Quá trình sao chép and ở e coli

MỤC LỤC I GIỚI THIỆU VỀ CƠ CHẾ SAO CHÉP AND VÀ VI KHUẨN E.COLI 1.Giới thiệu AND E.coli .1 2.Thí nghiệm Meselson Stahl 3.Các yếu tố cần thiết cho chép ADN .3 4.Các ADN polymerase III QUÁ TRÌNH SAO CHÉP AND Ở E.COLI .5 Chạc ba chép Cấu trúc theta Enzym helicase Các protein khác tham gia chép 5.AND ligase .10 III CÂU HỔI LƯỢNG GIÁ 10 Tài iệu tham khảo .13 LỜI MỞ ĐẦU Quá trình sống điều khiển truyền thơng tin chi tiết xác ADN chứa tất thông tin cần thiết để xây dựng điều hành hoạt động thể, làm cho từ tế bào chưa chun hóa trở thành mơ quan, tế bào chuyên hóa tùy theo chức Sự truyền đạt thông tin di truyền diễn theo hai hướng Một thông tin ADN dùng để xây dựng tế bào điều khiển phản ứng sinh hóa Hai thơng tin nhân đôi chuyển vào tế bào con: tế bào dinh dưỡng tế bào sinh dục (tinh trùng trứng) Như thông tin làm cho sống nối tiếp đời sống sinh vật từ hệ sang hệ khác Ngày biết gen trình tự ADN mã hóa cho protein Các gen xếp thành hàng nhiều nhiễm sắc thể, tập hợp lại gọi gen (genome) Trong báo cáo này, giới thiệu AND, thí nghiệm E.coli trình chép ADN E.coli I GIỚI THIỆU VỀ CƠ CHẾ SAO CHÉP AND VÀ VI KHUẨN E.COLI Giới thiệu AND E.coli ADN vật chất di truyền cấp độ phân tử, việc truyền đạt thông tin di truyền ADN từ hệ tế bào mẹ sang tế bào thơng qua chế nhân đơi ADN Q trình nhân đơi ADN hay cịn q trình tái AND diễn nhân tế bào, pha S kỳ trung qian, trình tạo cromatit nhiễm sắc thể để chuẩn bị phân chia tế bào Q trình nhân đơi AND thực hiên theo ngun tắc nhân đơi:  Mơ hình bán bảo tồn: Vào đầu trình chép, hai mạch chuỗi xoắn kép tách rời nhau, mạch đơn dùng làm khuôn để tổng hợp mạch Kết phân từ ADN ban đầu tạo hai phân tử giống hệt nhau, phân tử hình thành từ mạch cũ mạch  Mơ hình bảo tồn: Hai mạch gốc trì bắt cặp trở lại sau tự chép.Một hai phân tử ADN phân tử ADN gốc, phân tử lại có vật liệu hồn tồn  Mơ hình phân tán: Phân tử ADN gốc bị cắt thành nhiều đoạn mạch đôi hoạt động dây tổng hợp đoạn mạch đôi Những đoạn mạch đôi hợp lại thành dây xoắn kép ADN hoàn chỉnh, với đoạn dây ADN dây gốc dây xen kẻ E.coli (Escherichia coli ) vi khuẩn nghiên cứu kĩ nhất, nhiều chủng khác phân lập Ba dòng thường gặp phịng thí nghiệm di truyền E.coli B (tế bào chủ cho phage dãy T), E.coli (tế bào chủ cho phage mạch φX 174) E.coli K12 (tế bào chủ phage λ) Do thuận tiện nuôi cấy, nhân giống, thu nhận đột biến dễ phân tích kiện di truyền hoi Ðến nay, coi đối tượng mơ hình số Sinh học phân tử công nghệ gen Các nghiên cứu E coli làm sở cho đời kỹ thuật di truyền E coli đóng vai trị chủ yếu chuyển gen đến sinh vật khác Nó sinh vật chuẩn để tạo dòng gen (cloning gens) sinh vật E coli coi tế bào vật chủ đơn giản công nghệ gen Vi khuẩn E coli dễ dàng chấp nhận nhiều loại vector chuyển gen plasmid hay phage qua biến nạp hay tải nạp Những protein tái tổ hợp insulin, xomatostatin đến hàng trăm protein khác tạo dòng E coli vào sản xuất công nghiệp với thị trường hàng chục tỷ USD/năm Những đóng góp cụ thể E-coli - Sao chép, phiên mã, dịch mã tái tổ hợp - Ðột biến - Ðiều hòa biểu gen (Gen regulation) - Kỹ thuật ADN tái tổ hợp (recmbinant ADN technology) - Ðóng góp cho nghiên cứu lĩnh vực khác: Trao đổi chất tế bào (Cell metabolism), gen ức chế vơ nghĩa (Nonsense suppressors), tuyến