(Luận văn thạc sĩ) Biến nập và bước đầu phân tích biểu hiện gen ACF3''5''H từ cây ô đầu ở cây thuốc lá

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM Thadthasine PHOMMASENG BIẾN NẠP VÀ BƢỚC ĐẦU PHÂN TÍCH BIỂU HIỆN GEN ACF3'5'H TỪ CÂY Ô ĐẦU Ở CÂY THUỐC LÁ LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC THÁI NGUYÊN - 2021 ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM Thadthasine PHOMMASENG BIẾN NẠP VÀ BƢỚC ĐẦU PHÂN TÍCH BIỂU HIỆN GEN AcF3'5'H TỪ CÂY Ô ĐẦU Ở CÂY THUỐC LÁ Ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 8.42.01.14 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS Vũ Thị Thu Thủy THÁI NGUYÊN - 2021 LỜI CAM ĐOAN Tơi xin cam đoan rằng, cơng trình nghiên cứu hướng dẫn PGS.TS Vũ Thị Thu Thủy Kết nghiên cứu luận văn trung thực chưa sử dụng để bảo vệ học vị Tôi xin cam đoan rằng, giúp đỡ cho việc thực luận văn cảm ơn thơng tin trích dẫn luận văn rõ nguồn gốc Tác giả luận văn Thadthasine PHOMMASENG i LỜI CẢM ƠN Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc đến PGS.TS Vũ Thị Thu Thủy tận tình hướng dẫn, giúp đỡ tạo điều kiện cho tơi hồn thành tốt trình học tập, thực nghiên cứu đề tài hồn chỉnh luận văn Tơi xin trân trọng cảm ơn ThS Trần Thị Hồng, Trường Đại học Sư phạm Thái Nguyên theo dõi hướng dẫn chu tiến hành thực nghiệm luận văn Tôi xin cảm ơn hỗ trợ đề tài cấp Bộ Giáo dục Đào tạo, mã số B2020TNA-11 TS Nguyễn Thị Ngọc Lan, Khoa Sinh học làm chủ nhiệm Tôi xin chân thành cảm ơn thầy cô Bộ môn Di truyền học Công nghệ sinh học, Trường Đại học Sư phạm Đại học Thái Nguyên tạo điều kiện thuận lợi có góp ý sâu sắc cho tơi thời gian học tập, thực luận văn Tôi xin cảm ơn thầy cô cán Khoa Sinh học, cán bộ phận đào tạo Sau đại học, Trường Đại học Sư phạm Đại học Thái Nguyên giúp đỡ tạo điều kiện thuận lợi cho hồn thành khóa học Qua đây, tơi biết ơn người thân gia đình bạn bè ln động viên, khích lệ chia sẻ khó khăn tơi suốt q trình học tập nghiên cứu, tạo điều kiện giúp đỡ thực đề tài hoàn thành luận văn tốt nghiệp Tác giả luận văn Thadthasine PHOMMASENG ii MỤC LỤC Lời cam đoan i Lời cảm ơn .ii Mục lục iii Danh mục ký hiệu, từ chữ viết tắt iv Danh mục bảng v Danh mục hình vi MỞ ĐẦU 1 Đ t vấn đề Mục tiêu nghiên cứu Nội dung nghiên cứu CHƢƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu chung thuốc 1.1.1 Phân loại thuốc 1.1.2 Vai trò thuốc 1.1.3 Lịch sử hình thành - phát triển thuốc 1.1.4 Các đ c điểm thực vật học thuốc 1.2 Cây Ô đầu đường tổng hợp flavonoid Ô đầu 1.2.1 Cây Ô đầu 1.2.2 Con đường tổng hợp flavonoid Ô đầu 1.3 Gen mã hóa enzyme F3’5’H nghiên cứu biểu gen F3’5’H 10 1.3.1 Gen mã hóa enzyme F3’5’H 10 1.3.2 Các nghiên cứu biểu gen F3’5’H 10 1.4 Nghiên cứu chuyển gen thông qua vi khuẩn Agrobacterium 11 1.4.1 Vi khuẩn Agrobacterium 11 1.4.2 Chuyển gen thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens 14 1.5 Đánh giá sinh vật chuyển gen kỹ thuật sinh học phân tử 16 CHƢƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19 2.1 Vật liệu, hoá chất, thiết bị 19 iii 2.1.1 Vật liệu nghiên cứu 19 2.1.2 Hóa chất 19 2.1.3 Thiết bị 19 2.2 Địa điểm thời gian 19 2.3 Phương pháp nghiên cứu 20 2.3.1 Phương pháp pha môi trường nuôi cấy 21 2.3.2 Phương pháp biến nạp gen 23 2.3.3 Phương pháp tái sinh thuốc biến nạp gen 23 2.3.4 Phương pháp phân tích có m t gen chuyển thuốc biến nạp 24 2.3.5 Phương pháp phân tích biểu gen chuyển 26 2.4 Phương pháp phân tích số liệu 26 CHƢƠNG ẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 27 3.1 Đ c điểm cấu trúc vector pCB301_AcF3'5'H 27 3.2 Kết tạo thuốc biến nạp gen 28 3.2.1 Kết biến nạp cấu trúc mang gen chuyển AcF3'5'H vào mô thuốc thông qua A tumefaciens 28 3.2.2 