Untitled BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ Nguyễn Phƣơng Vũ HOÀN THIỆN QUY TRÌNH TINH CHẾ HUYẾT THANH KHÁNG DẠI (SAR) BẰNG PHƢƠNG PHÁP S[.]
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ - Nguyễn Phƣơng Vũ HỒN THIỆN QUY TRÌNH TINH CHẾ HUYẾT THANH KHÁNG DẠI (SAR) BẰNG PHƢƠNG PHÁP SẮC KÝ TRAO ĐỔI ION LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Hà Nội - 2021 BỘ GIÁO DỤC VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ ĐÀO TẠO VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ - Nguyễn Phƣơng Vũ HOÀN THIỆN QUY TRÌNH TINH CHẾ HUYẾT THANH KHÁNG DẠI (SAR) BẰNG PHƢƠNG PHÁP SẮC KÝ TRAO ĐỔI ION Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 8420114 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC TS Dƣơng Hữu Thái TS Huỳnh Hoàng Nhƣ Khánh Hà Nội - 2021 L I CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan Luận văn Th c s “Hồn thiện quy trình tinh chế huyết kháng dại (SAR) phƣơng pháp sắc ký trao đổi ion”là cơng trình nghiên cứu riêng cá nhân nh m nghiên cứu, không chép Do nh m nghiên cứu tự nghiên cứu, đọc, dịch tài liệu, tổng hợp thực Nội dung lý thuyết luận văn c sử dụng số tài liệu tham khảo nhƣ trình bày phần tài liệu tham khảo Các số liệu, chƣơng trình phần mềm kết luận văn trung thực chƣa đƣợc cơng bố cơng trình khác Tơi xin hồn tồn chịu trách nhiệm trƣớc Học viện Khoa học Công nghệ phát sai ph m hay chép đề tài này! Hà Nội, ngày 22 tháng 11 năm 2021 Học viên Nguyễn Phƣơng Vũ L I CẢM ƠN Đề tài đƣợc thực t i Viện Vắc xin Sinh ph m Y tế IV C , nơi làm việc, học tập nghiên cứu Viện đƣợc phân chia thành phòng chức chuyên biệt nhƣ nghiên cứu, sản xuất, đ ng g i,… Trong thời gian thực đề tài, đƣợc trực tiếp tham gia học hỏi, thực hành nhiều giai đo n khác quy trình sản xuất huyết kháng d i S R Tôi nhận đƣợc nhiều hỗ trợ từ cán hƣớng dẫn anh chị em phòng Huyết phòng Ki m định Tôi xin chân thành cảm ơn Viện trƣởng TS Dƣơng Hữu Thái hƣớng dẫn t o điều kiện cho tơi suốt q trình học tập làm luận văn t i Viện IV C Tôi xin cảm ơn lãnh đ o, ban giám hiệu Học viện Khoa học Cơng nghệ, phịng Đào t o tồn th thầy khoa Cơng nghệ Sinh học t o điều kiện cho tơi hồn thành tốt cơng việc nghiên cứu khoa học Cảm ơn phụ trách phòng Huyết ThS Dƣơng Tuấn Hiệp TS Huỳnh Hồng Nhƣ Khánh, quan tâm, hỗ trợ kiến thức, tinh thần, giúp đỡ thiết kế bố trí thí nghiệm cho tơi, nhƣ phụ giúp vào ngày miệt mài viết luận văn Đƣợc giúp đỡ nhiệt tình