Luận án Tiến sĩ Nghiên cứu nâng cấp tiêu chuẩn dược liệu rễ ba kích (radix morindae officinalis) của Việt Nam

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI PHẠM VĂN KIỀN NGHIÊN CỨU NÂNG CẤP TIÊU CHUẨN DƯỢC LIỆU RỄ BA KÍCH (RADIX MORINDAE OFFICINALIS) CỦA VIỆT NAM LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƯỢC HỌC HÀ NỘI, NĂM 2021 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI PHẠM VĂN KIỀN NGHIÊN CỨU NÂNG CẤP TIÊU CHUẨN DƯỢC LIỆU RỄ BA KÍCH (RADIX MORINDAE OFFICINALIS) CỦA VIỆT NAM LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƯỢC HỌC CHUYÊN NGÀNH: KIỂM NGHIỆM THUỐC VÀ ĐỘC CHẤT MÃ SỐ: 62720410 Người hướng dẫn khoa học: PGS TS Đoàn Cao Sơn PGS TS Bùi Hồng Cường HÀ NỘI, NĂM 2021 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu riêng tơi Các số liệu, kết trình bày luận án trung thực phần đề tài cấp nhà nước “Nghiên cứu thành phần hóa học, tạo chế phẩm có tác dụng sinh học rễ Ba kích Việt Nam (Radix Morindae officinalis)”, mã số CNHD.ĐT.075/16- 18, thuộc Chương trình “Khoa học cơng nghệ trọng điểm quốc gia phát triển cơng nghiệp hóa dược đến năm 2020” mà tơi có tham gia đồng ý Chủ nhiệm đề tài NCS PhạmVăn Kiền LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành luận án này, tơi nhận giúp đỡ tận tình có hiệu nhiều cá nhân, tập thể, thầy cô giáo, đồng nghiệp, bạn bè gia đình Với lịng kính trọng biết ơn sâu sắc, tơi xin cảm ơn PGS TS Đồn Cao Sơn – Viện trưởng Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương PGS TS Bùi Hồng Cường – Phó trưởng Bộ mơn Dược học Cổ truyền, Trường Đại học Dược Hà Nội, người thầy tận tình hướng dẫn tơi suốt q trình thực hồn thành luận án Tơi xin trân trọng cảm ơn Ban Giám hiệu Trường Đại học Dược Hà Nội, Phòng Đào tạo Sau đại học, GS TS Thái Nguyễn Hùng Thu, thầy, cô Bộ mơn Hóa phân tích – Độc chất, Trường Đại học Dược Hà Nội tạo điều kiện, tận tình giúp đỡ chia sẻ kinh nghiệm để tơi hồn thành luận án Tơi xin trân trọng cảm ơn Bộ Cơng thương cấp kinh phí cho Đề tài cấp nhà nước “Nghiên cứu thành phần hóa học, tạo chế phẩm có tác dụng sinh học rễ Ba kích Việt Nam (Radix Morindae officinalis)”, mã số CNHD.ĐT.075/16-18; PGS TS Trần Việt Hùng – Viện trưởng Viện Kiểm nghiệm thuốc Tp Hồ Chí Minh, chủ nhiệm đề tài anh, chị, em đồng nghiệp Khoa Kiểm nghiệm Đông dược dược liệu, Khoa Thiết lập chất chuẩn chất đối chiếu – Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương, Khoa Vi sinh – Viện Kiểm nghiệm thuốc Tp Hồ Chí Minh hỗ trợ, giúp đỡ tạo điều kiện cho tơi q trình thực nghiệm để tơi hồn thành luận án Cuối cùng, tơi xin chân thành ơn gia đình tơi người bạn, đồng nghiệp ln ủng hộ, động viên khích lệ tơi hồn thành cơng trình nghiên cứu Hà Nội, ngày tháng năm 2021 NCS Phạm Văn Kiền MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT i DANH MỤC CÁC BẢNG, BIỂU iii DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, SƠ ĐỒ vii ĐẶT VẤN ĐỀ .1 CHƯƠNG TỔNG QUAN .3 1.1 Dược liệu rễ Ba kích (Radix Morindae officinalis) .3 1.1.1 Vị trí phân loại Ba kích 1.1.2 Đặc điểm hình thái 1.1.3 Phân bố, thu hái, chế biến 1.1.4 Thành phần hoá học 1.1.5 Tác dụng dược lý .5 1.1.6 Tiêu chuẩn chất lượng dược liệu rễ Ba kích .5 1.2 Monotropein nystose .6 1.2.1 Monotropein 1.2.2 Nystose 1.3 Tình hình thiết lập chất chuẩn monotropein nystose 12 1.3.1 Tình hình thiết lập chất chuẩn monotropein, nystose giới Việt Nam 12 1.3.2 Phân lập, tinh chế monotropein nystose từ Ba kích 13 1.4 Phương pháp phân tích trình tự ADN định danh lồi Morinda officinalis How 15 1.4.1 Quy trình phân tích mã vạch ADN cho thực vật .15 1.4.2 Phương pháp khuếch đại gen (PCR) 16 1.4.3 Các trình tự gen thường dùng cho thực vật 18 1.4.4 Nghiên cứu về đa dạng di truyền loài Morinda officinalis How 22 1.6 Tính cấp thiết luận án 23 CHƯƠNG II ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .25 2.1 Đối tượng nghiên cứu .25 2.2 Phương tiện nghiên cứu .25 2.2.1 Chất chuẩn dược liệu chuẩn .25 2.2.2 Hóa chất thuốc thử .25 2.2.3 Thiết bị, dụng cụ 26 2.3 Phương pháp nghiên cứu 27 2.3.1 Thẩm định phương pháp định tính, định lượng monotropein nystose .27 2.3.2 Chiết xuất, phân lập, tinh chế monotropein nystose từ dược liệu rễ Ba kích 37 2.3.3 Thiết lập chất chuẩn monotropein nystose 39 2.3.4 Định danh dược liệu rễ Ba kích Việt Nam dựa số thị ADN 44 2.3.5 Nâng cấp chuyên luận dược liệu rễ Ba kích Dược điển Việt Nam về số tiêu định tính, định lượng .48 CHƯƠNG III KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU .49 3.1 Thẩm định phương pháp định tính, định lượng monotropein nystose 49 3.1.1 Thẩm định phương pháp định tính, định lượng monotropein 49 3.1.2 Thẩm định phương pháp định tính, định lượng nystose 54 3.1.3 Thẩm định phương pháp định tính nystose dược liệu rễ Ba kích phương pháp sắc ký lớp mỏng 59 3.2 Chiết xuất, phân lập, tinh chế monotropein nystose từ dược liệu rễ Ba kích60 3.2.1 Chiết xuất cao chiết toàn phần chứa monotropein nystose .60 3.2.2 Phân lập tinh chế monotropein 61 3.2.3 Phân lập tinh chế nystose 63 3.2.4 Xác định liệu nhận dạng nguyên liệu thiết lập chất chuẩn 65 3.3 Thiết lập chất chuẩn monotropein nystose 67 3.3.1 Thiết lập chất chuẩn monotropein 67 3.3.2 Thiết lập chất chuẩn nystose 75 