Kết tái sinh từ mảnh thuốc 30 3.2.3 Kết vườn ươm 31 3.3 Kết phân tích có m t gen chuyển AcF3'5'H thuốc hệ T0 34 3.3.1 Kết tách chiết DNA tổng số 34 3.3.2 Kết nhân gen AcF3’5’H kỹ thuật PCR 36 3.4 Kết phân tích biểu gen chuyển AcF3'5'H thuốc hệ T0 37 ẾT LUẬN VÀ TÀI LIỆU THAM IẾN NGHỊ 39 HẢO 40 iv DANH MỤC Ý HIỆU, CÁC TỪ VÀ CHỮ VIẾT TẮT AS Acetylseringone BAP - benzyladenine bp Base pair = c p bazơ Cefo Cefotaxime CNSH Công nghệ sinh học DNA Deoxyribo Nucleic Acid GM Môi trường tái sinh chồi GM Kan 50 Môi trường tái sinh chồi chứa kanamycin nồng độ 50mg/l RM Môi trường rễ gus β - Glucuronidase gene = Gen mã hóa enzyme β-Glucuronidase Kan Kanamycin LB Mơi trường theo Luria Bertani kb kilo base MS Môi trường theo Murashige Skoog (1962) MT Môi trường OD Optical density = mật độ quang học PCR Polymerase Chain Reaction = phản ứng chuỗi polymerase RNA Ribo Nucleic Acid IBA Indole_3_butiric acid iv DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2.1 Môi trường MS (Murashige Skoog, 1962) 21 Bảng 2.2 Môi trường nuôi cấy thuốc 22 Bảng 2.3 Môi trường nuôi cấy vi khuẩn A.tumefaciens 22 Bảng 2.4 Trình tự c p mồi nhân gen AcF3’5’H 25 Bảng 2.5 Thành phần phản ứng PCR 25 Bảng 2.6 Chu kỳ nhiệt cho phản ứng PCR 25 Bảng 3.1 Kết biến nạp cấu trúc 35S_AcF3’5’H_cmyc_KDE vector chuyển gen pCB301_AcF3’5’H 33 v DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1 Cây thuốc (Nicotiana tabacum L.) Hình 1.2 Con đường sinh tổng hợp flavonoid [14] Hình 1.3 Cấu trúc không gian 3D protein F3’5’H 10 Hình 1.4 Mơ hình chuyển gen gián tiếp nhờ A.tumefaciens [41] 15 Hình 1.5 Các mức độ đánh giá sinh vật chuyển gen 17 Hình 2.1 Sơ đồ thí nghiệm chuyển gen vào thuốc 20 Hình 3.1 Sơ đồ cấu trúc vector chuyển gen pCB301_AcF3’5’H 27 Hình 3.2 Hình ảnh mơ tả q trình chuẩn bị biến nạp gen vào thuốc 29 Hình 3.3 Hình ảnh mơ tả q trình tái sinh 31 Hình 3.4 Hình ảnh thuốc chuyển gen in vitro vườn ươm 32 Hình 3.5 Hình ảnh kết điện di DNA tổng số 35 Hình 3.6 Hình ảnh điện di kiểm tra sản phẩm PCR khuếch đại gen AcF3’5’H từ thuốc chuyển gen T0 36 Hình 3.7 Hình ảnh điện di kiểm tra kết RT-PCR khuếch đại gen AcF3’5’H (cDNA) từ thuốc biến nạp 37 vi MỞ ĐẦU Đ t v n ề Cây Ô đầu (Aconitum carmichaelii Debx.) vị thuốc quý, dùng phổ biến y dược học cổ truyền phương Đơng Củ Ơ đầu chứa nhiều loại dược chất quý, có flavonoid Flavonoid chất chuyển hóa thứ cấp liên quan đến số khía cạnh phát triển bảo vệ thực vật Chúng tạo màu cho hoa quả, tạo điều kiện cho hạt phấn phát tán, đồng thời góp phần giúp trồng thích nghi với điều kiện mơi trường áp lực lạnh ho c tia cực tím, công mầm bệnh Flavonoid chất quan trọng có tác dụng chống oxy hóa, chống tăng sinh tế bào đ c biệt chống ung thư Những năm gần nhà khoa học giới quan tâm tới nhóm chất flavonoid chi Aconitum nhằm phát triển dược phẩm theo hướng đại, nâng cao hiệu sử dụng số loài thuộc chi phòng điều trị bệnh Tuy nhiên, hàm lượng flavonoid Ô đầu lại thấp, vậy, việc lựa chọn công nghệ làm tăng hàm lượng flavonoid củ Ô đầu vấn đề đ t cho nghiên cứu dược chất từ Ô đầu Con đường sinh tổng hợp flavonoid, có nhiều loại enzyme tham gia Trong đó, có hai loại enzyme monooxygenase thuộc họ P450 tham gia, flavonoid 3’hydroxylase (F3’H) flavonoid 3' 5' hydroxylase (F3’5’H) Enzyme F3’5’H giữ vai trò đ c biệt quan trọng việc tạo thành sản phẩm cuối đường sinh tổng hợp flavonoid thực vật Vì vậy, tăng hàm lượng hoạt tính enzyme F3’5’H làm tăng tổng hợp tích lũy hàm lượng flavonoid Cây thuốc thực vật mầm, có thời gian phân hóa từ mơ đến hoàn chỉnh tương đối ngắn Thuốc lựa chọn làm mơ hình để chuyển nhiều gen có giá trị với trồng Chính vậy, nghiên cứu chuyển gen mã hóa flavonoid 