Bài giảng các phương pháp thự c nghiệm nano sinh học phần nucleic acid và protein

  ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ  BÀI GIẢNG CÁC PHƯƠNG PHÁP THỰ C NGHIỆM NANO SINH HỌC Phần Nucleic acid Protein TS Lê Thị Hiên TS Hà Thị Quyến Dành cho sinh viên chuyên ngành Công ngh ệ nano sinh học   Hà Nội –  2014   MỤC LỤC Trang Chương Giới thiệu trang thiết bị, hóa chất phịng thí nghiệm Cơng nghệ nano sinh học ………………………………………………………….  1.1 Một số trang thiết bị phòng thí nghiệm Cơng nghệ nano sinh học…   1.2 Các hóa chất đặc thù dung dịch đệm phịng thí nghi ệm Cơng nghệ  nano sinh học………………… Chương Một số   phương pháp nghiên cứu v ề  nucleic acid……………………   12 2.1 Tách chiế t DNA từ mẫu sinh học 13 2.2 Tách DNA từ mẫu sinh học sử dụng vật liệu nano…………………………   23 2.3 Tách chiế t RNA từ các mẫu sinh học 27 2.4 Điện di DNA gel agarose 30 2.5 Khuếch đại DNA phương pháp PCR   36 2.6 Thiế t kế  m ồi cho phản ứng PCR 43 2.7 Phương pháp cắt đặc hiệu DNA sử dụng enzyme hạn chế   48 2.8 Xác định nồng độ DNA máy đo phổ hấp thụ nhỏ giọt Nanodrop   52 Chương Một số  phương pháp nghiên cứu v ề protein   56 3.1 Tách chiết protein từ mẫu sinh học   56 3.2 Các phương pháp tinh protein…………………………………………   60 3.2.1 Phương pháp sắc ký lỏng……………………………………………………   60 3.2.2 Tinh protein hạt từ chức năng…………………………………… 63 3.3 Xác định nồng độ protein phương pháp phổ hấp thụ vùng khả 66 kiến tử ngoại 3.4 Điện di biế n tính protein gel polyacrylamide (SDS-PAGE) 69 Chương Phương pháp tạ o phức hợp hạt nano với phân tử sinh học   74 4.1 Phương pháp tạo phức hợp hạt nano với nucleic acid 74 4.2 Phương pháp tạo phức hợp hạt nano với protein 79     Bảng chữ, ký hiệu viế t tắt Từ viế t tắt Viết đầy đủ  BS3 Bis [Sulfosuccinimidyl] suberate BSA Bovine serum albumin (Albumin huyết bò)   DMSO Dimethyl sulfoxide DSS Disuccinimidyl suberate DTT Dithiothreitol EDC 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminipropyl) carbodiimide EtBr Ethidium bromide MES (2(N-Morpholino)ethanesulfonic acid) MIA N-methyl-imidazole NHS N-hydroxysuccinimide (NHS) ester PCR Polymerase chain reaction (Phản ứng chuỗi trùng hợp)   RE Restriction enzyme (enzyme h ạn chế ) SDS Sodium dodecyl sulfate PAGE Sulfo-NHS   Polyacrylamide gel electrophoresis (điệ n di gel polyacrylamide) Sulfo-N-hydroxysuccinimide (NHS) ester Sulfo-SMCC Sulfosuccinimidyl-4-(N-maleimidomethyl)cyclohexane-1carboxylate UV Ultraviolet (t ử ngoại)     Chương Giới thiệu trang thiết bị, hóa chất phịng thí nghiệm cơng nghệ nano sinh học  1.1 MỘT SỐ TRANG THIẾT BỊ TRONG PHỊNG THÍ NGHIỆM CÔNG NGHỆ NANO SINH HỌC  1.1.1 Hệ thống tủ lạnh Đây nhóm máy khơng thể thiếu cho phịng thí nghiệm sinh học phân tử, cơng nghệ nano sinh học Tuỳ thuộc vào yêu cầu sử dụng mà người ta sử dụng máy làm lạnh khác Tủ mát:  Nhiệt độ từ oC đến 8oC Bảo quản: Các mẫu DNA protein thời gian ngắn, mẫu vi khuẩn nuôi đĩa thạch số dung dịch đệm   Tủ lạnh: Nhiệt độ từ -25oC đến -10oC Bảo quản: Các mẫu vi khuẩn thời gian khoảng tháng; mẫu protein, enzyme; hóa chất chạy PCR, hoá chất yêu cầu điều kiện bảo quản từ -10oC đến -25oC Tủ lạnh sâu: Nhiệt độ từ -85oC đến -30oC Bảo quản: Các chủng vi khuẩn lâu dài; enzyme , protein hóa chất đặc biệt.  Máy làm đá (Hình 1.1) lấy đá dăm để giữ lạnh mẫu q trình làm thí nghiệm.  1.1.2 Thiế t bị lọc nước (Hình 1.2) Thiế t bị dùng để  lọc nước sử dụng thí nghi ệm hóa sinh sinh học phân tử Hệ thố ng bao g ồm cột lọc: Cột lọc học (lọc sơ bộ), cột lọc cacbon hoạt tính, cột lọc thẩ m thấu ngược RO Hệ  thống tích hợp thiế t bị  khử  ion hòa tan nướ c (cột anion cation) Nước qua hệ  thống nước cấ t, khử ion sử dụng thí nghi ệm sinh học phân tử, công nghệ nano sinh học hóa sinh 1.1.3 Cân phân tích Là thiết bị sử dụng để cân khối lượng xác mẫu vật hóa chất Tuỳ thuộc vào khối lượng mẫu hóa chất mức độ sai số cho phép mà người ta chia cân phân tích thành nhóm: Cân phân tích thường cân phân tích đặc biệt     Cân phân tích thường   sử dụng để cân với lượng tương đối lớn (có thể đến 2000g) độ xác khơng cao, sai số khoảng 10 -2g Cân phân tích đặc biệt  (Hình 1.3) sử dụng để cân với lượng nhỏ (~200g) với độ xác khoảng từ 10 -3g đến 10-6g (Độ xác: ±10-4 g, độ lặp lại: ± 10-4 g) Hình 1.1. Máy làm đá dăm  Hình 1.2 Thiết bị lọc nước Hình 1.3. Cân phân tích 1.1.4 Máy đo pH (Hình 1.13) Thiết bị sử dụng để xác định xác giá trị pH dung dịch, giá trị quan trọng dung dịch đệm thí nghiệm sinh học   Khi sử dụng máy đo pH phải rửa đầu đo nước cất, sau chuẩn máy  bằng dung dịch chuẩn nhà cung cấp Sau sử dụng xong phải rửa đầu đo nước cất ngâm ngập điện cực dung dịch bảo quản tương ứng nhà cung cấp, thông thường dung dịch KCl 3M   1.1.5 Nhóm thiết bị rung, lắc  (Hình 1.4) Đây nhóm thiết bị dùng