3.3.3 Định tính, định lượng monotropein nystose dược liệu rễ Ba kích 83 3.4 Định danh dược liệu rễ Ba kích Việt Nam dựa số thị ADN .85 3.4.1 Chiết tách ADN toàn phần từ dược liệu 85 3.4.2 Nhân đoạn gen 86 3.4.3 Giải trình tự gen định danh dược liệu 87 3.4.4 Phân tích trình tự gen .89 3.5 Nâng cấp chuyên luận dược liệu rễ Ba kích Dược điển Việt Nam số tiêu định tính định lượng 93 3.5.1 Bổ sung tiêu định tính, định lượng vào chuyên luận dược liệu rễ Ba kích Dược điển Việt Nam .93 3.5.2 Dự thảo chuyên luận dược liệu rễ Ba kích Dược điển Việt Nam VI .94 CHƯƠNG BÀN LUẬN 101 4.1 Thẩm định phương pháp định tính, định lượng monotropein nystose 101 4.1.1 Phương pháp định tính, định lượng monotropein nguyên liệu dược liệu rễ Ba kích 101 4.1.2 Phương pháp định tính, định lượng nystose nguyên liệu dược liệu rễ Ba kích .103 4.1.3 Thẩm định phương pháp định tính nystose dược liệu TLC 105 4.2 Chiết xuất, phân lập tinh chế monotropein nystose từ dược liệu rễ Ba kích 105 4.2.1 Chiết cao toàn phần 105 4.2.2 Phân lập, tinh chế monotropein 106 4.2.3 Phân lập, tinh chế nystose .107 4.2.4 Xác minh cấu trúc monotropein nystose tinh chế 108 4.3 Thiết lập chất chuẩn monotropein nystose 109 4.4 Định danh dược liệu rễ Ba kích Việt Nam dựa số thị ADN .112 4.5 Nâng cấp chuyên luận dược liệu rễ Ba kích Dược điển Việt Nam số tiêu định tính, định lượng 118 4.5.1 Bổ sung tiêu định tính 118 4.5.2 Bổ sung tiêu định lượng 120 4.6 Những đóng góp luận án 122 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .123 Kết luận 123 Kiến nghị 123 TÀI LIỆU THAM KHẢO DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT ADN : Acid Deoxyribo Nucleic ARN : Acid ribonucleic AFLP : Amplified Fragment Length Polymorphism – Đa hình độ dài đoạn nhân chọn lọc APG II : Angiosperm Phylogeny Group II - Nhóm phát sinh chủng lồi thực vật hạt kín ARS : ASEAN Reference Standards - Chất chuẩn khu vực ASEAN CBOL : Consortium for the Barcode of Life cpDNA : Chloroplast Deoxyribo Nucleic Acid - Bộ gen lục lạp ptDNA : Plasma tumor Deoxyribo Nucleic Acid - Bộ gen lạp thể DĐVN : Dược điển Việt Nam DNA : Deoxyribo Nucleic Acid dNTP : Deoxynucleoside triphosphate dATP : Deoxyadenosine triphosphate dCTP : Deoxycytidine triphosphate dGTP : Deoxyguanosine triphosphate EDTA : Ethylenediaminetetraacetic acid ELSD : Evaporative light scattering detector - Detector tán xạ bay EPRS : EP Reference Standards - Chất chuẩn Dược điển Châu Âu ETS : External transcribed spacer – Vùng mã gene FHH : Diễn đàn hòa hợp thuốc thảo dược nước Tây Thái Bình Dương HPLC-DAD : Sắc ký lỏng hiệu cao detector mảng