3' 5' hydroxylase (F3’5’H) phân lập từ Ô đầu vào thuốc làm sở để tạo Ô đầu chuyển gen có hàm lượng flavonoid cao cần thiết Xuất phát từ lý chọn đề tài “Biến nạp bước đầu phân tích biểu gen AcF3'5'H từ Ô đầu thuốc lá” đạt khoảng 0,6 đến 0,8 số lượng tế bào tối ưu để thực biến nạp Toàn dịch ni ly tâm tốc độ 5000 vịng/1phút, 15 phút, nhiệt độ 4oC Sau 15 phút, bỏ dịch nổi, thu c n Hòa tan c n thu dung dịch ½ MS dịch huyền phù vi khuẩn dùng cho biến nạp Đồng thời với việc nuôi khuẩn, non thuốc in vitro gây tổn thương cách cắt thành mảnh có kích thước khoảng 1x1 cm làm vật liệu để tiến hành lây nhiễm A tumefaciens tái tổ hợp chứa cấu trúc pCB301_AcF3’5’H Khi chưa nhiễm khuẩn cần ngâm mảnh dung dịch ½ MS để tránh mảnh bị khơ bị tổn thương mép Hình 3.2 mơ tả ngun liệu tóm tắt q trình biến nạp cấu trúc mang gen chuyển AcF3'5'H vào mô thuốc thơng qua A tumefaciens Theo đó, hình 3.2A thuốc in vitro nguyên liệu chuyển gen Hình 3.2B dịch ni phục hồi vi khuẩn A tumefaciens sau Hình 3.2 C mảnh thuốc ngâm dịch huyền phù khuẩn A tumefaciens 15 phút Sau 15 phút gắp mảnh lên giấy thấm vô trùng, thấm khô cấy lên môi trường đồng nuôi cấy, nuôi ngày điều kiện khơng có ánh sáng A B C D Hình 3.2 Hình ảnh mơ tả trình chuẩn bị biến nạp gen vào thuốc A: Cây thuốc in vitro nguyên liệu chuyển gen; B: Dịch vi khuẩn nuôi phục hồi sau giờ; C: Mảnh thuốc ngâm dịch khuẩn; D: Mảnh thuốc môi trường đồng ni cấy Như vậy, thí nghiệm biến nạp gen vào mảnh giống thuốc K326 nhận cấu trúc pC301_AcF3’5’H vi khuẩn A tumefaciens điều kiện có nồng độ vi khuẩn đạt khoảng 0,6 – 0,8 29 3.2.2 Kết tái sinh từ mảnh thuốc Tái sinh (regeneration) tượng mơ tế bào ni cấy bị kích thích phát triển thành phôi, mầm chồi, rễ ho c hồn chỉnh Việc biểu tính tồn (totipotency) hay tái sinh nguyên vẹn từ tế bào soma vấn đề kỹ thuật ni cấy in vitro [4] Trong thí nghiệm này, mảnh thuốc tái sinh gồm hai giai đoạn tạo đa chồi tạo hoàn chỉnh Các kích thích sinh trưởng thuộc nhóm auxin, cytokinin kháng sinh nghiên cứu bổ sung vào môi trường ni cấy Kháng sinh nhóm aminoglycosid nhóm kháng sinh diệt khuẩn lấy từ nấm Trong cấu trúc hóa học nhóm có đường với chức amin Một số thuốc kháng sinh tiêu biểu nhóm kể đến kháng sinh streptomycin, neomycin, neomycin, kanamycin, amikacin, gentamicin Phổ kháng khuẩn sinh nhóm aminoglycosid rộng dùng chủ yếu để chống vi khuẩn hiếu khí gram âm Cefotaxime kháng sinh thuộc nhóm betalactam, có cấu giống penicillin hoạt tính kháng khuẩn cefotaxime mạnh penicillin nhiều lần, đ c biệt việc kháng với vi khuẩn Gram âm [39] Trong nghiên cứu này, thường xuyên bổ sung kháng sinh kanamycin cefotaxime vào môi trường nuôi cấy Kết nghiên cứu, theo dõi làm để xác định hiệu chọn lọc chuyển gen Mảnh thuốc sau ngày đồng nuôi cấy mang loại bỏ bớt vi khuẩn dư thừa dung dịch 1/2MS có bổ sung cefotaxime nồng độ 400mg/l, cách lắc nhẹ 15 phút Sau 10 phút, thấm khô m t mảnh lá, chuyển sang môi trường tái sinh chồi (GM) có bổ sung kháng sinh chọn lọc gồm kanamycin nồng độ 50mg/l cefotaxime nồng độ 400mg/l để tái sinh Ni điều kiện có ánh sáng khoảng 2000lux, nhiệt độ khoảng 25oC Để kích thích tạo đa chồi, chúng tơi có bổ sung vào mơi trường ni cấy kích thích sinh trưởng BAP (6- Benzyl aminopurin) BAP thuộc nhóm cytokinin có tác dụng thúc đẩy phân hóa chồi, cành [38] Sau 2-3 tuần từ mảnh xuất chồi nhỏ Cụm chồi hình thành sau 4-5 tuần, cắt chuyển sang mơi trường kéo dài chồi bổ sung kháng sinh chọn lọc 400 mg/l cefotaxime Khi chồi phát triển cao -3 cm chuyển sang rễ Bên cạnh 30 việc bổ sung kháng sinh cefotaxime để chọn lọc tạo rễ thực hiên mơi trường có bổ sung IBA auxin nhân tạo, có tác dụng kích thích rễ, đ c biệt rễ bất định cành giâm, cành chiết, mô nuôi cấy [4] A B C D Hình 3.3 Hình ảnh mơ tả q trình tái sinh A: Các cụm chồi tạo thành sau tuần nuôi cấy môi trường chọn lọc; B: Các cụm chồi kéo dài mơi trường chọn lọc; C: Hình thái chuyển gen hồn chỉnh mơi trường chọn lọc; D: Rễ hồn trước chuyển ngồi vườn ươm Như vậy, mảnh giống thuốc K326 nhận cấu trúc pC301_AcF3’5’H vi khuẩn A tumefaciens tái sinh mơi trường MS có bổ sung BAP 1,5 mg/l, kanamicin 50 mg/l cefotaxime 40 mg/l cho tỉ lệ mẫu tạo chồi đạt 67,77% với 90 chồi/mẫu Ra rễ mơi trường MS có bổ sung IBA 0,1 mg/l cho tỉ lệ chồi tạo rễ đạt 86,88% Rễ dài, mập, khỏe 3.2.3 Kết vườn ươm Các loài trồng chồi rễ tạo thành hồn chỉnh với kích thước định huấn luyện chuyển ngồi vườn ươm Cây ni cấy in vitro sinh trưởng phát triển điều kiện tối ưu nhiệt độ, độ ẩm, pH, dinh dưỡng Vì vậy, trước đưa trồng, người ta cần huấn luyện để thích nghi với điều kiện tự nhiên Quá trình thích nghi với điều kiện bên ngồi giai đoạn đầu yêu cầu cần chăm sóc đ c biệt [38] Trong nghiên cứu này, thuốc sau rễ mơi trường có kháng sinh chọn lọc phát triển đến thật ngồi vườn ươm Đ t bình đủ điều kiện ngồi tự nhiên khỏi phịng ni ngày để thích nghi với môi trường, sau ngày tiến hành lấy khỏi bình rửa mơi trường thạch cịn bám rễ Trồng khay 31 có giá thể xơ dừa sống sót sau tuần Tiến hành cấy bầu, bầu đất gồm đất thịt trấu hun theo tỉ lệ khoảng 1:1 Cây đến thật trồng nhà lưới Giai đoạn chuyển sang điều kiện tự dưỡng điều kiện ngoại cảnh Sau tuần chuyển dòng sống giá thể trấu : cát vào chậu đất đ t nhà lưới Tỷ lệ sống dòng trồng chậu vại đất 66,66% (tương đương với Đ/C) (hình 3.4) chứng tỏ thích nghi tốt với điều kiện ngoại cảnh Cây trồng khay có giá thể xơ dừa sau tuần (Hình 3.4A) Được chuyển trực tiếp bầu đất (Hình 3.4B) Cây thuốc ngồi vươn ươm (Hình 3.4C) Cây thuốc chuyển gen chăm sóc, theo dõi sinh trưởngng, phát triển đến giai đoạn hoa (Hình 3.4D) Cây thuốc chuyển gen kết tạo hạt Như trình chuyển gen vào thuốc lá, chọn lọc sau biến nạp, tái sinh hoàn chỉnh môi trường chọn lọc trồng bầu đất hồn thành A B C D Hình 3.4 Hình ảnh thuốc chuyển gen in vitro ngồi vườn ươm A: Cây trồng khay có giá thể xơ dừa sau tuần B: Cây thuốc chuyển gen trồng bầu đất; C: Cây thuốc vườn ươm; D: Cây thuốc hoa kết Thống kê kết biến nạp cấu trúc CaMV35S_AcF3’5’H_cmyc_KDEL vector chuyển gen pCB301_AcF3’5’H trình bày bảng 3.1 Trên bảng 3.1 thể hiện, với 90 mảnh thuốc K326 biến nạp có 68 mảnh sống sót có số mảnh cảm ứng tạo cụm chồi 61 cụm Số rễ môi trường chọn lọc kháng sinh 53 32 Bảng 3.1 Kết biến nạp c u trúc 35S_AcF3’5’H_cmyc_ DE vector chuyển gen pCB301_AcF3’5’H Số mảnh Thí nghiệm Tổng số sống ối chứng mảnh sót sau tuần Số Số mảnh rễ cảm môi ứng tạo trƣờng chồi chọn lọc Số Số sống sót bầu nhà lƣới ĐC 30 0 0 ĐC 30 30 28 14 10 10 Lần 30 21 19 17 10 Lần 30 20 17 15 10 Lần 30 27 25 21 10 90 68 61 53 30 20 Thí nghiệm Tổng thí nghiệm Kết trình bày bảng 3.1 cho thấy: ĐC0 kí hiệu lơ đối chứng (ni mảnh mô thuốc không chuyển gen), cấy mơi trường tái sinh có bổ sung kháng sinh Trong lơ này, khơng có mảnh sống sót sau tuần, khơng có mảnh cảm ứng tạo chồi Vì vậy, khơng có rễ bầu trồng nhà lưới ĐC1 kí hiệu lơ đối chứng, mơ thuốc không chuyển gen cấy môi trường tái sinh không bổ sung kháng sinh Trong lô này, có 30 mảnh sống sót sau tuần, có 28 mảnh cảm ứng tạo chồi, có 14 rễ mơi trường chọn lọc, có 10 bầu sống sót nhà lưới Với lơ thí nghiệm, chúng tơi làm l p lại ba lần Lần thứ có 21 mảnh sống sót sau tuần, có 19 mảnh cảm ứng tạo chồi, có 17 rễ mơi trường chọn lọc, có 10 bầu có sống sót nhà lưới Lần thứ có 20 mảnh sống sót sau tuần, có 17 mảnh cảm ứng tạo chồi, có 15 rễ mơi trường chọn