ngƣời, tơi hồn thành luận văn thời h n Học viện Cuối cùng, xin cảm ơn gia đình ln hỗ trợ vật chất tinh thần suốt thời gian năm học th c s qua Tôi xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 22 tháng 11 năm 2021 Học viên Nguyễn Phƣơng Vũ DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT IVAC : Institute of Vaccines and Medical Biologicals WHO : World Health Organization SDS-PAGE : Sodium Dodecyl Sulphate-Polyacrylamide Gel Electrophoresis IgG : Immunoglobulin SE-HPLC : Size Exclusion High-Performance Liquid Chromatography SAR : Serum antirabique (huyết kháng d i) CV : Column Volumn RNP : Ribonucleoprotein RIG : Rabies Immune Globulin PEP : Pre-exposure prophylaxis RNA : Ribonucleic acid DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1.Sự khác biệt d ng sắc ký trao đổi ion 22 ảng 2.1 Kết tiêu chu n chất lƣợng lô 13.18 R 32 ảng 2.2 Danh sách h a chất dùng tinh chế 33 ảng 2.3 Danh sách thiết bị dụng cụ 33 ảng 3.1.Kết thử nghiệm dung dịch đệm 20mM Acetate + 50mM NaCl 49 ảng 3.2 Kết thử nghiệm dung dịch đệm 20mM Phosphate + 50mM NaCl 51 ảng 3.3 Kết khả bám mẫu vào cột với n ng độ protein mg ml lô thử nghiệm 55 ảng 3.4 Kết khả bám mẫu vào cột với n ng độ protein mg ml lô thử nghiệm 56 ảng 3.5 Kết khả bám mẫu vào cột với n ng độ protein mg ml lô thử nghiệm 56 ảng 3.6 Kết hàm lƣợng protein sau sắc ký mẫu 60 ảng 3.7 Kết tăng trọng trung bình chuột thử nghiệm an toàn chung 62 ảng 3.8 Kết ki m tra chất gây sốt huyết SAR tinh s ch sắc ký 62 ảng 3.9 Tiêu chu n chất lƣợng sở sản ph m huyết kháng d i sau tinh s ch phƣơng pháp sắc ký trao đổi ion 64 ảng 3.1 Các thơng số quy trình tinh s ch huyết kháng d i phƣơng pháp sắc ký trao đổi ion 65 Bảng 3.11 Chất lƣợng huyết kháng d i sử dụng quy trình cũ 67 Bảng 3.12 Chất lƣợng huyết kháng d i sử dụng quy trình tinh s ch đƣợc thiết lập 68 DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 1.1 Vi rút d i Hình 1.2 Hình thái, cấu trúc vi rút d i Hình 1.3.Cấu trúc F ab 12 Hình 1.4.Nguyên tắc sắc ký lọc gel 13 Hình 1.5 H t gel liên kết Protein A, sử dụng tinh chế kháng th 15 Hình 1.6 Vị trí Fc IgG với protein A 16 Hình 1.7 Nguyên tắc sắc ký kỵ nƣớc 18 Hình 1.8 Cơ chế sắc ký trao đổi ion 19 Hình 1.9 Các giai đo n trình trao đổi ion 23 Hình 1.1 Nguyên tắc sắc ký trao đổi Cation 24 Hình 1.11 Cơ chế thay đổi điện tích bề mặt protein theo pI 25 Hình 1.12 Nguyên tắc sắc ký trao đổi Anion 26 Hình 3.1 Phổ đ ch y máy sắc ký dung dịch