diod HPLC-ELSD : Sắc ký lỏng hiệu cao detector tán xạ bay FOS : Fructo Oligo Saccharid ICRS : Chất chuẩn Dược điển Quốc tế i IGS : Intergenic spacer – vùng chen gene IR : Vùng gen lặp lại đảo ngược (inverted repeat - IR) ISSR : Inter-Simple Sequence Repeats – Chuỗi lặp lại đơn giản ITS : Internal transcribed spacer KNV : Kiểm nghiệm viên LDL : Low density lipoprotein LSC : large single copy – vùng đơn gen lớn matK : Maturase K MeOH : Methanol mRNA : Messenger Ribonucleic acid NCBI : National Center for Biotechnology Information PTN : Phòng thử nghiệm PCR : Polymerase chain reaction – Kỹ thuật khuếch đại gen QTL : Quantiative Trait loci RAPD : Random Amplified Polymorphic DNA rbcL : Rubisco large subunit gene SKLM : Sắc ký lớp mỏng SSC : Small single copy - Vùng đơn gen nhỏ TBE : Tris/Borate/EDTA TCCL : Tiêu chuẩn chất lượng TLC : Thin layer chromatography – Sắc ký lớp mỏng TIS : Transcription start site – Điểm khởi đầu chép TRIS : Tris(hydroxymethyl)aminomethane USPRS : USP Reference Standards - Chất chuẩn Dược điển Mỹ UV-VIS : Ultraviolet-Visible - Tử ngoại – khả kiến WHO : World health organization - Tổ chức Y tế giới ii PHỤ LỤC 18: KẾT QUẢ KIỂM TRA DƯỢC LIỆU RỄ BA KÍCH THEO DƯỢC ĐIỂN VIỆT NAM V Tiến hành kiểm tra chất lượng mẫu Ba kích BK1, BK3, BK4 BK5 theo chuyên luận dược liệu rễ Ba kích Dược điển Việt Nam V, kết thu sau: Mô tả Rễ hình trụ trịn hay dẹt, cong queo Mặt ngồi màu nâu xám nâu nhạt, có nhiều vân dọc ngang Nhiều chỗ nứt ngang sâu tới lõi gỗ Mặt cắt có phần thịt dày màu tím xám màu hồng nhạt, lõi gỗ nhỏ màu vàng nâu, vị chát Hình ảnh mẫu Ba kích sau loại bỏ rễ con, rửa sấy tới khô nhiệt độ 50 oC trình bày Hình BK1 BK3 BK4 BK5 Hình Hình thái dược liệu Ba kích Vi phẫu: Dùng lưỡi dao lam cắt dược liệu thành lát mỏng 10 µm đến 20 µm Ngâm lát cắt vào dung dịch javen đến trắng, rửa javen nước cất Tiếp tục PL-59 ngâm lát cắt dung dịch xanh methylen 0,02 % (TT) từ 30 giây đến 60 giây, rửa nhanh lát cắt nước cất Ngâm lát cắt dung dịch đỏ carmin 0,5 % (TT) tới thấy màu bắt rõ, rửa lát cắt nước cất Đặc điểm vi phẫu mẫu Ba kích sau: Mặt cắt ngang hình trịn, cấu tạo từ ngồi vào gồm: - Lớp bần gồm đến hàng tế bào hình chữ nhật xếp thành vòng tròn đồng tâm dãy xuyên tâm, lớp bần thường có tế bào chứa bó tinh thể calci oxalat hình kim - Tế bào mơ cứng xếp liền tạo thành vịng sát lớp bần - Mô mềm vỏ dày, cấu tạo tế bào thành mỏng, xếp lộn xộn, tế bào phần ngồi bị ép bẹp - Phía mô mềm libe, gồm tế bào nhỏ tạo thành vịng liên tục Rải rác mơ mềm libe có bó tinh thể calci oxalat hình kim - Gỗ gồm mạch gỗ lớn xếp thành bó, bó