lọc, có 10 bầu có sống sót nhà lưới Lần thứ có 27 mảnh sống sót sau tuần, có 25 mảnh cảm ứng tạo chồi, có 21 rễ mơi trường chọn lọc, có 10 bầu có sống sót nhà lưới 33 Chuyển 30 bầu đất có 20 sống bầu trồng nhà lưới có biểu biện xanh tốt, mập mập Trong đó, ĐC0 30 mảnh khơng có mẫu sống sót; cịn ĐC1 thuốc khơng chuyển gen cấy môi trường tái sinh không bổ sung kháng sinh thu 27 số mẫu cảm ứng tạo chồi, chuyển 14 chồi sang môi trường rễ số bầu đất 10 có 10 sống, sinh trưởng bình thường nhà lưới Như số thuốc chuyển gen sống sót nhà lưới 20 với 10 đối chứng không chuyển gen tiếp tục chăm sóc phục vụ phân tích Các dịng thuốc chuyển gen sau trồng nhà lưới khoảng 3-4 tuần tiến hành thu thực phản ứng PCR kiểm tra có m t gen chuyển Như vậy, mảnh giống thuốc K326 nhận cấu trúc pC301_AcF3’5’H vi khuẩn A tumefaciens tái sinh tạo thành thuốc đưa vườn ươm trồng giá thể sau tuần có tỷ lệ sống đạt 66,66% 3.3 ết phân tích có m t gen chuyển AcF3'5'H thuốc hệ T0 3.3.1 Kết tách chiết DNA tổng số DNA tổng số vật liệu khởi đầu cho nghiên cứu mức độ phân tử Chất lượng DNA tổng số vai trị quan trọng định thành cơng thí nghiệm phân tích sinh học phân tử Cho đến có nhiều phương pháp tách chiết, tinh DNA thực vật Tuy nhiên theo nguyên tắc chung (1) phá vỡ mô, màng tế bào biện pháp học, (2) sử dụng CTAB (Cetyltrimethyl ammonium bromide) làm cho DNA dễ hòa tan, tách polysacharide ARN khỏi DNA (3) Sử dụng hóa chất (chủ yếu EDTA) để bảo vệ tế bào tránh khỏi phân hủy enzyme nội bào, (4) Tiếp tục sử dụng hóa chất chloroform, isoamyl alcohol… để loại protein tạp chất (5) Thu hồi DNA cách kết tủa cồn ho c isopropanol…Sau ly tâm, thu tủa DNA hịa tan DNA nước cất ho c dung dịch đệm dung dịch DNA để bảo quản DNA sau tách chiết kiểm tra độ tinh phương pháp đo quang phổ ho c điện di Để đánh giá độ tinh DNA phương pháp quang phổ người ta đo dung dịch DNA thu bước sóng 260 nm (phổ hấp phụ cực đại DNA) 280 nm (phổ hấp phụ cực đại protein) Nếu tỷ lệ A260nm/A280nm 34 khoảng 1,8 đến 2,0 xem dịch chiết DNA tinh Để đánh giá mức độ tinh sạch, nguyên vẹn phân tử DNA phương pháp điện di cần thiết phải có gel agarose Các gel đóng vai trị lưới để phân tử DNA vượt qua Sau điện di, phân tử DNA hình cách nhuộm với thuốc thử ethidium bromid Thuốc thử tạo liên kết với base nito, chiếu tia UV bước sóng khoảng 300 nm, phần có DNA phát quang màu da cam Nếu phổ điện di dung dịch DNA cho hình dải băng rộng, ho c gồm nhiều vạch chứng tỏ DNA bị đứt gãy nhiều ho c lẫn tạp chất Phố điện di băng gọn, rõ chứng tỏ DNA không bị đứt gãy đảm bảo độ tinh Trong thí nghiệm này, chúng tơi tiến hành tách chiết DNA tổng số mẫu thuốc theo phương pháp Saghai-Maroof đtg (1984) mô tả trọng mục 2.3.4.1[28] Chúng chọn 14 thuốc chuyển gen hệ T0 sau 3-4 tuần có biểu sinh trưởng phát triển bình thường điều kiện nhà lưới Các dịng chọn ký hiệu T0-1, T0-2, T0-3, T0-4, T0-5, T0-6, T0-7, T0-8, T0-9, T0-10, T0-11, T0-12, T0-13, T0-14 thuốc không chuyển gen (cây WT) để tách chiết DNA tổng số kiểm tra có m t gen chuyển AcF3’5’H chuyển gen kỹ thuật PCR DNA tổng số từ mẫu tách chiết điện di kiểm tra gel 0,8% (Hình 3.5) Hình 3.5 Hình ảnh kết điện di DNA tổng số (1-14: DNA tổng số dòng thuốc chuyển gen ĐC: mẫu WT) Kết hình 3.5 DNA 14 mẫu thuốc chuyển gen hệ T0 mẫu đối chứng (WT) Sau điện di DNA tổng số, kết cho thấy có 35 tương đối sáng rõ nét tập trung phân tử DNA Điều chứng tỏ, DNA tách chiết từ mẫu thuốc nghiên cứu tương đối sạch, khơng bị đứt gãy, tạp chất sủ dụng để nhân gen kỹ thuật PCR 3.3.2 Kết nhân gen AcF3’5’H kỹ thuật PCR Tiến hành phản ứng PCR với c p mồi đ c hiệu F3’5’H-NcoI-F F3’5’HNotI-R (bảng 2.4) nhân đoạn gen AcF3’5’H từ DNA hệ gen 14 