để trộn chất môi trường lỏng Máy lắc trịn có giá cài gắn với hệ thống lắc điều chỉnh tốc độ Một số máy lắc đặt hệ thống giữ ổn định nhiệt độ   (máy gia nhiệt có lắc) , loại thường dùng nuôi cấy vi khuẩn, tế bào động, thực vật   Máy lắc xoáy (vortex)  dùng để rung lắc ống nghiệm   Máy khuấy từ: Máy tạo lực từ xoay trịn, nhờ cho từ (thanh nam châm) vào dung dịch, dung dịch trộn Một số máy khuấy từ trang bị hệ thống gia nhiệt nhờ trình hịa tan chất nhanh hơn.      b  a  d  c  Hình 1.4. Các thiết bị rung, lắc (a) Máy lắc trịn (b) Máy gia nhiệt có lắc (c) Máy lắc xoáy (d) Máy khuấy từ.  1.1.6 Nhóm thiết bị ổn nhiệt  Nhóm bao gồm thiết bị tạo giữ cho nhiệt độ buồng máy ln ổn định điều kiện cài đặt Có thể giữ nhiệt ổn định nước (water bath) khơng khí (incubator) Máy gia nhiệt có lắc gia nhiệt cho ống nghiệm nhỏ, kết hợp với hệ thống lắc trịn.  Lị lai phân tử (Hình 1.5) trang bị thêm hệ thống rotor để quay chai thủy tinh có chứa màng lai dung dịch 1.1.7 Các loại máy li tâm Máy li tâm sử dụng để phân tách thành phần dung dịch dựa vào khác khối lượng riêng nhờ tác dụng lực li tâm Có thể cài đặt tốc độ quay rotor thời gian quay Tốc độ quay đo số vịng/phút Mỗi máy có tốc độ quay tối đa xác định   Máy li tâm loại nhỏ (Hình 1.6) dùng để li tâm ống nghiệm 1,5ml với tốc độ tối đa 14000 vịng/phút Máy li tâm loại trung loại lớn (Hình 1.7) máy li tâm lạnh để giữ cho mẫu khỏi biến tính li tâm Các máy li tâm cho phép sử dụng ống li tâm 500ml hay ống nhỏ 25ml, 50ml với adapter phù hợp Một điểm cần lưu ý ngồi thơng số tốc độ quay RPM tính vịng/phút người ta thường quan tâm đến thông số lực li tâm RCF (cho thấy lực li tâm lớn      bao lần lực hút trái đất (g=9,8m/s2)), tốc độ quay bán kính rotor lớn lực li tâm lớn.  Cơng thức chuyển đổi từ vòng/phút sang lực li tâm sau:   Trong đó: RPM − tốc độ quay (số vịng/phút)   RCF − lực li tâm (bao nhiêu g) r − khoảng cách xuyên tâm từ tr ục quay đến điể m xa nhấ t (tính ở  đáy ống ly tâm) đo theo đườ ng nằm ngang (mm) Nguyên tắc sử dụng máy li tâm ph ải đặt mẫu li tâm đố i xứng qua tâm mẫu phải có khối lượng Khi li tâm ở tốc độ cao c ần cân xác mẫu cân phân tích Hình 1.5. Lị lai phân tử  Hình 1.6. Máy li tâm lo ại nhỏ  Hình 1.7. Máy li tâm loại to 1.1.8 Tủ hút Đây hệ thố ng bao g ồm tủ có kính chắn máy hút Những hóa chấ t dễ   bay độc hại c ần phải thao tác t ủ hút nhằm giữ an toàn cho người sử  dụng người xung quanh Khí độ c sau hút h ấ p ph ụ b ởi m ột màng lọc chứa chấ t kh ử  độc trước thải Khi s ử d ụng c ần b ật đèn, hệ th ố ng hút kéo cửa kính chắn thấp mặt người thao tác 1.1.9 Buồng cấy vô trùng Cho phép người sử dụng thực thao tác như: phân lập vi khuẩn, nấm,  bào tử, nuôi cấy mô tế bào… điều kiện vô trùng Buồng cấy vô trùng trang bị màng để hút, lọc khơng khí với kích thước lỗ khác để lọc vi khuẩn, virus Tủ được thiế t kế  đặc biệt với áp suấ t âm, với dịng khí vơ trùng th ổ i thẳng đứng, bảo vệ cho người thao tác sản phẩ m nuôi cấ y Hơn nữa, buồng cấy vô trùng trang bị đèn tử ngoại (UV) để  tiệt trùng cho phép vô trùng kh ỏi vi sinh v ật , đèn chiếu sáng phụ kiện cho việc sử dụng khí để khử trùng     Cần bật đèn UV trước thao tác 10 phút, sau tắt đèn UV, bật đèn chiếu sáng, bật hệ thống thổi khí, đeo găng tay lau mặt buồng cấy chất khử trùng Sau sử dụng cần lau buồng cấy chất khử trùng tắt hệ thống tủ cấy   1.1.10 Nồi khử trùng (Hình 1.8) Khử trùng ướt là thiết bị sử dụng để khử trùng môi trường nuôi cấy, vi khuẩn, nấm, mầm bệnh dụng cụ cần vô trùng sử dụng Thiết bị hoạt động dựa sở khử trùng nước nhiệt độ áp suất cao Thông thường 120oC − 130oC 30 phút Loại khử trùng nhanh, tiết kiệm điện tiêu diệt hầu hết bào tử, sử dụng nhiều   1.1.11 Máy PCR Máy PCR  máy điều nhiệt tuần hoàn (máy gia nhiệt theo chu trình) Người sử dụng cài đặt chu trình nhiệt với bước với nhiệt độ thời gian khác Thiết bị sử dụng để khuếch đại số lượng lớn lượng nhỏ phân tử DNA in vitro dựa nguyên lý trình chép DNA Hiện có nhiều loại máy PCR bao gồm:   Máy PCR thường: Người sử dụng cài đặt chương trình cho lần chạy.  Máy PCR gradient (Hình 1.9) : Người sử dụng cài đặt nhiều chương trình khác cho hàng giếng máy Loại máy thường dùng để tìm điều kiện tối ưu cho phản ứng PCR mẫu DNA định.  