đệm 20mM Acetate + mM NaCl lô S R_SK 48 Hình 3.2 Phổ đ ch y máy sắc ký dung dịch đệm 20mM Phosphate + mM NaCl lô P1 S R_SK 50 Hình 3.3 Kết ki m tra độ s ch kháng th lô 13.18 R M Đ phƣơng pháp SE-HPLC 52 Hình 3.4 Kết ki m tra độ s ch kháng th huyết kháng d i chứa dung dịch đệm cetate lô S R_SK phƣơng pháp SE-HPLC 53 Hình 3.5 Kết ki m tra độ s ch kháng th huyết kháng d i chứa dung dịch đệm phosphate lô P1 S R_SK phƣơng pháp SE-HPLC 53 Hình 3.6 Kết điện di SDS-PAGE dịch protein sau tinh s ch lo i dung dịch đệm sau lần thử nghiệm so với mẫu ban đầu mẫu thơ 54 Hình 3.7 Kết điện di SDS-PAGE dịch protein sau tinh s ch khả bám mẫu dung dịch đệm cetate 57 Hình 3.8 Kết định tính kháng th F ab ngựa 58 Hình 3.9 Kết độ tinh s ch lô S R_SK 59 Hình 3.1 Kết độ tinh s ch lô S R_SK 59 Hình 3.11 Kết độ tinh s ch lô A80.03/SAR_SK 60 Hình 3.12 Kết điện di SDS-PAGE lô huyết SAR đƣợc tinh chế thử nghiệm theo quy trình tinh chế thiết lập so với mẫu Ấn Độ mẫu Pháp 69 Hình 3.13 Đ thị độ tinh s ch huyết kháng d i lô tinh s ch thử nghiệm, Ấn Độ, Sanofi-Pháp 70 Hình 3.14 Đ thị hàm lƣợng endotoxin lơ sử dụng quy trình chƣa tinh s ch lơ sử dụng quy trình tinh s ch thiết lập 71 Hình 3.15 Đ thị hàm lƣợng protein lơ sử dụng quy trình chƣa tinh s ch lơ sử dụng quy trình tinh s ch thiết lập 71 Hình 3.16 Hình ảnh cảm quan lơ 7.19 R mẫu trƣớc tinh s ch lô 02.21/AR_SK_TC (mẫu sau tinh s ch) 72 MỤC LỤC LỜI C M ĐO N LỜI CẢM ƠN DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC BẢNG DANH MỤC HÌNH ẢNH MỤC LỤC MỞ ĐẦU CHƢƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 T NG QU N VỀ NH DẠI 1.1.1 Sơ lƣợc bệnh d i 1.1.2 Tác nhân gây bệnh 1.1.3 Tình hình bệnh d i 1.1.4 Các biện pháp phòng ngừa 1.1.5 Sản xuất huyết kháng d i S R 11 1.2 C NG NGH SẮC K 13 1.2.1 Khái niệm 13 1.2.2 Các kỹ thuật sắc ký tinh s ch protein 14 1.3 TINH SẠCH PROTEIN BẰNG KỸ THUẬT SẮC K 27 1.3.1 Giới thiệu 27 1.3.2 Nguyên lý chung 27 1.3.3 Các bƣớc thực 27 1.4 ỨNG DỤNG KỸ THUẬT SẮC K TINH CHẾ HUYẾT TH NH KHÁNG DẠI 29 1.4.1 Các nghiên cứu giới 29 1.4.2 Các nghiên cứu nƣớc 30 CHƢƠNG NGUY N VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHI N CỨU 32 2.1 NGUY N VẬT LI U 32 2.1.1 Nguyên liệu 32 2.1.2 Gel sắc ký sinh ph m 32 2.1.3 H a chất 33 2.1.4 Thiết bị dụng cụ 33 2.2 PHƢƠNG PHÁP NGHI N CỨU 34 2.2.1 Thiết kế nghiên cứu 34 2.2.2 Tinh s ch huyết kháng d i 37 2.2.3 Các phƣơng pháp đánh giá chất lƣợng huyết kháng d i 40 2.2.4 PHƢƠNG PHÁP