dòng thuốc T0, kết thể hình 3.6 Hình ảnh điện di hình 3.6 cho thấy, có dịng gọi dương tính với PCR, biểu chạy số 2, 4, 6, 10, 12, 14 gel điện di xuất đoạn DNA nhất, có kích thước 1,5 kb, tương ứng với kích thước dự kiến gen chuyển AcF3’5’H (1536 bp) Ngược lại, chạy số 1, 3, 5, 7, 8, 9,11, 13 không xuất băng vạch có kích thước mong muốn, chứng tỏ khơng có gen AcF3’5’H chuyển vào Hình 3.6 Hình ảnh điện di kiểm tra sản phẩm PCR khuếch đại gen AcF3’5’H từ thuốc chuyển gen T0 1-14: Các dòng thuốc chuyển gen hệ T0; M: Thang chuẩn DNA 1kb; WT: Cây thuốc không chuyển gen; (+): Sản phẩm PCR từ cấu trúc chuyển gen pCB301_AcF3’5’H Như vậy, kết phân tích ban đầu dự đoán cấu trúc mang gen chuyển pC301_AcF3’5’H dung hợp vào hệ gen thuốc Hiệu suất chuyển gen giai đoạn phân tích kết PCR xác nhận 6/90 T0 dương tính với PCR, đạt hiệu suất chuyển gen 6,67% Các chuyển gen 36 dương tính với PCR giai đoạn T0 ký hiệu T0-2, T0-4, T0-6, T0-10, T0-12, T014 tiếp tục theo dõi vườn ươm để phục vụ cho nghiên cứu Sử dụng kỹ thuật PCR để phân tích sinh vật chuyển gen phương pháp đơn giản, dễ thực phịng thí nghiệm Gen chuyển gen biết, kết nghiên cứu cho thấy cần: Tách chiết DNA genome sinh vật chuyển gen; sử dụng c p mồi đ c hiệu gen để khuếch đại phản ứng PCR; Điện di sản phẩm PCR gel agarose Nếu sản phẩm PCR có kích thước dự kiến mẫu phân tích coi dương tính, đồng nghĩa với chuyển gen thành cơng Tuy nhiên, kết PCR dương tính (1) vi khuẩn mang gen chuyển cịn tồn khối mô hay gian bào mẫu phân tích; (2) Gen chuyển tồn tự tế bào chất, biến qua sinh sản hữu tính; (3) gen chuyển khơng hoạt động, tức khơng biểu thành protein có chức sinh học Do đó, phân tích sinh vật chuyển gen kỹ thuật PCR có giá trị định hướng ban đầu cần thiết phải nghiên cứu nhiều để kết tạo sinh vật chuyển gen cơng nhận 3.4 ết phân tích biểu gen chuyển AcF3'5'H thuốc hệ T0 Sự biểu gen chuyển AcF3'5'H thuốc hệ T0 đánh giá bước đầu kỹ thuật RT-PCR Sự biểu gen mức phiên mã (tạo RNA) Kết phân tích trình bày hình 3.7 Hình 3.7 Hình ảnh điện di kiểm tra kết RT-PCR khuếch đại gen AcF3’5’H (cDNA) từ thuốc biến nạp M: thang DNA 1kb; WT: Cây thuốc không biến nạp; (+): Vector pCB301_AcF3’5’H; 1-6 thuốc biến nạp gen AcF3’5’H hệ T0 tương ứng T0-2, T0-4, T0-6, T0-10, T0-12, T0-14 Hình ảnh điện di hình 3.7 cho thấy, có dịng gọi dương tính với RTPCR, biểu chạy số 2, 3, 6, tương ứng với kích thước dự kiến gen 37 chuyển AcF3’5’H (1,581 bp) Ngược lại, chạy số 1, 3, 5, không xuất băng vạch có kích thước mong muốn, chứng tỏ gen AcF3’5’H không biểu hệ T0 Hiệu suất biến nạp gen giai đoạn phân tích kết RT-PCR xác nhận 3/90 T0, đạt hiệu suất chuyển gen 3,33% Các chuyển gen dương tính với RT-PCR giai đoạn T0 ký hiệu T0-4, T0-6, T0-14 tiếp tục theo dõi vườn ươm để phục vụ cho nghiên cứu 38 ẾT LUẬN VÀ IẾN NGHỊ Kết luận: Cấu trúc vector trúc pC301_AcF3’5’H gồm có hai phần: (1) Phần mang gen nptII mã hóa amino glycosid 3’phosphotransferase có tính đối kháng với kháng sinh thuộc nhóm amino glycosid (2) Phần mang gen AcF3’5’H mã hóa flavonoid 3' 5' hydroxylase phân lập từ Ô đầu Biến nạp cấu trúc pC301_AcF3’5’H nhờ vi khuẩn A tumefaciens vào mơ thuốc K326 điều kiện có nồng độ vi khuẩn đạt khoảng 0,6 – 0,8 Tái sinh mơi trường MS có bổ sung BAP 1,5 mg/l, kanamicin 50 mg /l cefotaxime 40 mg/l cho tỉ lệ mẫu tạo chồi đạt 67,77% Ra rễ mơi trường MS có bổ sung IBA 0,1 mg/l cho tỉ lệ chồi tạo rễ đạt 86,88%, chất lượng rễ tốt Cây đưa vườn ươm trồng giá thể sau tuần có tỷ lệ sống đạt 66,66% Xác định có m t gen chuyển AcF3’5’H vào mô thuốc K326 nhờ vi khuẩn A tumefaciens xác định 6/90 T0 dương tính với PCR, đạt hiệu suất chuyển gen 6,67% Xác định biểu gen chuyển