Báo cáo thực tập môn lý sinh bài 4 khảo sát độ bền hồng cầu

KHOA Y - ĐHQG HCM NGÀNH RĂNG - HÀM - MẶT BÁO CÁO THỰC TẬP MÔN: LÝ SINH Bài 4: KHẢO SÁT ĐỘ BỀN HỒNG CẦU Giảng viên hướng dẫn: PGS Huỳnh Chấn Khơn Lớp: RHM2022 Nhóm: Ca: Sinh viên thực hiện: STT Họ Tên MSSV Lê Hạ Thi 227720501037 Phạm Mạnh Tường 227720501042 Nguyễn Phúc An 227720501045 Huỳnh Quốc Thái 227720501020 Hoàng Quốc Việt 227720501053 I GIỚI THIỆU : Khái quát tế bào hồng cầu: Có loại tế bào máu: hồng cầu, bạch cầu tiểu cầu Trong đó, hồng cầu thành phần quan trọng máu Thơng thường có 4-6 triệu số thể người bình thường Hemoglobin phần hồng cầu, mang oxy từ phổi đến mô carbon dioxide từ mô trở lại phổi Nếu tìm thấy bất thường số lượng hồng cầu, dẫn đến nhiều triệu chứng bệnh tật Vì vậy, hồng cầu đóng vai trò quan trọng việc xác định nhiều loại bệnh Màng tế bào màng tế bào hồng cầu: Mọi tế bào hay màng sinh chất nơi diễn hoạt động sống tế bào Nó có chức ngăn cách thành phần bên tế bào với mơi trường ngồi, trao đổi vật chất mơi trường bên ngồi bên tế bào nhằm cung cấp nguyên liệu thải chất cặn bã Màng cịn nơi thu nhận tín hiệu từ bên ngoài, cho phép tế bào biến đổi để đáp lại tương ứng với môi trường xung quanh Để thực chức vậy, màng phải có cấu trúc đặc biệt Theo mơ hình Davson-Danielli màng sinh chất cấu trúc theo mơ hình khảm động, gồm hai lớp lipit protein ngồi, xen kẽ với lớp lipit đơi Ngồi ra, cịn có gluxit Cấu trúc màng sinh chất lipit hầu hết chức đặc biệt màng liên quan đến protein màng Cấu trúc màng tế bào hồng cầu tương tự vậy, có điểm khác biệt bề mặt màng tồn mạng lưới vật chất có nguồn gốc từ protein dạng sợi (lưới spectin,chiếm 30% tổng số protein có bề mặt màng), cấu tạo từ hai chuỗi polipeptit xoắn vào trọng lượng 20000-22000 deltol, ngắn lại duỗi dài nên tế bào hồng cầu thay đổi hình dạng giúp len lỏi qua mao mạch nhỏ li ti khắp thể Những tế bào hồng cầu già tế bào hồng cầu bị thoái hoá chức khả co dãn sợi spectrin bị suy giảm chúng bị tiêu huỷ đại thực bào,chủ yếu gan, lách tuỷ xương Ở trạng thái sinh lý bình thường, màng hồng cầu bền vững Thể tích tế bào thường khơng thay đổi điều tiết tỉ lệ lượng chất hịa tan bên bên ngồi tế bào Chúng ta biết, lượng ion muối hòa tan tế bào số ổn định Do thể tích tế bào phụ thuộc vào lượng ion mơi trường bên ngồi Các loại môi trường? Môi trường ảnh hưởng đến độ bền hồng cầu áp suất thẩm thấu nào? Có ba loại môi trường: môi trường ưu trương, đẳng trương nhược trương - Đẳng trương môi trường mà nồng độ hịa tan với mơi trường nội bào - Ưu trương môi trường mà nồng độ chất tan lớn so với môi trường nội bào - Nhược trương môi trường mà nồng độ chất tan nhỏ so với môi trường nội bào Màng hồng cầu bền môi trường đẳng trương Trong môi trường ưu trương, tế bào nhăn nhúm lại chịu tác động áp suất thẩm thấu từ bên vào Cịn mơi trường nhược trương tế bào trương phồng lên màng bị vỡ phải chịu tác động lực gây áp suất thẩm thấu từ bên làm cho lượng nước tế bào ngày tăng cao cuối giải phóng chất từ nội bào bên ngồi Độ bền màng hồng cầu nồng độ dung dịch muối môi trường nhược trương, xảy tượng tế bào hồng cầu bị huyết tiêu Giới thiệu buồng đếm hồng cầu cách