XỬ L SỐ LI U 47 CHƢƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 48 3.1 THIẾT LẬP QUY TRÌNH Ở GI I ĐOẠN TINH SẠCH ẰNG SẮC K TR O Đ I ION 48 3.1.1 Kết thử nghiệm dung dịch đệm 48 3.1.2 Kết thử nghiệm khả bám mẫu 55 3.1.3 Đánh giá chất lƣợng huyết S R sau tinh s ch sắc ký trao đổi ion xây dựng tiêu chu n chất lƣợng sở 58 3.1.4 Xây dựng thơng số quy trình sắc ký trao đổi ion 65 3.2 TINH CHẾ THỬ NGHI M VÀ ĐÁNH GIÁ CHẤT LƢ NG HUYẾT TH NH KHÁNG DẠI ẰNG PHƢƠNG PHÁP SẮC K TR O Đ I ION Đ THIẾT LẬP 66 CHƢƠNG KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGH 75 4.1 KẾT LUẬN 75 4.2 KIẾN NGH 75 TÀI LIỆU THAM KHẢO 76 PHỤ LỤC Kết khảo sát t lệ ám mẫu 60 mg/ml - Lần - Lần 2: - Lần 3: Kết tinh thử nghiệm lô: - Lô 1.21 R-SK-TC - Lô 2.21 R-SK-TC - Lô 3.21 R-SK-TC - Lô 4.21 R-SK-TC - Lô 5.21 R-SK-TC Kết mẫu huyết kháng dại Pháp: Kết mẫu huyết kháng dại Ấn Độ: Phụ lục 2: Kết Western lot Kết Western blot lô tinh s ch thử nghiệm Mẫu – Marker 240 140 Mẫu – BTP Mẫu – 01.21/SAR-SKTC Mẫu – 02.21/SAR-SKTC 110 Mẫu – 03.21/SAR-SKTC 75 Mẫu – 04.21/SAR-SKTC Mẫu – 05.21/SAR-SK- 50 TC Mẫu – Mẫu Favirab-Pháp Mẫu – Mẫu Ấn Độ Kết luận: Các mẫu SAR sắc ký tinh chế chứa F ab ngựa với mẫu chứng huyết Pháp Ấn Độ huyết Phụ lục 3: Kết an toàn chung Kết an toàn chung x y dựng tiêu chuẩn chất lƣợng sở - ảng theo dõi trọng lƣợng triệu chứng chuột nhắt sau tiêm TT Ký hiệu chuột Lô A80.01/SAR_SK Lô A80.02/SAR_SK Lô A80.03/SAR_SK Trọng lƣợng chuột gam Trọng lƣợng chuột gam Trọng lƣợng chuột gam Trƣớc tiêm Sau ngày Triệu chứng sau tiêm Triệu chứng Trƣớc tiêm Sau ngày sau tiêm Trƣớc tiêm Sau ngày Triệu chứng sau tiêm 01 Đầu vàng 19.76 30.82 Không 20.42 31.15 Không 20.68 32.16 Không 02 Đuôi vàng 20.12 32.04 Không 19.75 31.67 Không 20.54 31.89 Không 03 Lƣng vàng 20.56 31.69 Không 19.87 30.74 Không 19.82 31.58 Không 04 Sọc vàng 19.23 30.75 Không 20.45 31.78 Không 20.26 31.43 Không 05 Trắng 19.65 30.64 Không 20.89 32.19 Không 20.57 31.68 Không - ảng theo dõi trọng lƣợng triệu chứng chuột lang sau tiêm Lô A80.01/SAR_SK TT Ký hiệu chuột Trọng lƣợng chuột gam) Trƣớc Sau tiêm ngày Triệu chứng Lô A80.02/SAR_SK Trọng lƣợng chuột gam) sau tiêm Trƣớc Sau tiêm ngày Lô A80.03/SAR_SK Trọng lƣợng chuột Triệu chứng sau tiêm (gam) Trƣớc Sau tiêm ngày Triệu chứng sau tiêm 01 Đầu vàng 305 350 Không 290 325 Không 330 365 Không 02 Lƣng vàng 310 345 Không 295 345 Khơng 330 370 Khơng Kết an tồn chuột nhắt lô tinh s ch liên tiếp