Hình 1.8. Nồi khử trùng  Hình 1.9. Máy PCR 1.1.12 Máy quang phổ •  Máy quang phổ hấp thụ vùng khả kiến cực tím     Thiết bị ghi phổ hấp thụ vùng cực tím ánh sáng nhìn thấy dung dịch có chứa chất hấp thụ ánh sáng DNA protein hấp thụ cực đại  bước sóng tương ứng 260nm 280nm, nên dựa vào phổ hấp thụ ghi xác định hàm lượng DNA protein. Máy quang phổ sử dụng cuvet : Dung dịch đo chứa cuvet làm thạch anh đo thể tích tối thiểu 1ml  Máy quang phổ nhỏ giọt Nanodrop: dung dịch đo nhỏ trực tiếp lên vị trí đo với thể tích ti thiu l 1àl. ã Mỏy quang ph hunh quang Thiết bị ghi phổ huỳnh quang dung dịch phát huỳnh quang Thiết  bị cho phép nghiên cứu phân tử sinh học (DNA protein) gắn chất huỳnh quang hữu hạt nano phát quang (silica, chấm lượng tử) 1.1.13 Hệ thống điện di Máy điện di sử dụng để phân tách riêng thành phần hỗn hợp dựa vào khác kích thước, khối lượng, điện tích… tác dụng lực điện trường Thông thường người ta sử dụng để tách thành phần DNA, protein Thiế t bị bao g ồm ngu ồn cung cấp dòng điệ n chi ều ổn định xác, ệ ống điện di phụ kiện kèm. Thiế t bị điện di DNA (xem hình 2.6) Thiế t h  th  bị điện di protein (hình 3.7) 1.1.14 Thiế t bị soi gel, ch ụp ảnh gel Thiế t bị soi gel g ồm hệ thống đèn UV, cho phé p nhìn thấy băng DNA gel sau gel đượ c nhuộm chấ t nhuộm phát quang ethidium bromide   Thiế t b ị chụp ảnh gel là m ột h ệ thố ng bao g ồm đèn chiế u tia tử ngoại, ánh sáng trắng, hình hi ể n thị và máy in ảnh Máy cho phép nhìn thấy băng Hình 1.10. Thiết bị soi gel Hình 1.11. Thiết bị chụp ảnh gel     DNA gel sau gel đượ c nhuộm chấ t nhuộm phát quang ethidium  bromide băng protein chụp ảnh điện di DNA protein 1.1.15 Các dụng cụ hút dung dịch Ngoài thi ế t bị hút đo dung dịch thông thường như: ống đong, cốc đong, loại pipet (hút 1ml-25ml), ố ng hút thủy tinh có vạch mức, phịng thí nghi ệm sinh học phân tử s ử d ụng dụng c ụ hút dung dịch đặc biệt v ới độ chính xác từ  1µl (10-6 ml) đế n 1ml Các dụng cụ này gọi pipetman Có nhiều loại pipetman, tùy thuộc vào ngưỡng thể tích mà người ta chia thành loại sau: Pipet 1000−5000l, pipet 100 −1000l, pipet 10 −100l, pipet 2−20l, pipet 0,5−10l Lưu ý sử dụng pipetman: Pipetman dụng cụ hút xác đắt tiền Bất kỳ pipetman có giới hạn hút xác sử dụng pipetman để hút thể tích chất lỏng tương ứng với thể tích ghi nhãn Khơng điều chỉnh thể tích vượt ngưỡng cho phép.Trong trường hợp không ngửa phần đầu hút pipet lên để tránh chất lỏng chảy ngược vào piston pipetman   Hình 1.12. Các loại pipet  1.1.16 Các loại ống nghiệm  - Các falcon: 50ml, 15ml - Các ống nghiệm: ml, 1,5 ml, 600 µl 1.2 Các hóa chất đặc thù dung dịch đệm phịng thí nghiệm  C ơng nghệ nano sinh học  1.2.1 Các hóa chất đặc thù  - Dung dịch hạt nano vàng, nano bạc, nano từ tính, chấm lượng tử.  - Các hóa chất sử dụng để tách chiết DNA, RNA protein từ đối tượng thực vật, động vật vi sinh vật       SDS, DTT nhiệt độ cao, từ cho phép phân tích định lượng định tính protein Gel polyacrylamide g ồm lớp gel (lớp gel tách ở bên lớp gel cô ở bên trên), tạo thành s ự  polymer hóa đơn phân tử  acrylamide Q trình polymer hóa xúc tác ammoniumpersulfate (APS), N,N,N’,N’ - tetremethylethylenediamine (TEMED) Kích thước lỗ gel phụ thuộc vào chiều dài chuỗi polymer mức độ polymer hóa, tức phụ thuộc vào nồng độ acrylamide Nếu nồng độ gel thấp tạo lỗ gel lớn, cho phép phân tách c ác phân tử sinh học có kích thước lớn Nếu nồng độ gel cao tạo lô gel nhỏ, cho phép phân tách phân tử sinh học có kích thước nhỏ   Acrylamide độc tố thần kinh mạnh, hít phải làm mê mệt Nó có khả thấm qua da tiếp xúc trực tiếp Hiệu độc tố tích tụ dần Vì thực làm thí nghiệp với acrylamide nên đeo trang găng tay Tuy nhiên dạng polymer hóa thành polyacrylamide lại khơng độc Nhưng tiếp xúc trực tiếp với nên mang găng tay bảo vệ cịn lượng nhỏ acrylamide chưa polymer hóa.  SDS (Sodium Dodecyl Sulfate) ch ấ t hoạt động b ề mặt có g ố c sunphat mang điện tích âm Dodecyl dài kị nước Đi kị nước SDS có khả năng liên kế t v ới ph ần kị nước phân tử protein làm bi ế n tính protein, gốc sunphat làm cho protein mang điện tích âm Trướ c tra protein vào gi ế ng protein đun nóng nhanh (khoả ng 95oC đế n phút) với sự có mặt tác nhân khử  c ầu nố i disulfite (S –S) dithiothreitol (DTT) 2mercaptoethanol (BME) để  làm biế n tính hồn tồn protein [Gallagher] Sau bị biế n tính hồn tồn c ấ u trúc bậc hai, bậc ba, bậc bố n protein  bị phá vỡ , protein trở thành chuỗi polypeptide mang di ện tích âm (Hình 1) Do đó, phân tử protein chuy ển động t ừ c ực âm (-) sang c ực dương (+) dước tác dụng điện trường Quá trình di chuy ể n phân tử protein phụ thuộc vào hai yế u t ố  là khối lượng phân tử protein n ồng độ  các chất gel (kích thướ c l ỗ  gel) Protein có khối lượng phân tử lớn sẽ di chuyể n chậm protein có khối lượ ng phân tử nhỏ Để  đưa protein mẫ u v ề cùng vạch xuất phát đồng thời tạo sự phân tách t ốt người ta thường sử dụng phương pháp điện di không liên t ục (discontinuous gel) g ồm lớp gel cô gel tách Gel cô (stacking gel): Nồng độ thấp khoảng 4–5%, nằm phía nơi tạo giếng tra mẫu Dưới tác dụng điện trường protein mẫu di chuyển vào gel cô chúng dồn lại thành lớp băng mỏng phía bên lớp gel tách, trình phân tách protein gel tốt  [Westermeier] Gel tách (separating gel): Lớp