đếm: a Buồng đếm hồng cầu: Cấu tạo chung buồng đếm tế bào gồm phận sau: - Phiến kính dày có xẻ rãnh sâu giữa, rãnh có vng lớn, kích thước x mm Trong ô vuông lớn này, ô vuông bao gồm 25 ô vuông vừa, có kích thước 0,2 x 0,2 mm ô vuông vừa chia thành 16 ô vuông nhỏ - Tổng cộng khu vực đếm có 400 vng nhỏ - Độ sâu buồng đếm 0,02mm - Thể tích: 1mm2 x 0,02mm = 0,02mm3 thể tích vng vừa 0,004mm3 Tuỳ theo loại buồng đếm mà có thêm phận khác Hình vng trung tâm lớn gọi lưới "hồng cầu" Các ô vuông đánh dấu màu đỏ tương đương với 80 ô vuông cực nhỏ áp dụng để đếm tiểu cầu hồng cầu Các ô vuông lớn tô màu xanh quen thuộc để đếm tế bào bạch cầu Một số loại buồng đếm: Improved Neubauer , Fuchs – Rosenthal, Buerker – Tuerk, Thoma, Nageotte, Malassez,… b Cách sử dụng buồng đếm hồng cầu: Bước 1: Pha loãng mẫu cần đếm cho nhỏ buồng đếm có khoảng từ – 10 tế bào (không lớn 10 tế bào nhỏ 2.5 tế bào) Ô lớn từ 10-50 tế bào Bước 2: Đậy lại phiến kính, thao tác tránh bọt khí lọt vài phiến kính Bước 3: Lắc ống nghiệm pha loãng mẫu Dùng Micropipette nhỏ giọt dung dịch mẫu vào buồng đếm, dùng tay tráng nhẹ buồng đếm để mẫu tràn khoang đếm Bước 4: Đặt buồng đếm lên bàn soi kính hiển vi điều chỉnh kính hiển vi phù hợp để tiến hành đếm số lượng tế bào Tuỳ vào số lượng tế bào mà người dùng đếm tất tế bào có đếm tế bào số vng cỡ vừa đại diện Bước 5: Tính số lượng tế bào (mật độ tế bào) Trung bình số lượng hồng cầu = 𝒔ố 𝒕ế 𝒃à𝒐 đế𝒎 đượ𝒄 𝒔ố ô 𝒗𝒖ô𝒏𝒈 (tế bào/ô vuông vừa ) Mật độ hồng cầu = trung bình tế bào hồng cầu đếm x độ pha loãng x 104 (tế bào /mL) II PHƯƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM: Đếm tế bào hồng cầu: Bước 1: Đảm bảo buồng đếm kính phủ làm Trượt kính phủ vào vị trí cần đếm Bước 2: Dung dịch chảy đầy vào buồng đếm Bước 3: Dùng kính hiển vi với vật kính thích hợp để đếm tế bào vùng đặc biệt (theo thứ tự từ trái sang, từ xuống ô thứ 1, 5, 13, 21, 25) Nếu tế bào nằm dịng kẻ đếm tế bào dịng bên phải ô vuông đếm Bước 4: Đếm tế bào quan sát Khảo sát độ bền hồng cầu: a Dụng cụ hóa chất cần thiết • 11 ống nghiệm loại 10ml • 250ml dung dịch NaCl 2% • 500ml nước cất • 250ml dung dịch sinh lý máu nóng pH=7.4 • Tế bào hồng cầu động vật máu nóng (máu gà chống đơng) • pipetman 1000ul, pipet nhỏ giọt, giấy thấm, khăn lau 2.2 Quy trình Bước 1: Pha dung dịch 250ml NaCl 2% Bước 2: Chuẩn bị 11 ống li tâm, đánh dấu theo nồng độ (0; 0.1; 0.2; ; 0.9; 2) Pha dung dịch muối NaCl có nồng độ (%) 0; 0.1; 0.2; 0.3; 0.4; 0.5; 0.6; 0.7; 0.8; 0.9; (mỗi ống 5ml dd NaCl) theo công thức: V1.C1 = V2.C2 Ví dụ: Cần pha 5ml dung dịch NaCl có nồng độ 0,1 %, ta có: V1.C1 = V2.C2 ⇔ V1 x = x 0.1⇔ V1 = VNaCl 2% cần lấy = 0.25 Suy cần lấy thêm 4.75 ml nước cất để thu 5ml dung dịch NaCl 0.1% từ dung dịch NaCl 2% Tương tự với ống lại sau: CNaCl sau 0.1 0.2 0.3 0.4 4.75 4.5 4.25 0.25 0.5 0.75 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 3.75 3.5 3.25 2.75 1.25 1.5 1.75 2.25 (%) VNước (ml) VNaCl 2% (ml) Bước 3: Cho 2ml PBS vào ống nghiệm chứa máu gà lắc nhẹ; sau li tâm 2000 vịng/phút phút Thu hỗn hợp gồm phần: phần huyết tương (màu đỏ nhạt phía trên) hồng cầu (đỏ đậm phía dưới) Dùng Micropipette chỉnh