kết hợp với tạo thành lõi hình 5, cạnh Trong mơ gỗ có đám tế bào khơng hóa gỗ Kết đặc điểm vi phẫu mẫu Ba kích trình bày Hình 2, Hình 3, Hình Hình PL-60 1 Bần Tinh thể canxi oxalat hình kim Tế bào mơ cứng Mơ mềm Libe Gỗ Hình 2: Vi phẫu rễ Ba kích BK1 PL-61 1 4 5 6 Bần Mô mềm Tinh thể canxi oxalat hình kim Tế bào mơ cứng Libe Gỗ Hình 3: Vi phẫu rễ Ba kích BK3 PL-62 1 3 4 Bần Tế bào mô cứng Tinh thể canxi oxalat hình kim Mơ mềm Libe Gỗ Hình 4: Vi phẫu rễ Ba kích BK4 PL-63 1 4 5 6 Bần Tinh thể canxi oxalat hình kim Tế bào mơ cứng Mơ mềm Libe Gỗ Hình 5: Vi phẫu rễ Ba kích BK5 Soi bột: PL-64 Lấy lượng nhỏ bột (qua rây có kích thước mắt rây khoảng 250 µm), cho vào giọt nước có sẵn lam kính, dùng kim mũi mác dàn cho bột thấm dung dịch, đậy lam kính, di nhẹ lam kính, dùng giấy thấm lau nước xung quanh lam kính tiêu bản, sau quan sát kính hiển vi Bột màu nâu nhạt, đem soi bột kính hiển vi thấy đặc điểm sau: - Mảnh bần gồm tế bào hình chữ nhật - Mảnh mơ mềm cấu tạo tế bào hình nhiều cạnh thành mỏng, số tế bào chứa bó tinh thể calci oxalat hình kim - Sợi gỗ - Tế bào mơ cứng có loại: + Tế bào mơ cứng thành dày hóa gỗ, lỗ trao đổi rõ + Tế bào mơ cứng thành dày hóa gỗ, lỗ trao đổi rõ, khoang rộng - Nhiều tinh thể calci oxalat hình kim, dài khoảng 0,1 mm đoạn gãy chúng - Rải rác có hạt tinh bột - Mảnh mạch dạng điểm Kết hình ảnh soi bột mẫu Ba kích trình bày Hình 6, Hình 7, Hình Hình PL-65 2a 4a C 6b 2b 4b 6a Bần Mảnh mô mềm Sợi gỗ Tế bào mô cứng Tinh thể calci oxalat hình kim Mảnh mạch điểm Hình Các đặc điểm soi bột rễ Ba kích BK1 PL-66 4a 4b 3a 4c 5a 4d 5b 5c b Bần Mảnh mô mềm Sợi gỗ Tế bào mô cứng Tinh thể calci oxalat hình kim Hạt tinh bột Mảnh mạch điểm Hình Các đặc điểm soi bột rễ Ba kích BK3 PL-67 b 4a 5b a 5a a Bần Mảnh mô mềm Sợi gỗ Tế bào mô cứng Tinh thể calci oxalat hình kim Mảnh mạch điểm Hình Các đặc điểm soi bột rễ Ba kích BK4 PL-68 2a b 4a C 4d 3a 4b 5a 5b Bần Tế bào mô cứng Mảnh mạch điểm Mảnh mô mềm Sợi gỗ Tinh thể calci oxalat hình kim Hạt tinh bột Hình Các đặc điểm soi rễ Ba kích BK5 PL-69 Định tính A Cân xác khoảng 0,15 bột dược liệu Ba kích, tiến hành vi thăng hoa tinh thể màu vàng Khi thêm dung dịch kiềm, ngả màu đỏ tím B Đun sôi 0,10 g bột dược liệu với ml dung dịch natri hydroxyd 10% (TT) ml nước, lọc Thêm acid hydrocloric (TT) phản ứng acid 10 ml ether ethylic (TT), lắc Lớp ether nhuộm màu vàng (Hình 10) Gạn riêng lớp ether, thêm ml dung dịch amoniac đậm đặc (TT), lắc Lớp dung dịch amoniac nhuộm màu đỏ tím bền vững (Hình 11) Hình 10 Lớp dung mơi ether mẫu dược liệu Ba kích Hình 11 Lớp dung môi amoniac