gel có nồng độ cao gel nằm phía Nó có tác dụng phân tách protein có khối lượng phân tử khác chạy gel Nồng độ gel tách phụ thuộc vào khối lượng phân tử protein cần phân tách Nồng độ gel lớn (lỗ gel nhỏ) phân tách phân tử protein nhỏ khả phân tách lớn Tuy nhiên thời gian chạy gel dài 70     Gel 5% acrylamide phân tách protein có phân tử lượng từ 60 đến 200 kDa, 10% phân tách từ 16 đến 70 kDa, 15% phân tách từ 12 đến 45 kDa   [Westermeier] Hình 3.6 Mơ hình cấu trúc phân t ử protein trước sau bi ến tính b ởi SDS Các protein sau bi ến tính tra vào giếng gel Dưới tác dụng điện trường protein tích điện âm dịch chuyể n qua lỗ  gel từ  cực âm sang c ực dương Các protein nhỏ  sẽ dễ dàng qua lỗ của gel nên di chuy ển nhanh hơn, protein l ớn sẽ g ặp khó khăn nên di chuyể n chậm Sau thời gian (tùy thu ộc điện áp sử  dụng, điện áp cao protein ch ạy nhanh sẽ  cho độ phân giải hơn), protein sẽ có sự d ịch chuyể n khác dựa vào kích thước chúng Vì thế  , protein có thể  được phân tách theo kh ối lượng phân tử Trong trình điện di, người ta thườ ng s ử d ụng thang protein chuẩ n (h ỗn hợp protein biết trướ c khối lượng phân tử) để  chạy đường riêng biệt gel D ựa vào thang chuẩ n này, có th ể   xác định khối lượng protein c ần phân tích cách so sánh v ị  trí tương đố i protein v ới thang protein chuẩ n Sau điện di, gel nhuộm b ằng chấ t nhuộm (phổ  bi ế n nh ấ t Coomassie Brilliant Blue ho ặc thuố c nhuộm bạc), cho phép quan sát protein đượ c phân tách gel, sử dụng tiế p kỹ thuật khác Western blot Sau nhuộm, protein khác s ẽ xuấ t ở các băng phân biệt gel Thiế t bị  điện di protein gel polyacrylamide bao g ồm: (1) Tấ m kính; (2) Khung đổ  gel; (3) Giá đổ  gel; (4) Lược để  t ạo giếng; (5) Thanh đệm; (6) Bể   điện di; (7) Ngu ồn điện di Thực hành  Mục đích  Sinh viên hiểu nguyên lý th ực kỹ thuật điện di protein SDS-PAGE Dựa vào kế t qu ả  điện di sinh viên xác định đượ c kh ối lượng phân tử  protein đánh giá định tính độ  sạch protein 71     Hình 3.7. Thiết bị điện di gel polyacrylamide Hóa chấ t Acrylamide 30% Tris-HCl 1,5M, pH 8,8 Tris-HCl 0,5M, pH 6,8 SDS 10% APS 10% TEMED Đệm tra mẫu (0,125 M Tris HCl; 4% SDS; 20% v/v Glycerol; 0,2 M DTT; 0,02 Bromophenol Blue; pH 6,8) Thang protein chu ẩ n (Protein marker) (Biobasic) Dung dịch chạy điện di (25mM Tris, 192 mM Glycine, 0,1% SDS, pH 8,3) Dung dịch nhuộm gel (0,025% Coomassie Brillant Blue R250; 40% methanol; 7% acetic acid).  Thiế t bị  Bộ  điện di protein (Bio-Rad) Cân phân tích (GR-200, AND) Lị vi sóng (Electrolux) Máy đo pH để   bàn (Sension3, HACH) Máy kh ử  ion nước hai l ần (Water Pro RO, M ỹ) Máy li tâm lo ại nhỏ  MIKRO 120 (Hettich zentrifugen, Germany) Tủ lạnh 40C (SANAKY) Tủ lạnh -400C (Biomedical freezer, SANYO) Thí nghiệ m - Lắp khn gel: Rửa hai phiế n kính tạo khn gel để  khơ khơng khí Lắp đặt hai phiến kính lên giá đỡ để  tạo khuôn cho gel - Chuẩn bị gel polyacrylamide: Chuẩn bị gel tách (separating gel) nồng độ 12% gel cô (stacking gel) nồng độ 5% với thành phần bảng 3.1 Gel tách chuẩn bị trước nằm bên gel   Lưu ý: TEMED APS tác nhân khơi mào cho trình polyme hóa nên chỉ được bổ  sung vào dung dịch trước đổ  gel tách gel cô   Sau đổ dung dịch tạo gel tách vào khuôn gel, đổ thêm lớp nước mỏng lên bề mặt gel để làm phẳng bề mặt Khi dung dịch đông lại thành gel loại  bỏ lớp nước bên bề mặt gel tách Đổ dung dịch tạo gel cô vào khuôn gel, đồng thời cài lược vào khuôn để tạo giếng tra mẫu điện di Sau gel cô đông, lắp khuôn gel vào bể điện di đổ dung dịch chạy điện di vào bể Tháo bỏ lược khỏi gel rửa giếng cách bơm dung dịch đệm vào giếng để bọt khí mảnh gel thừa thoát khỏi giếng   72     B ảng 3.1 Thành ph ần gel tách gel cô Thành ph ần Gel tách 12% Gel cô 5% H2O 1,32ml 1,05ml Tris-HCl 0,5M pH 6,8 Khơng 190µl Tris-HCl 1,5M pH 8,8 1ml Khơng 10% SDS 40µl 15µl 30% Acylamide 1,6ml 250µl TEMED 4µl 4µl 10% APS 40µl 20µl Tổ ng 4ml 1,5ml - Chuẩ n bị mẫu protein để  điện di: Trộn mẫu protein có n ồng độ thích hợp với dung dịch đệm tra mẫu biế n tính ở 95oC từ 3 đến phút Để  có thể  quan sát băng protein sau nhuộ m gel chấ t nhuộm Coomassie Brillant Blue c ần tra tố i thiể u 0,5 µg protein - Điện di: Tra m ẫu protein vào gi ếng Đặt điện thế   200-220V cường độ  dòng điện 30-35mA, th ời gian 50 phút Nh ấn nút RUN để  bắt đầu trình điệ n di Khi chấ t chỉ thị màu Bromphenol blue m ẫu chạy đến mép dướ i gel dừng điện di.  - Nhuộm gel chấ t nhuộm Coomassie Brillant Blue: L ấ y gel kh ỏi thiế t  bị điện di ngâm vào nước ấ m khoảng vài phút Thay nước l ần Ngâm gel dung dịch thuố c nhuộm Coomassie Brillant Blue đặt máy lắc tròn khoảng 2-4 Sau lấy gel ngâm vào nước đặ t máy l ắc tròn, thay nướ c nhi ều l ần cho đế n rõ băng protein màu xanh nề n gel su ố t Chụp ảnh lưu lại kế t Tính tốn Mẫu A g ồm 20µl dịch tan có protein n ồng độ 0,25mg/ml Tính lượng thể  tích c ần lấy để  có 2µg protein t ừ mẫu A đem điện di? Dung dịch đệm tra mẫu 2x c ần lấ y bao nhiêu? Dựa vào kế t quả ch ạy gel điện di, xác đị nh khối lượng phân tử  proten m ẫu thí nghiệm Câu hỏi i.  