tính (Colinearity) gen polypeptit, Operon, kháng thuốc dựa vào plasmid (Plasmid- bazơd drug resistance) vận chuyển tích cực (Active transport Thí nghiệm Meselson Stahl Có nhiều thí nghiệm chứng minh ngun tắc nhân đơi ADN (đặc biệt nguyên tắc bán bảo toàn) thí nghiệm tiếng Meselson Stahl (1958) Nuôi E.coli nhiều hệ môi trường có nguồn nitơ đồng vị nặng N15 Như tất DNA vi khuẩn mang đồng vị nặng N15 thay cho N 14 bình thường Sau tế bào chuyển sang môi trường chứa N14 nhẹ, mẫu tế bào lấy theo khoảng thời gian đặn chiết tách DNA Bằng phương pháp ly tâm thang nồng độ CsCl, loại AND nặng, nhẹ,lai tách Kết cho thấy DNA nặng ban đầu (thế hệ 0) chứa N15, sau lần phân chia cho hệ I với DNA lai có tỷ trọng nằm DNA nặng N15 DNA nhẹ N14 Nói cách khác sau lần chép phân tử DNA chứa mang N15 N14 Ở hệ II số phân tử DNA lai, lại DNA nhẹ N14 Thí nghiệm khẳng định giả thuyết Watson Crick tức mạch DNA mẹ tách ra, làm khuôn để tổng hợp nên mạch bổ sung Các yếu tố cần thiết cho chép ADN Tất sinh vật đỏi hỏi yếu tố sau cho q trình chép: khn mẫu (phân tử ADN Ban đầu), Mg2+, loại desoxyribonucleotid triphosphat (dNTP) enzym ADN polymerase Tiến trình tóm tắt phường trình: Trong đó, dNTP desoxyribonucleotid triphosphat d(NMP)n polymer có n desoxyribonucleic 4.Các ADN polymerase ADN polymerase enzyme chủ yếu tái bản, chịu trách nhiệm tổng hợp hai chuỗi DNA chạc tái Có ba loại DNA polymerase khác nhau, ký hiệu I, II II Cơ chế vai trò enzyme DNA polymerase khác Do Kornberg phát hiEn năm 1955 DNA polymerase I cJa E coli mang chuKi polypeptide có khối lưLng phân tử 109.000 Da vNi ba hoạt tOnh riêng biEt NhiEm vQ chOnh cJa DNA polymerase I xRc tác cho trình lắp ráp dNTP tTng vào đầu 3’ tV cJa đoạn mWi gắn DNA khuôn mẫu Kết sLi DNA mNi sX dài dần phOa đầu 3’ (Hình 4.1) Hình 4.1 Các thành phần cần thiết cho sinh t[ng hLp DNA DNA polymerase I cJa E coli 5’ xRc tác cho sV thối hóa bậc thang tT đầu 3’ cJa DNA sLi đôi sLi đơn khơng có dNTPs Trong trường hLp có dNTPs, hoạt tOnh exonuclease sLi đôi sX bị ức chế hoạt tOnh polymerase Trong trình t[ng hLp DNA, hoạt tOnh exonuclease thVc hiEn chức đọc sửa cách cắt bỏ nucleotide lắp ráp sai Ngoài ra, enzyme cịn có hot tnh exonulease 5’→ 3’ xúc tác cho chuy!n ch" nucleotide t% đầu 5’ đi!m đ(t b+ sung t(c th,i nucleotide t% đầu 3’ to chuy!n đô ng đi!m đ(t d/c theo DNA.Ngồi ra, enzyme cịn có hot tnh exonulease → 3’ xúc tác cho chuy!n ch" nucleotide t% đầu 5’ đi!m đ(t b+ sung t(c th,i nucleotide t% đầu 3’ to chuy!n đô ng đi!m đ(t d/c theo DNA Khởi đầu, enzyme DNA polymerase I xem giữ vai trò chủ yếu trực tiếp tái DNA Nhưng sau đó, người ta quan sát thấy E coli đột biến khơng có DNA polymerase I mà có tái bản, phát DNA polymerase III giữ vai trò tái DNA Nghiên cứu tính chất so sánh ba loại enzyme người ta nhận thấy DNA polymerase III enzyme thực điều khiển tổng hợp DNA Trong DNA polymerase I có vai trị loại bỏ RNA mồi nhờ cắt đầu 5’→ 3’ thay vào chỗ RNA mồi DNA khác, DNA polymerase II chưa rõ tác dụng, có lẽ tham gia vào trình sửa chữa (thay đoạn DNA hỏng đoạn DNA bình thường) thay DNA polymerase I có khó khăn tổng hợp DNA U làm viê Uc, DNA polymerase khác Trong Về tTc đô giây, DNA polymerase I gắn 10 dNTP DNA polymerase II gắn 0,5 dNTP DNA polymerase III gắn tới 