mẫu dược liệu Ba kích Các mẫu nghiên cứu cho kết phản ứng có màu lớp dung mơi ether amoniac tương đương với màu mẫu chuẩn Ba kích (lớp dung mơi ether có màu vàng, lớp dung mơi amnoniac có màu đỏ tím) PL-70 C Phương pháp sắc ký lớp mỏng Điều kiện sắc ký: - Bản mỏng silicagel G - Dung môi khai triển: Ether dầu hoả (30o) – ethyl acetat – acid acetic băng (7,5 : 2,5 : 0,25) - Dung dịch thử: Cân khoảng g bột dược liệu, thêm 10 ml nước, lắc để nước thấm dược liệu, để yên 15 phút, nghiền bột dược liệu cối sứ thành bột ướt, thêm 40 ml methanol (TT), cho vào bình cầu miệng mài, đun sôi hồi lưu cách thuỷ 30 phút, lọc, làm bay dung môi đến cạn Thêm ml nước 20 ml ether dầu hoả (30o) (TT), lắc khoảng phút, để lắng, gạn lấy phần dịch chiết ether dầu hoả, làm bay hết dung mơi Hồ cắn ml methanol (TT), làm dung dịch thử Dung dịch đối chiếu: Lấy 5,0123 g dược liệu Ba kích chuẩn tiến hành dung dịch thử Hình Hình ảnh sắc ký đồ SKLM mẫu Ba kích – Phương pháp B Nhận xét: Trên sắc ký đồ mẫu thử vết có Rf màu sắc với vết sắc ký đồ dung dịch đối chiếu Ba kích Độ ẩm Phương pháp sấy Kết kiểm tra độ ẩm mẫu dược liệu Ba kích PL-71 Mẫu Độ ẩm (%) Yêu cầu Kết luận BK1 9,14 Đạt BK3 BK4 11,52 9,74 ≤ 12,0 % Đạt Đạt BK5 10,49 Đạt Tỷ lệ vụn nát Kết kiểm tra tỷ lệ vụn nát mẫu dược liệu Ba kích Mẫu Kết BK3 BK4 Khơng có u cầu ≤ 5,0 % Kết luận BK1 Đạt Đạt Đạt BK5 Đạt 7.Tạp chất Kết kiểm tra tạp chất mẫu dược liệu Ba kích Mẫu Kết Yêu cầu Kết BK1 BK3 BK4 BK5 Khơng có tạp chất; Khơng có dược liệu xơ, hóa gỗ Tạp chất khác: Không 1,0 % Tỷ lệ dược liệu xơ, hóa gỗ, đường kính 0,3 cm: Khơng có Đạt Đạt Đạt Đạt Kết luận chung: mẫu dược liệu BK1, BK3, BK4 BK5 đạt yêu cầu chất lượng theo Dược điển Việt Nam V PL-72 PHỤ LỤC 19: KẾT QUẢ ĐỊNH LƯỢNG MONOTROPEIN TRONG MỘT SỐ DƯỢC LIỆU BA KÍCH Stt Tên mẫu Hàm lượng (%) monotropein tính theo dược liệu khơ kiệt Mẫu 1,7 0,3 Lục Ngạn, Bắc Giang Mẫu 0,7 0,8 Phú Lương, Thái Nguyên Mẫu 0,6 0,8 Tây Giang, Quảng Nam Mẫu 0,5 0,8 Tây Giang, Quảng Nam Mẫu 1,8 1,6 Ba Chẽ, Quảng Ninh Mẫu 0,6 0,4 Đông Giang, Quảng Nam Mẫu 0,3 1,1 Tây Giang, Quảng Nam Mẫu 1,8 0,2 Ba Chẽ, Quảng Ninh Mẫu 0,7 0,9 Đắk Hà – Kon Tum 10 Mẫu 10 1,1 0,2 Phú Lương, Thái Nguyên 11 Mẫu 11 1,1 0,5 Sơn Động, Bắc Giang 12 Mẫu 12 0,9 1,4 Phước Sơn, Quảng Nam 13 Mẫu 13 0,7 1,9 Đông Giang, Quảng Nam 14 Mẫu 14 0,8 1,8 Tây Giang, Quảng Nam 15 Mẫu 15 0,2 0,2 Tây Giang, Quảng Nam 16 Mẫu 16 2,4 1,9 Vân Đồn, Quảng Ninh 17 BK1 1,0 0,7 Lục Ngạn, Bắc Giang 18 BK3 3,1 0,5 Vân Đồn, Quảng Ninh 19 BK4 1,3 0,6 Hoành Bồ, Quảng Ninh 20 BK5 2,1 0,7 Tây Giang, Quảng Nam PL-73 RSD (%) Nơi thu hái