Nguyên lý sự phân tách protein b ằng phương pháp điện di gel polyacrylamide sử dụng chấ t biế n tính SDS? ii.  Thang chuẩ n protein gì? T ại điện di c ần chạy kèm thang chu ẩ n protein? iii.  Bằng cách có thể  quan sát protein gel? 73     Chương Phương pháp tạo phức hợp hạt nano với phân tử sinh học 4.1 PHƯƠNG PHÁP TẠO PHỨC HỢP HẠT NANO VỚI NUCLEIC ACID Hạt nano nghiên cứu, ứng dụng ngày r ộng rãi lĩnh vự c sinh học y sinh Các hạt nano vàng, nano b ạc, chấm lượng tử hay hạt nano t ừ đều có  bản chất vơ Do đó, để  có thể  ứng dụng lĩnh vực khoa học sự số ng y sinh c ần phải chức hóa hạt nano phân tử sinh học mà điể n hình nhấ t nucleic acid protein Nói cách khác, c ần phải gắn kế t hạt nano với phân tử sinh học để  tạo thành phức hợp hạt nano – phân tử sinh học Đây lĩnh vực rấ t quan trọng công ngh ệ nano sinh học Quá trình t ạo phức hợp hạt nano–phân tử sinh học c ần thỏa mãn điều kiện sau [Patent]: -  Không ảnh hưởng đế n hoạt tính sinh học phân tử sinh học sau g ắn kế t Các phân t ử sinh học t ồn t ại môi trườ ng sinh lý, v ậy q trình gắn kết phải diễn môi trường nướ c g ần với điều kiện sinh lý -  Ít ảnh hưởng đế n tính chấ t hạt nano (tính chấ t quang hạt vàng, chấm lượng tử hay tính chấ t từ của hạt nano từ) -  Phức hợp tạo b ền điều kiện sinh lý Cho đến có nhiều phương pháp gắ n hạt nano với nucleic acid nghiên cứu phát tri ể n Tùy thuộc chấ t hạt nano m ục đích ứng dụng mà lựa chọn phương pháp phù hợ p 4.1.1 Phương pháp hấ p phụ  Người ta thường s ử dụng DNA có nhóm thiol ( –SH) ở  đầu 3’ 5’ để   gắn với hạt nano vàng chấm lượng tử Do nhóm thiol có l ực mạnh với vàng nhóm photphat s ợi DNA mang điện tích âm đẩ y nên s ợi DNAthiol sẽ tạo đơn lớp b ề mặt hạt nano vàng (Hình 4.1) Lưu ý DNA ngun thể  khơng có nhóm thiol DNA có nhóm thiol DNA bi ến đổi gắn thêm nhóm thiol vào đầu 3’ 5’.  Nhóm thiol (SH) dễ  bị  oxi hóa b ởi oxi khơng khí để   tạo thành c ầu đisunphit S–S, nhóm khơng có l ực với hạt nano vàng (Hình 4.2) Chính vậy, trước tạo phức hợp với hạt nano vàng c ần thực khử c ầu đisunphit S–S thành nhóm thiol b ằng DTT (Dithiothreitol) sau tinh sạ ch DNA–thiol tạo thành cột sắc kí Q trình t ạo phức thực khoảng 18h Phức hợp hạt vàng–DNA thu cách ly tâm r ửa nhi ều l ần dung dịch đệm thích hợp 74     Hình 4.1. Phức hợp hạt nano v ới DNA có nhóm thiol   Hình 4.2. Sự oxi hóa thiol thành c u đisunphit (a) sự khử cầu đisunphit thành thiol (b)  4.1.2 Phương pháp sinh họ c sử dụng liên kết đặc hiệu Streptavidin biotin   Protein Streptavidin có l ực siêu mạnh với phân tử hữu biotin (hay cịn có tên gọi khác vitamin H) (Hình 4.3) Liên k ế t m ột liên kế t không cộng hóa trị mạnh biết đế n tự nhiên Phức hợp Streptavidin – biotin tạo thành rấ t b ền k ể  cả trong dung môi h ữu cơ, chấ t hoạt động b ề mặt, ở nhiệt độ cao pH kh ắc nghiệt Chính phức hợp dùng rấ t rộng rãi sinh học phân tử và công nghệ nano sinh h ọc để  làm c ầu nố i gắn phân tử sinh học với vật liệu vô   Hình 4.3 Cơng thức cấu tạo phân tử biotin Hình 4.4 Phức h ợp h ạt nano gắn v ới DNA nhờ liên kết giữ Streptavidin biotin   Thông thường, hạt nano chức hóa Streptavidin (s ản phẩ m thương mại), cịn DNA đượ c g ắn biotin Các đoạn DNA ngắn g ắn biotin  bằng cách tổ ng h ợp máy t ổ ng h ợp DNA sử d ụng nucleotit đính biotin, DNA dài gắn biotin kỹ thuật PCR sử dụng m ồi có đính biotin (sản phẩm thương mại) Trong dung dịch đệm thích hợp Streptavidin liên k ết đặc hiệu v ới biotin làm c ầu nố i sinh học gắn hạt nano với DNA (Hình 4.4) Vì liên k ế t Streptavidin–biotin có độ b ền cao nên phức hợp t ạo thành rấ t b ền điều kiện sinh lý [Patent] Hạt t ừ b ọc Streptavidin thường đượ c ứng d ụng để   tinh đặc hi ệu DNA, hạt vàng chấm lượng t ử bọc Streptavidin đượ c sử dụng để   đánh dấ u 75     sinh học cho ứng d ụng chẩn đốn phân tử [Dynabeads® MyOne™ Carboxylic Acid] 4.1.3 Phương pháp hóa họ c  Hai phương pháp trình bày ở mục 1.1 1.2 th ực tương đối đơn giản Tuy nhiên phương pháp 1.1  có thể  thực với hạt nano có l ực mạnh với nhóm thiol hạt vàng chấm lượng tử Đố i với phương pháp 1.2, hạ t nano–Streptavidin thương mại có giá cao nhiề u so với hạt nano thông thường Lưu ý hai phương pháp đề u không dùng DNA nguyên th ể   mà DNA biến đổ i (modified DNA) có gắn thêm nhóm thiol phân tử biotin vào đầu 3’ 5’.  