Lô 01 21/AR-SK-TC Ký hiệu TT chuột Lô 02 21/AR-SK-TC Lô 03 21/AR-SK-TC Lô 04 21/AR-SK-TC Lô 05 21/AR-SK-TC Trọng lƣợng chuột gam) Triệu Trọng lƣợng Triệu Trọng lƣợng Triệu Trọng lƣợng Triệu Trọng lƣợng Triệu chứng chuột gam) chứng chuột gam) chứng chuột gam) chứng chuột gam) chứng sau sau Trƣớc Sau sau Trƣớc Sau sau sau Trƣớc Sau Trƣớc Sau Trƣớc Sau tiêm tiêm tiêm ngày tiêm ngày tiêm ngày tiêm tiêm ngày tiêm tiêm ngày tiêm 01 Đầu vàng 19.17 24.50 Không 20.10 29.80 Không 20.89 30.80 Không 18.60 27.20 Không 18.50 29.20 Không 02 Đuôi vàng 20.20 24.90 Không 20.40 32.80 Không 20.25 31.10 Không 17.0 27.30 Không 17.40 29.40 Không 03 Lƣng vàng 17.47 22.59 Không 20.53 33.80 Không 20.45 31.30 Không 19.0 27.60 Không 19.20 29.20 Không 04 Sọc vàng 19.20 25.17 Không 20.45 31.40 Không 19.87 05 Trắng 17.30 22.56 Không 19.52 25.80 Không 19.76 30.50 Không 32.0 Không 18.40 17.2 27.0 Không 18.20 24.8 Không 18.60 28.60 Khơng 28.0 Khơng Kết an tồn chuột lang lô tinh s ch thử nghiệm liên tiếp TT Lô 01 21/AR-SK-TC Lô 02 21/AR-SK-TC Lô 03 21/AR-SK-TC Lô 04 21/AR-SK-TC Lô 05 21/AR-SK-TC Trọng lƣợng Trọng lƣợng Trọng lƣợng Trọng lƣợng Trọng lƣợng Ký hiệu chuột gam) chuột Trƣớc Sau 01 02 Đầu vàng Lƣng vàng Triệu chứng sau tiêm ngày tiêm 330 350 320 370 chuột gam) Trƣớc Sau Triệu chứng chuột gam) sau Trƣớc Sau tiêm ngày tiêm tiêm Không 330 365 Không 310 335 Không 320 365 Không 310 350 ngày Triệu chứng sau tiêm chuột gam) Trƣớc Sau Triệu chứng sau tiêm ngày tiêm Không 300 350 Không 295 330 chuột gam) Trƣớc Sau Triệu chứng sau tiêm ngày tiêm Không 340 390 Không Không 350 420 Khơng Kết tiêm thử nghiệm thăm dị dung dịch NaCl 9% cho thỏ lần tinh s ch Mẫu tinh Lần Lần Lần Số th C n n ng (kg) 5 2,0 2,0 1,9 1,9 2,0 1,9 1,9 1,9 2,0 2,0 2,0 2,0 1,9 1,9 2,0 Số lƣợng tiêm 10 ml dung dịch NaCl 0.9%/kg (ml) 2,0 2,0 1,9 1,9 2,0 1,9 1,9 1,9 2,0 2,0 2,0 2,0 1,9 1,9 2,0 Đo nhiệt độ lần (0C) – trƣớc tiêm Đo nhiệt độ lần (0C) – gi sau tiêm Dao động so với nhiệt độ an đầu ≤0 60C) Chọn X) /loại (O) 39.1 39.5 39.0 39.1 39.6 39.2 39.1 39.1 39.5 39.8 39.0 39.2 39.1 39.0 39.4 39.1 39.2 39.5 39.2 39.7 39.6 39.3 39.0 39.3 39.5 39.2 39.1 39.1 39.3 39.2 0.3 0.5 0.1 0.1 0.4 0.2 0.1 0.2 0.3 0.2 0.1 0.3 0.2 X X O X O O X X X O X X X O O Phụ lục 4: Phổ đồ trình chạy mẫu Phổ đồ chạy máy sắc ký tinh dung dịch đệm 20 mM Acetate + 50 mM NaCl - Lần - Lần Phổ đồ chạy máy sắc ký tinh dung dịch đệm 20 mM Phosphate + 50 mM NaCl - Lần - Lần