dựa toàn hệ gen Chụp cấu trúc nhiễm sắc thể conformation capture thông lượng cao Nghiên cứu sinh Giải trình tự hệ Công nghệ đọc dài Khoa học sinh học Thái Bình Acid Deoxyribonucleic Next Generation Sequencing Oxford Nanopore Technology Pacific Biosciences Dương Polymerase Chain Reaction Phản ứng chuỗi trùng hợp Quantitative Trait Loci Locus tính trạng số lượng Randomly Amplified Đa hình DNA khuếch đại ngẫu RNA RFLP Polymorphism DNA Ribonucleic Acid Restriction Fragment Length nhiên Acid Ribonucleic Đa hình độ dài đoạn cắt hạn chế SAM SD SNP SPB TSLR WGS Polymorphism Sequence Alignment/ Map Standard Deviation Single Nucleotide Polymorphism Sample Purification Beads TruSeq Synthetic Long Read Whole Genome Sequencing Dóng hàng trình tự/ đồ Độ lệch chuẩn Đa hình nucleotic đơn Hạt tinh mẫu Tổng hợp đọc dài TruSeq Giải trình tự tồn hệ gene DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1 Thành phần phản ứng PCR để khuếch đại thư viện EzRAD 41 Bảng 3.1 Thành phần loài tu hài phân bố huyện Vân Đồn 53 Bảng 3.2 Hiện trạng nghề nuôi tu hài (L rhynchaena) Vân Đồn năm 2019 55 Bảng 3.3 Mã số truy cập kích thước trình tự DNA gene 16S rRNA, COI loài giống Lutraria GenBank 58 Bảng 3.4 Mức độ tương đồng trình tự DNA vùng gene 16S rRNA tu hài L rhynchaena với trình tự DNA lồi tu hài công bố GenBank (%) 59 Bảng 3.5 Mức độ tương đồng trình tự DNA vùng gene COI tu hài L rhynchaena với trình tự gene COI lồi tu hài cơng bố GenBank (%) .60 Bảng 3.6 Các vị trí sai khác nucleotide trình tự vùng gene 16S rRNA (437 bp) loài tu hài nghiên cứu 65 Bảng 3.7 Các vị trí sai khác nucleotide trình tự vùng gene COI (615 bp) loài tu hài nghiên cứu 66 Bảng 3.8 Kết giải trình tự tồn hệ gene tu hài (L rhynchaena) 70 Bảng 3.9 Kết giải trình tự hệ gene phiên mã tu hài (L rhynchaena) 71 Bảng 3.10 Kết lắp ráp thích hệ gene tu hài 73 Bảng 3.11 Giá trị chọn giống ước tính cho tính trạng tăng trưởng hai nhóm tu hài 79 Bảng 3.12 Tóm tắt kết xử lý giải trình tự 82 Bảng 3.13 Thống kê SNP 12 gene liên quan tính trạng tăng trưởng tu hài 85 Bảng 3.14 Thông tin SNP sau sàng lọc nhóm tu hài tăng trưởng nhanh tăng trưởng chậm 86 Bảng 3.15 Kết xử lý liệu trình tự dựa hệ gene tham chiếu (dDocent Stacks) contig nhóm tu hài tăng trưởng nhanh tăng trưởng chậm 87 Bảng 3.16 Số lượng biến dị phát hai nhóm tu hài tăng trưởng nhanh, tăng trưởng chậm kiểu biến dị phân tử 90 Bảng 3.17 Thông tin SNP tiềm cho nhóm tu hài tăng trưởng nhanh 93 Bảng 3.18 Thơng tin SNP tiềm cho nhóm tu hài tăng trưởng chậm 93 Bảng 3.19 Thông tin cặp mồi SNP sản phẩm khuếch đại hai nhóm tu hài tăng trưởng nhanh tăng trưởng chậm .94 DANH MỤC HÌ Hình 1.1 Tu hài (Lutralia rhynchaena, Jonas 1844) thu Vân Đồn, Quảng Ninh Hình 1.2 Bản đồ thu mẫu mật độ tu hài phân bố huyện Vân Đồn, Quảng Ninh