Phương pháp hóa học trình bày cho phép gắ n DNA nguyên thể   DNA biến đổ i có nhóm amin nhóm thiol với hạt nano Phương pháp hóa học phức tạp hai phương pháp lạ i cho phép g ắn DNA lên nhi ều lo ại h ạt nano khác nhau, miễn h ạt nano phủ các chất tương tích sinh học với giá thành r ẻ  nhiều Như trình bày  trên, phản ứng tạo phức hợp DNA–hạt nano c ần thực điều kiện ơn hịa để  khơng làm ảnh hưởng đế n tính chấ t DNA tính chấ t hạt nano •  Gắn DNA ngun th ể  với hạt nano  Đây phương pháp tương đối đơn giả n phổ  dụng để  tạo phức hợp chỉ  c ần sử dụng DNA nguyên thể   có nhóm photphat ở  đầu 5’ Khi đó, hạ t nano c ần bọc lớp tương thích sinh học có nhóm chức amin Dưới tác dụng chấ t xúc tác N-methyl-imidazole (MIA) s ự có mặt chất carbodiimide tan nướ c EDC, nhóm photphat ở  đầu 5’ DNA nguyên thể   kích hoạt để  ph ản ứng với nhóm amin hạt nano tạo thành liên k ế t cộng hóa trị b ền Phản ứng diễn ngày ở nhiệt độ phịng [Dynabeads® M-280 Carboxyl] Hình Hình 4.5. Sơ đồ phản ứng DNA nguyên th ể với hạt nano có nhóm amin Gắn DNA biến đổ i có nhóm amin thiol v ới hạt nano Phương pháp địi hỏi sử dụng DNA biến đổ i có nhóm amin thiol Khi tùy thuộ c vào nhóm chức hạt nano mà người ta lựa ch ọn chấ t n ố i (crosslinker) khác (B ảng 4.1) Trong s ố  đó, EDC là m ột loại carbodiimide tan nước sử d ụng phổ  biế n nhấ t hóa sinh h ữu cơng nghệ sinh học nano để  nố i nhóm carboxyl amin tạo thành liên kế t amide Hình 4.6 mơ t ả sơ đồ phản ứng DNA có nhóm amin v ới hạt nano có nhóm carboxyl b ằng chấ t nố i EDC Các chấ t nối NHS DSS không tan nướ c nên phải hòa tan chúng dung môi hữu DMSO trước trộn lẫn với DNA dung d ịch đệm Để   •  76     sử dụng dung môi hữu phản ứng, người ta tổ ng h ợp chấ t nố i tan nước Sulfo-NHS BS3 dựa n ền hai chấ t kể  trên B ảng 4.1. Các chất nối sử dụng để gắn DNA v ới hạt nano  Nhóm chức Nhóm chức Chấ t nố i Chú thích DNA hạt nano amin Photphat ở đầu 5’  MIA/EDC DNA nguyên th ể   amin amin DSS, BS3 DNA bi ến đổ i amin thiol Sulfo-SMCC DNA bi ến đổ i carboxyl amin EDC, NHS , DNA biến đổ i Sulfo-NHS Hình 4.6. Sơ đồ phản ứng DNA có nhóm amin v ới hạt nano có nhóm carboxyl Thực hành: Thí nghiệm Tạo phức hợp DNA nguyên thể với hạt nano từ có nhóm amin phương pháp hóa học [22]    Mục đích  Sinh viên biết phương pháp tạ o ph ức h ợp DNA nguyên thể  v ới h ạt nano có nhóm amin phương pháp hóa họ c thực hi ện vi ệc g ắn DNA nguyên thể  với hạt nano từ có nhóm amin Hóa chấ t thiế t bị  Dung dịch đệm PBS, dung d ịch DNA có nhóm photphat ở  đầu 5’, hạt từ có nhóm chức amin, MIA, EDC.  Máy lắc trịn, máy lắc xốy, nam châm Thí nghiệ m - Lắc hạt từ trong dung d ịch ban đầu máy lắc xoáy - Lấ y thể  tích c ần thiế t hạt từ sang ố ng nghiệm Rửa hạt từ 3 l ần đệm PBS cách bổ   sung đệm PBS, lắc máy lắc trịn phút, sau dùng nam châm thu hạt từ và loại bỏ dịch tan - Phân tán hạt nano từ amin vào dung d ịch đệm PBS, bổ  sung dung dịch DNA, chấ t xúc tác MIA ch ấ t EDC vào dung d ịch hạt từ và l ắc máy lắc tròn ở  nhiệt độ phòng vòng 24h - Thu phức hợp hạt từ-DNA nam châm r ửa phức hợp thu l ần  bằng dung dịch đệm PBS 77     - Phân tán phức h ợp h ạt t ừ-DNA dung d ịch muố i có n ồng độ  th ấ p  bảo quản ở 0°C Thí nghiệm Tạo phức hợp DNA   biến đổi có nhóm amin  với hạt từ có nhóm carboxyl phương pháp hóa học [ Dynabeads® MyOne™ Carboxylic Acid]   Mục đích  Sinh viên biế t thực phương pháp tạ o ph ức h ợp DNA có nhóm amin với hạt từ có nhóm carboxyl phương pháp hóa họ c Hóa chấ t thiế t bị  Dung dịch đệm 100 mM MES pH 4.8 , đệm TT (250 ml đệm M Tris pH ml 10% Tween®-20 pha loãng tới 1000 ml nước cất) , đệm TE ( 10 ml đệm 1 M Tris pH 10 ml 100 mM EDTA pha loãng tới 1000 ml nước cất), dung dịch DNA có nhóm amin đầu 3’ 5’, hạt từ có nhóm chức COOH Máy lắc trịn, nam châm Các bước thự c nghiệ m - Lắc hạt từ-carboxyl dung d ịch ban đầu máy lắc xốy - Lấ y thể  tích c ần thiế t hạt từ-carboxyl sang ố ng nghiệm Dùng nam châm thu hạt từ-carboxyl loại bỏ dịch tan Rửa hạt từ-carboxyl hai l ần ml đệm MES phân tán 100µl đệ m MES - Trộn DNA có nhóm amin ở đầu 3’ 5’ EDC đệm MES - Bổ   sung dung dịch ADN với EDC ở trên vào dung dịch hạt từ và l ắc xoáy 30 giây L ắc máy lắc tròn ở nhiệt độ phòng giờ hoặc qua đêm - Thu phức hợp hạt từ-DNA nam châm r ửa phức hợp thu l ần  bằng dung dịch đệm TT Mỗi l ần rửa lắc máy lắc tròn 30 phút - Phân tán phức hợp hạt từ-DNA đệ m TE ở n ồng độ c ần thiế t bảo quản ở 0°C Thí nghiệm Tạo phức hợp DNA-biotin với hạt từ Streptavidin [Dynabeads® M-280 Carboxyl]  Mục đích  Sinh viên hiểu chấ t phương pháp tạo phức hợp DNA v ới hạt nano nhờ liên kết đặc hiệu sinh học giữaStreptavidin biotin Sinh viên th ực việc gắn DNA có nhóm biotin v ới hạt từ bọcStreptavidin.  