150 dNTP Recommandé pour toi 10 Suite du document ci-dessous Preparing Vocabulary FOR UNIT Led hiển thị 100% (2) Bảng 4.2: Đặc điểm cùa AND polymerase từ E.coi retrovirus Polymerase Khối lượng phân tử(Mr) Cấu trúc,đơn vị nhỏ(Mr) Hoạt tính polymer hóa 5` 3` Hoạt tính exonuclease 5` 3` 3` Vai trò 5` I 109.000 + + E.coli II 120.000 + - III 180.000 3:α,ε,θ + + 160.000 2:α,β + - + Sửa sai Chưa rõ + Tổng - chép Virus hợp ADN III QUÁ TRÌNH SAO CHÉP AND Ở E.COLI Chạc ba chép AND tế bào nhân ngun thủy có dạng vịng, xoắn kép Quá trình chép ADN thường bong bóng chép, chỗ phình khởi đầu tổng hợp ADN Các nút chép chạc ba chép Hình 1.1Chạc ba chép trình chép AND Đây trình theo hướng – chạc ba chép di chuyển theo hướng khí cịn lại cố định origin AND ty thể có dạng vịng có hai chạc ba chép Các sợi ADN tách sợi ADNcos hướng 3’→ 5’sẽ chép trực tiếp ADN polymerase III.Sợi bổ sung vừa tạo gọi sợi sớm (leading strADN) Sợi gốc cịn lại có hướng 5’→3’,khơng chép phần sợi gốc tháo xoắn.Bản gọi sợi muộn (lagging strADN) Sợi muộn tổng hợp q trình chép khơng liên tục Sự sinh tổng hợp sợi muộn sợi sớm điều hòa tạo nút thắt (loop) sợi muộn,nhờ sợi muộn tổng hợp hướng với sợi sớm.Việc chép không liên tục tạo đoạn ADN ngắn vào khoảng 1000-2000 nucleotid gọi đoạn Okazaki Các đoạn nối với ADN ligase để tạo sợi ADN liên tục Hình 1.2 Sự hình thành đoạn Okazaki sợi muộn ADN chép không liên tục sợi gốc Đoạn mồi ARN cần cho tổng hợp ADN.ADN polymerase địi hỏi đoạn ARN ngắn có đầu 3’-Oh tự để bắt đầu tổng hợp gắn deoxyribonucleotid vào mạch con,bổ sung với ADN khuôn Mỗi ARN tổng hợp enzym đặc biệt tên primase Chúng kéo dài khởi động chuỗi de nevo Primase nhận trình tự đặc hiệu ADN đơn Tự thân primase không hoạt động được,nó phải tạo phức hợp với vài chuỗi polypeptid để tạo thành primosome chức năng.Các trình tự ARN tạo primosome đoạn ngắn khoảng 5-10 base đặc hiệu Các protein nhận diện gọi Nprotein,chọn điểm (origi) ADN,tại primase hoạt động.Các đoạn mồi ARN bị ADN polymerase I loại khỏi chuỗi ADN Enzym đồng thời làm nhiệm vụ lấp đầy khoảng trống deoxyribonucleotid thích hợp việc loại mồi.Các đoạn ADN nối lại với ADN ligase tạo thành sợi ADN liên tục Cấu trúc theta Sự chép ADN vịng tạo cấu trúc theta,hình thành hai chạc ba chép xuất phát từ vị trí Origin Sự tổng hợp ADN tiến hành theo hai chiều thuận ngược kim đồng hồ lúc.Để tạo sợi đơn ADN,hai sợi ADN gốc phải vặn xoắn (quay) Cứ 10 base chép phân tử ADN phải vặn xuống vịng Chạc ba chép E.coli cần phải di chuyển với tốc độ 800 base/giây, đòi hỏi ADN gốc phải tháo xoắn với tốc độ 80 vòng/giây Sự tháo xoắn ADN gây tượng siêu xoắn (supercoiling) Hình 2.1 Sự hình thành cấu trúc theta chép hai hướng ADN kép Enzym helicase Um vụ giZp chuỗi DNA t[ dạng siêu xoắn sang Enzyme helicase có nhiê dạng d\n thành hai sợi đơn cách cắt liên kết hydrogen base bổ sung Dạng cấu trZc cần thiết cho đoạn chuỗi DNA mà có nhu cầu sinh tổng hợp Phản ứng cần có mặt ATP Có hai loại helicase khác nhau: Rep-protein gắn với AND gTc, trực tiếp tổng hợp sợi sớm di chuyển theo hướng 3’→ 5’ Helicase thức hai gắn với sợi khuôn để tổng hợp sợi muộn, enzym tạo phức hợp với primase để tạo mồi ARN Hình 3.1 Hoạt động enzyme helicase Các protein khác gia tham chép Các protein SSB liên k9t ph:i h;p v