mức 200 500 μl để loại bỏ huyết tương; lặp lại lần lần Cuối thu hồng cầu; cho thêm 2ml PBS vào hồng cầu lắc nhẹ Bước 4: Nhỏ giọt hồng cầu vào ống nghiệm chứa dung dịch NaCl pha; lắc nhẹ ủ vòng 30 phút nhiệt độ phòng; sau li tâm 2000 vịng/phút phút Bước 5: Sau li tâm, quan sát màu dịch; chọn ống nghiệm chứa dung dịch NaCl 0; 0,5; 0,9; 2% đại diện cho tế bào hồng cầu môi trường ưu trương, hồng cầu bắt đầu vỡ, đẳng trương nhược trương Lần lượt cho mẫu dung dịch lên lame quan sát kính hiển vi ghi nhận kết IV KẾT QUẢ: Khảo sát độ bền hồng cầu: - 11 ống nghiệm: + Trước ủ, li tâm: + Sau ủ, li tâm: + Ống 0; 0,1 (lần - có sai số q trình thí nghiệm dẫn tới tượng thu khơng hợp lí) Nồng độ NaCl (%) Màu sắc quan sát Tình trạng hồng cầu dung dịch (soi kính hiển vi) 0.5 10 Nồng độ NaCl (%) Màu sắc quan sát Tình trạng hồng cầu dung dịch (soi kính hiển vi) 0.9 11 Đếm hồng cầu: • Buồng 1: 40 tế bào • Buồng 5: 21 tế bào 12 • • Buồng 13: 28 tế bào Buồng 21: 50 tế bào 13 • Buồng 25: 15 tế bào Mật độ hồng cầu = trung bình tế bào hồng cầu đếm * độ pha loãng * 10000 𝟒𝟎5𝟐𝟏5𝟐𝟖5𝟓𝟎5𝟏𝟓 =( )*400*10.000 = 123.200.000 (tế bào/mL) : 14 IV Thảo luận • Trước ủ, li tâm: ống khơng có nhiều khác biệt màu sắc tượng • Sau ủ, li tâm: theo tỉ lệ hồng cầu tăng dần (0->2%), màu đỏ ống nghiệm nhạt dần, tới 0,6% chuyển sang suốt 15 • Giải thích: Trong mơi trường nhược trương (từ đến >0,9%), tế bào hồng cầu bị vỡ nồng độ chất tan bên tế bào cao nồng độ bên ngoài, nước từ bên vào tế bào để pha loãng bên Khi nước di chuyển vào tế bào, làm tăng áp lực bên làm cho tế bào sưng lên vỡ dẫn đến ống nghiệm có màu đỏ Tại nồng độ 0,5%, tế bào hồng cầu bắt đầu vỡ Xuống tới nồng độ 0% Nacl, tế bào hồng cầu vỡ hồn tồn • Ở dung dịch Nacl 0,9% hay gọi nước muối sinh lý, tế bào hồng cầu có hình dạng ổn định môi trường đẳng trương, nồng độ chất tan bên bên ngồi • Trong mơi trường ưu trương (0,9-2%), dung dịch bên tế bào chứa nồng độ cao dung dịch bên tế bào.các tế bào hồng cầu bị thu nhỏ, hẹp lại Vì mơi trương bên ngồi có nồng độ cao hơn, buộc nước phải di chuyển từ bên tế bào ngồi qua màng tế bào để pha lỗng dung dịch bên Dẫn đến tế bào hồng cầu co lại trở nên méo mó 16 V Tài liệu tham khảo Các phương pháp đếm tế bào xét nghiệm huyết học - Phần - Phương pháp đếm tế bào trở kháng (2020, 04 15) Được truy lục từ Phương Đông: https://tbytphuongdong.com.vn/cac-phuong-phap-dem-te-bao-trong-xetnghiem-huyet-hoc-phan-1-phuong-phap-dem-te-bao-tro-khang Shiwnarain, M (2018, 28) Hypertonic Vs Hypotonic Vs Isotonic Được truy lục từ Science Trends: https://sciencetrends.com/comparing-hypertonic-vshypotonic-vs-isotonic/ Buồng đếm tế bào Neubauer - Cách sử dụng cấu tạo (2018, 11 18) Được truy lục từ https://nguyenviettrieu.vn/blogs/news/buong-dem-te-bao-neubauercach-su-dung-va-cau-tao Buồng đếm tế bào gì? Cách sử dụng nơi cung cấp buồng đếm tế bào uy tín (khơng ngày tháng) Được truy lục từ https://tschem.com.vn/buong-demte-bao/ Spilling the secrets: how to count cells with a hemocytometer (2022) ChemoMetec BioNetwork (2012, 31) Counting Cells with a Hemocytometer Được truy lục từ Youtube: https://www.youtube.com/watch?v=pP0xERLUhyc 17