Hóa chấ t thiế t bị  Dung dịch đệm gắn rửa ( 10 mM Tris-HCl (pH 7.5), mM EDTA, M NaCl ), dung dịch DNA có gắn biotin, hạt từ bọcStreptavidin Máy lắc trịn, nam châm Thí nghiệ m 78     - Lắc hạt từ-carboxyl dung d ịch ban đầu máy lắc xoáy Lấ y thể  tích c ần thiế t hạt từ-carboxyl sang ố ng nghiệm - Bổ  sung đệm gắn rửa Lắc máy lắc tròn phút - Dùng nam châm thu hạt từ-carboxyl loại bỏ dịch tan Phân tán h ạt từcarboxyl vào dung d ịch đệm gắn rửa - Bổ   sung DNA- biotin nước cấ t vào dung d ịch hạt từ-carboxyl ở trên Lắc máy lắc tròn ở nhiệt độ phòng 15 phút - Thu phức hợp hạt từ-DNA nam châm r ửa phức hợp thu l ần  bằng dung dịch đệm gắn rửa - Phân tán phức h ợp h ạt t ừ-DNA dung d ịch muố i có n ồng độ  th ấ p  bảo quản ở 0°C Câu hỏi i.  Nêu phương pháp tạ o phức hợp DNA với hạt nano ii.  Tại Streptavidin biotin đượ c ứng dụng làm c ầu nối để  nố i DNA hạt nano? iii.  Nêu ưu nhược điể m phương pháp hóa học so với phương pháp hấ p thụ và phương pháp sử dụng Streptavidin-biotin? 4.2 PHƯƠNG PHÁP TẠO PHỨC HỢP HẠT NANO VỚI PROTEIN  Các phương pháp tạo phức hợp protein với vật liệu nano gần giống với phương pháp tạo phức hợp DNA với vật liệu nano trình bày Có thể phân loại thành phương pháp: phương pháp vật lý, phương pháp sinh hoạc liên kết đặc hiệu sinh học nhờStreptavidin biotin, phương pháp hóa học sử dụng chất nối (Hình 4.7) Tuy nhiên, có số điểm khác biệt đáng lưu ý trình bày đây.  4.2.1 Phương pháp vật lý   Phương pháp vật lý phương pháp hấ p phụ protein lên b ề mặt hạt nano (Hình 4.7 a) Trong dung d ịch đệm có pH thích h ợp protein mang điện tích trái dấ u với hạt nano, có thể  tương tác với hạt nano liên kết tĩnh điện Tuy nhiên liên k ết tĩnh điện lại phụ thuộc mạnh vào độ pH n ồng độ  muố i c dung dịch, nên thay đổi đệm v ới độ pH n ồng độ  mu ối cao tương tác giữ protein hạt nano bị suy yế u kế t quả là protein có th ể  bị tách khỏi hạt nano Như vậy, phương pháp vật lý tương đối đơn giả n, phức hợp hạt nano–protein b ền môi trường mà chúng vừa tạo thành, không bền thay đổ i môi trường 79     a b c Hình 4.7 Các phương pháp tạo phức hợp protein với vật liệu nano (a).  Protein hấ p phụ trên b ề mặt hạt nano (b) Protein gắn với hạt nano liên kết đặc hiệu Streptavidin - biotin (c) Protein liên kế t với hạt nano  bằng phương pháp hóa họ c sử dụng chấ t nố i [Kumar] 4.2.2 Phương pháp sinh học sử dụng liên kết đặc hiệu giữ a Streptavidin biotin   Liên kết đặc hiệu gi ữaStreptavidin biotin sử dụng để   làm c ầu nố i protein với hạt nano Hạt nano thường chức hóa proteinStreptavidin, phân t ử  biotin gắn vào protein b ằng phản ứng hóa học Vì liên k ế tStreptavidin–biotin có độ b ền cao nên phức hợp tạo thành rấ t b ền điều kiện sinh lý Lo ại protein hay đượ c dùng để  gắn với hạt nano bằngStreptavidin biotin kháng th ể  do phức hợp tạo thành có nhi ều ứng dụng sinh h ọc phân tử và y sinh (Hình 4.8) Ví d ụ , ph ức hợp kháng th ể–hạt vàng thường dùng chẩn đoán phân tử , phức h ợp kháng thể–chấm lượng t ử  thường ứng dụng đánh dấ u sinh học, phức hợp kháng thể–hạt từ ứng dụng tinh s ạch protein/ kháng nguyên, ho ặc nhiệt từ trị [Schmid] Hình 4.8 Phức hợp hạt nano–kháng thể tạo thành nhờ liên kết đặc hiêuStreptavidin– biotin  Liên kết đặc hiệu Streptavidin biotin bị phá vỡ điều kiện khắc nghiệt Ủ 65 °C phút 90°C phút dung dịch 10 mM EDTA với 95% formamide làm phân tách 96% DNA -biotin Một cách khác đun sơi mẫu vịng phút dung dịch 0,1 % SDS Lưu ý điều kiện protein bị biến tính nên hạt từ  Streptavidin tái sử dụng Cũng có báo cáo liên kết biotin - Streptavidin có thẻ bị phá vỡ ủ  nước deion 70°C thời gian ngắn  [Dynabeads® M-280 Carboxyl] 4.2.3 Phương pháp hóa học 80     Phương pháp hóa học   phương pháp sử dụng chất nối để liên kết phân tử protein với vật liệu nano thơng qua liên kết cộng hóa trị Các liên kết hóa học bền, khơng phụ thuộc vào nồng độ muối phụ thuộc vào pH mơi trường Do đó, phức hợp hạt nano protein tạo phương pháp hóa học  bền dung dịch đệm khác với nồng độ muối cao giá trị pH thay đổi Khác với DNA tạo thành từ nucleotit, protein tạo thành từ 20 axit amin với nhóm chức khác tham gia vào phản ứng hóa học carboxyl , amin, thiol Do đó, sử dụng chất nối để nối protein nguyên thể với hạt nano bọc vật liệu tương thích sinh, mà khơng cần phải thêm nhóm chức vào protein DNA biến đổi (Bảng 4.2).    