AcF3’5’H kỹ thuật RT-PCR xác định 3/90 T0 dương tính với RT- PCR, hiệu suất biến nạp gen 3,33% Kiến nghị: Tiếp tục đánh giá biểu gen chuyển mức độ protein kỹ thuật Western ho c ELISA 39 TÀI LIỆU THAM HẢO Tiếng Việt: Bộ môn công nghiệp Trường Đại học nông lâm Thành Phố Hồ Chí Minh, Giáo trình giảng dạy thuốc lá, Nxb Thành Phố Hồ Chí Minh Nguyễn Thị Ngọc Lan, Từ Quang Tân, Chu Hoàng Mậu (2020), Sinh học đại-một số vấn đề nguyên lý ứng dụng, Nxb Đại học quốc gia Hà Nội Phutthakone Vaciaxa, Trần Thị Hồng, Phạm Thị Thanh Nhàn, Vũ Thị Thu Thủy, Chu Hoàng Mậu (2021), “Nghiên cứu biến nạp gen GmDREB6 thông qua Agrobacterium tumefaciens giống đậu tương”, Tạp chí Khoa học Cơng nghệ Đại học Thái Ngun 226(01), pp 57-64 Nguyễn Thị Tâm, Vũ Thị Thu Thủy (2016), Công nghệ tế bào thực vật ứng dụng, Nxb Đại học Thái Nguyên Vì Th Đại học Thái Nguyên.và ứng dụng), Nguyênterium tumefaciens giống đậu tương.ốt phục vụ cho nghiên cứu tiếpnhờ Agrobacterium tumefaciens”, T,ien nsm Thái Nguyên.và ứng dụng), Nguyên 19(8) pp:39-42 Lê Đình Thụy, Phạm Kiến Nghiệp (1996), Trồng chế biến thuốc lá, Nxb Thành phố Hồ Chí Minh Lê Thị Hồng Trang, Chu Hồng Mậu, Nguyễn Hữu Quân (2019), “Chuyển gen glycine max chanlcone isomerase 1A vào thuốc thông qua vi khuẩn Agrobacteriem tumefaciens: mơ hình cho tăng cường biểu gen GmCHI1A đâu tương”, Tạp chí Khoa học Công nghệ Đại học Thái Nguyên, 207(14), pp: 195-200 Lê Thị Hồng Trang, Trần Thị Thanh Vân, Hồ Mạnh Tường, Phạm Thanh Tùng, Lê Văn Sơn, Chu Hoàng Mậu (2016), “Đ c điểm gen GmCHI phân lập từ số giống đậu tương khác hàm lượng Isoflavone”, Tạp chí Sinh học 38(2), pp 236-242 40 Tiếng Anh: Akehurt B C 1981: Tobacco Longman group Ltd., New York 764 pp 10 Chyi, Y S., Jorgensen, R A., Goldstein, D., Tanksley, S D., Loaiza-Figueroa, F (1986) Locations and stability of Agrobacterium-mediated T-DNA insertions in the Lycopersicon genome Molecular and General Genetics MGG, 204(1), pp: 64-69 11 Collins W K., Hawks S N Jr.: Principles of the Flue - cured Tobacco Production N C State University 2nd Ed 1993 300 12 Davis D L., Nielsen M T (1999): Tobacco Production, Chemistry and Technology B Blackwell Science 467 13 Do, T L (2004), "Viet Nam medicinal plants and medicine taste." (2004): 833 14 Ehlting J., Shin J J K., Douglas C J (2001), Identification of 4coumarate:coenzyme A ligase (4CL) substrate recognition domains, Plant J, 27, pp 455 - 465 15 Gracia Zabala1, Jijun Zou1, Jigyasa Tuteja1, Delkin O Gonzalez1,Ishiguro K., Taniguchi M., Tanaka Y (2012), Functional analysis of Antirrhinum kelloggii flavonoid 3'-hydroxylase and flavonoid 3',5'-hydroxylase genes; critical role in flower color and evolution in the genus Antirrhinu, Plant Res 125, pp 451456; doi: 10.1007/s10265-011-0455-5 16 Harborne, J B., Williams, C A (2000) Advances in flavonoid research since 1992 Phytochemistry, 55(6), 481-504 17 Ishiguro K., Taniguchi M., Tanaka Y (2012), “Functional analysis of Antirrhinum kelloggii flavonoid 3' hydroxylase and flavonoid 3',5' hydroxylase genes; critical role in flower color and evolution in the genus Antirrhinu” Plant Res 125, pp 451-456; doi: 10.1007/s10265-011-0455-5 18 Jaiwal P K., Kumari R., Ignacimuthu S., Potrykus I., Sautter C (2001), Agrobacterium tumefaciens-mediated gene transfer in mungbean (Vigna radiata L Wilczeck) -a recalcitrant grain legume, Plan Sci , 161(2), pp 239-247 19 Kim S.Y., 1, Cheon K.S., Im S.M., Kwon O.H., Yoo B.Y, Kim MS., Lee S.Y (2016), Isolation and Expression Pattern of Flavonoid 3',5'-hydroxylase Gene in Clematis patens, Flower Research Journal http://dx.doi.org/10.11623/frj.2016.24.3.05 41 24, pp.205-211; DOI : 20 L D Vu (2014), Research on chemical compositionand some biological effects of A acarmichaeli Debx Planted in Ha Giangprovince, PhD thesis of Traditional Pharmacy, Institute of Medicinal Materials 21 Mahalakshmi S.L., Leela T., Manoj K.S (2006), Enhanced genetic efficiency of mungbean by use of primary leaf explants, Curr Sci 91(1), pp 93-98 22 Nguyen Thi Ngoc Lan., Phutthakone Vaciaxa., Lo Thi Mai Thu., Nguyen Thi Hai Yen., Pham Thi Thanh Nhan., Le Van Son., Chu Hoang Mau (2019), Design of Construct Carrying GmDREB6 to Eenhance Soybean Gene Expression Related to Abiotic Stress Response, European Journal of Engineering Technology Research 4(6), pp 135-139 23 Pal, M., Ghosh, U., Chandra, M., Pal, A., Biswas, B B (1991) Transformation and regeneration of mung bean (Vigna radiata) Indian journal of biochemistry & biophysics, 28(5-6), pp:449-455 24 Phogat S.K., Karthikeyan A.S (1999), Generation of transformed calli of Vigna radiata by Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation, J Plan Biol., 26(1), pp 77-82 25 Potjamarn, S (2002) Introduction and expression of cholesterol oxidase gene in a bacterium [Escherichia coli M15 (pREP4)] and mungbean [Vigna radiata (L.) Wilczek] PhD Thesis, Suranare University of Techonology, pp: 162 26 Q H Nguyen., H T T Hoang., H T Tran., T T T Vu., T D Sy., M H Chu., L T N Nguyen (2020), In vitro multiple shoot regeneration and hairy root induction of Aconitum carmichaelii Debex.-an important medicinal plant, SYLWAN, vol 164, pp 228-242 27 Reed S.M (1993), Use of stomatal size to distinguish between haploid and dihaploid tobacco plants, Tobacco Scienes 37, pp 84-86 28 Saghai-Maroof, M A., Soliman, K M., Jorgensen, R A., Allard, R W (1984), Ribosomal DNA spacer-length polymorphisms in barley: Mendelian inheritance, chromosomal location and population dymnamics, Proc Natl Acad Sci USA 81, pp 8014- 8018 42 29 Tazeen, S., Mirza, B U S H R A (2004) Factors affecting Agrobacterium tumefaciens mediated genetic transformation of Vigna radiata (L.) Wilczek Pak J Bot, 36(4), 887-896 30 Seitz, C., Ameres, S., Schlangen, K., Forkmann, G., Halbwirth, H (2015) Multiple evolution of flavonoid 3′, 5′-hydroxylase Planta, 242(3), 561-573 31 Solis, J., Medrano, G., & Ghislain, M (2007) Inhibitory effect of a defensin gene from the Andean crop maca (Lepidium meyenii) against Phytophthora infestans Journal of plant physiology, 164(8), pp: 1071-1082 32 Tso, T C (1990): Production, Physiology and Biochemistry of Tobacco Plant IDEALS, Inc USA 753 p 33 Veluthambi, K., Gupta, A K., Sharma, A (2003) The current status of plant transformation technologies Current Science, 84(3), pp: 368-380 34 Wang, Y S., Xu, Y J., Gao, L P., Yu, O., Wang, X Z., He, X J., Xia, T (2014) Functional analysis of flavonoid 3′, 5′-hydroxylase from tea plant (Camellia sinensis): critical role in the accumulation of catechins BMC plant biology, 14(1), 1-14 35 Zhao-Shi Xu, Ming Chen, Lian‐ Cheng Li.,You‐ Zhi (2011), “ Functions and application of the AP2/ERF transcription factor family in crop improvement F” Journal of integrative plant biology, 53(7), 570-585 Trang Web 36 http://commons.wikimedia.org/wiki/Họ_Cà (11/01/2021) 37 http://tailieu.vn/xem-tai-lieu/bai-bao-cao-cay-thuoc-la.416576.html (19/01/2021) 38 https://amp.thaythuoccuaban.com/vithuoc/thuocla.htm (15/02/2021) 39 https://www.vinmec.com/vi/thong-tin-duoc/su-dung-thuoc-toan/phan-loai-va-coche-tac-dung-cua-khang-sinh/ (12/03/2021) 40 https://vi.wikipedia.org/wiki/Agrobacterium_tumefaciens (22/03/2021) 41 https://hocday.com/li-cm-n-trc-ht-ti-xin-by-t-lng-bit-n-chn-thanh-va-su-sc-tipgs.html?page=3 (14/09/2021) 43