Hình 1.3 Tình hình khai thác thủy sản giới Hình 1.4 Quy trình tóm tắt xây dựng mã vạch DNA 24 Hình 1.5 Sơ đồ phát triển cơng nghệ giải trình tự gene 31 Hình 2.1 Màu nucleotide sở sử dụng hiển thị mã vạch DNA .39 Hình 2.2 Sơ đồ bước giải trình tự hệ gene từ mẫu mô tu hài L rhynchaena 39 Hình 2.3 Sơ đồ bước giải trình tự hệ gene phiên mã từ mơ tiêu hóa tu hài L rhynchaena 40 Hình 2.4 Sơ đồ bước giải trình tự RAD xác định thị phân tử SNP nhóm tu hài (L rhynchaena) tăng trưởng nhanh tăng trưởng chậm 42 Hình 2.5 Phản ứng Dam methyl hóa enzyme 43 Hình 2.6 Phản ứng Dam methyl hóa enzyme giới hạn MboI Sau3AI .43 Hình 2.7 Quy trình chọn lọc đoạn DNA có kích thước mục tiêu 44 Hình 2.8 Cấu trúc adapter sử dụng giải trình tự Illumina 44 Hình 2.9 Các bước tiến hành sàng lọc SNP theo qui trình Stacks 50 Hình 3.1 Hình dạng màu xi phông tu hài 54 Hình 3.2 Kết truy vấn trình tự gen 16S rRNA giống Lutraria cơng cụ Megablast 58 Hình 3.3 Kết MEGABLAST sử dụng trình tự truy vấn gene COI loài thuộc giống Lutraria 60 Hình 3.4a Mối quan hệ tiến hóa lồi Lutraria dựa vào phân tích trình tự gen 16S rRNA sử dụng thuật tốn ML chương trình MEGAX 61 Hình 3.4b Mối quan hệ tiến hóa lồi Lutraria dựa vào phân tích trình tự gene 16S rRNA sử dụng thuật tốn BI chương trình BEAST .62 Hình 3.5a Mối quan hệ tiến hóa lồi Lutraria dựa vào phân tích trình tự gene COI sử dụng thuật tốn ML chương trình MEGAX 63 Hình 3.5b Mối quan hệ tiến hóa lồi Lutraria dựa vào phân tích trình tự gene COI sử dụng thuật tốn BI chương trình BEAST 63 Hình 3.6 Trình tự mã vạch DNA vùng gene 16S rRNA mã QR L rhynchaena 66 Hình 3.7 Trình tự mã vạch DNA vùng gene COI mã QR L rhynchaena 69 Hình 3.8 DNA tổng số tách từ số mẫu màng áo tu hài gel điện di .70 Hình 3.9 Chỉ số k-mers (A) với k = 19, (B) với k = 21, (C) với k = 25 71 Hình 3.10 So sánh hệ gene tu hài (L rhynchaena) với lồi hai mảnh vỏ cơng bố (tính hồn chỉnh BUSCO, ước tính kích thước hệ gene so với lắp ráp nội dung lặp lại) .77 Hình 3.11 Kết điện di DNA tổng số mẫu tu hài tăng trưởng nhanh (giếng N1 – N5), tăng trưởng chậm (giếng C1-C5), giếng M: Marker (thang chuẩn DNA) 79 Hình 3.12A Kiểm tra chất lượng theo vị trí base liệu giải trình tự RAD-Seq tu hài tăng trưởng nhanh với trình tự đọc xi (A) 81 Hình 3.12B Kiểm tra chất lượng theo vị trí base liệu giải trình tự RAD-Seq tu hài tăng trưởng chậm với trình tự đọc ngược (B) 82 Hình 3.13 Phân bố contig tu hài tăng trưởng nhanh tăng trưởng chậm sau kết nối .83 Hình 3.14 Số lượng SNP nhóm tu hài tăng trưởng nhanh tăng trưởng chậm 84 Hình 3.15 Tỉ lệ định vị trình tự hai nhóm tu hài tăng trưởng nhanh tăng trưởng chậm lên hệ gene tham chiếu dDocent 88 Hình 3.16 Tỉ lệ định vị trình tự hai nhóm tu hài tăng trưởng nhanh tăng trưởng chậm lên hệ gene tham chiếu Stacks 88 Y