Chấ t nố i B ảng 4.2. Các chất nối sử dụng để gắn protein v ới hạt nano Nhóm chức hạt nano Nhóm chức protein nguyên th ể   carboxyl amin EDC, NHS , Sulfo-NHS amin amin DSS, BS3 amin thiol Sulfo-SMCC Thực hành Thí nghiệm Tạo phức hợp protein BSA với hạt từ carboxyl phương pháp hóa học [Dynabeads® MyOne™ Carboxylic Acid]  Mục đích  Sinh viên nắm nguyên lý t ạo phức hợp protein v ới hạt nano từ bằng phương pháp hóa học biế t thực thí nghiệm gắn protein lên h ạt từ  phương pháp hóa họ c sử dụng chấ t nố i EDC Hóa chấ t thiế t bị  Protein BSA, h ạt từ (10mg/ml), đệm MES (15 mM MES, pH ), đệm PBS , đệm PBS–T, EDC Máy l ắc tròn Nam châm Pipet đầu tip tương ứ ng Thí nghiệ m - Lắc hạt từ-carboxyl dung d ịch ban đầu máy lắc xoáy máy lắc trịn (khi lắc 30 phút) Lấ y thể   tích c ần thiế t hạt từ-carboxyl sang ố ng nghiệm Dùng nam châm thu hạt từ-carboxyl loại bỏ dịch tan - Rửa hạt từ-carboxyl hai l ần ml đệm MES pH 6,0 (lắc xoáy l ần 510 giây) phân tán 100µl đệm MES - Bổ  sung dung dịch EDC l ắc dung dịch máy l ắc tròn ở nhiệt độ phòng 30 phút - Thu hạt t ừ bỏ d ịch tan bổ  sung protein/ kháng th ể  (tính lượng c ần thiế t) bổ  sung đệm MES đế n thể  tích 200-500 µl Ủ ở nhiệt độ phịng qua đêm   81     - Thu phức hợp hạt từ-DNA nam châm r ửa phức hợp thu l ần  bằng dung dịch đệm PBS-T Mỗi l ần rửa lắc máy lắc tròn 10 phút Phân tán phức hợp hạt từ-protein/khàng th ể  trong đệm PBS-Tvới 0,1% BSA t ới n ồng độ c ần thiế t bảo quản ở 0°C Thí nghiệm Tạo phức hợp kháng thể/protein -biotin với hạt từ  Streptavidin [Dynabeads® M-280 Carboxyl]  Mục đích  Sinh viên hiểu chấ t phương pháp tạo phức hợp protein v ới hạt nano nhờ liên kết đặc hiệu sinh học giữaStreptavidin biotin Sinh viên thực việc gắn protein có nhóm biotin v ới hạt từ   bọcStreptavidin Hóa chấ t thiế t bị  Dung dịch đệm gắn rửa ( 10 mM Tris-HCl (pH 7.5), mM EDTA, M NaCl ), dung dịch đệm PBS, dung dịch đệm PBS có chứa 0.1% BSA , dung dịch kháng thể protein có gắn biotin, hạt từ bọc Streptavidin Máy lắc trịn, nam châm Thí nghiệ m - Lắc hạt t ừ-carboxyl dung d ịch ban đầu b ằng máy lắc xốy - Lấ y thể  tích c ần thiế t hạt từ-carboxyl sang ố ng nghiệm - Bổ  sung đệm gắn rửa Lắc máy lắc tròn phút Dùng nam châm thu hạt từ-carboxyl loại bỏ dịch tan Phân tán h ạt từ-carboxyl vào dung dịch đệm gắn rửa - Bổ  sung kháng th ể  ho ặc protein có g ắn biotin PBS vào dung d ịch hạt từ-carboxyl ở trên Lắc máy lắc tròn ở nhiệt độ phòng 30 phút - Thu phức hợp hạt từ-DNA nam châm r ửa phức hợp thu l ần ằ  b ng dung dịch đệm PBS có ch ứa 0,1% BSA Phân tán ph ức hợp hạt từ-DNA dung dịch đệm PBS có chứa 0,1% BSA b ảo quản ở 0°C Câu hỏi i.  Nêu phương pháp tạ o phức hợp hạt nano với protein ii.  So sánh phương pháp tạo phức hợp protein với hạt nano với phương pháp tạo phức hợp DNA với hạt nano 82     TÀI LIỆU THAM KHẢO  Tiế ng Việt  1.  H ồ Huỳnh Thùy Dương (1998), Sinh học phân tử  , Nxb Giáo dục 2.  Nguyễn Hoài Hương, Bùi Văn Thế Vinh  (2009), Bài giảng Thực hành Hóa sinh 3.  Võ Thị Thương Lan (2002), Sinh học phân tử  , Nxb Đại học quố c Gia Hà Nội 4.  Nguyễn Hồng Lộc (2005), Giáo trình Cơng nghệ  DNA tái tổ  hợ p , Đại Nxb Đại học Huế  5.  Nguyễn Hoàng Lộc (2007), Giáo trình nhậ  p mơn Cơng nghệ  sinh học , Nxb Đại học Huế  6.  Cao Đăng Ngun (2007), Giáo trình cơng nghệ  protein , Nxb Đại học Huế  7.  Khuấ t H ữu Thanh (2006), Cơ sở di truy ề n phân tử  và k ỹ thu ậ t gen , Nxb Khoa học kỹ thuật Hà Nội Tiế ng Anh  8.  Akutsu J.I., Tojo Y., Segawa O., et al (2004), Development of an integrated automation system with a magnetic bead-mediated nucleic acid purification device  for genetic analysis and gene manipulation , Biotechnology and Bioengineering, 86 (6), pp 667 –671 9.  Boom R., Sol C.J.A., Salimans M.M.M., Jansen C.L., Wertheim-van Dillen P.M.E., and Noordaa J.V.D (1990), Rapid and simple method for purification of nucleic acids , Journal of Clinical Microbiology, 28 (3), pp 495 –503 10. Gallagher S.R (1995), One dimensional SDS gel electrophoresis of proteins , Current protocols in Protein Science, John Wiley & Sons, Inc USA 11. Kumar C (2005), Nanotechnologies for the life science , WILEY-VCH Verlag GmbH & Co KGaA, vol 12. Sambrook J., Fritsch E.F., Maniatis T (1989),  Molecular cloning I, II, III: A laboratory manual , Cold Spring Harbor Laboratory Press 13. Schmid G (2004), Nanoparticles: From Theory to Application , WILEY-VCH Verlag GmbH & Co KGaA 14. Scopes R.K (1995), Current Protocols in Protein Science John Wiley & Sons, Inc 15. Untergasser A., Cutcutache I., Koressaar T., Ye J., Faircloth B.C., Remm M and Rozen S.G (2012), Primer3—new capabilities and interfaces , Nucleic Acids Research, Oxford Journals, 40 (15), pp.115 16. Westermeier R (2005), Electrophoresis in Practice 4th  ed Wiley-VCH Verlag GmbH & Co KgaA Tài liệu hướng dẫn hực hành 17. Dynabead® Protein A Life Technology 18. Dynabeads® M-280 streptavidin Life Technology 19. Dynabeads® MyOne™ Carboxylic Acid Life Technology 20. Dynabeads® SILANE genomic DNA Kit, Life Technology 21. Nanodrop 2000/2000c, Thermo Scientific     22. Nanodrop lite user guide (2012), Thermo Fisher Scientific Inc 23. Patent CA 2445838 C 24. Protein A Mag Sepharose, Protein G Mag Sepharose (2009), GE Healthcare 25. SmartSpecTM plus spectrophotometer Instruction manual