i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan số liệu kết nghiên cứu luận văn trung thực chƣa đƣợc sử dụng để bảo vệ học vị Mọi giúp đỡ cho việc thực luận văn đƣợc cảm ơn thơng tin trích dẫn luận văn đƣợc rõ nguồn gốc rõ ràng đƣợc phép cơng bố Tp Hồ Chí Minh, ngày 19 tháng 04 năm 2021 Học viên thực Hồ Nguyễn Quỳnh Chi ii LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành luận án này, tơi xin bày tỏ lịng cảm ơn sâu sắc đến Thầy PGS.TS Hồng Nghĩa Sơn, ngƣời ln tận tâm dẫn, tạo điều kiện cho học tập, nghiên cứu hoàn chỉnh đề tài Xin chân thành cảm ơn Học Viện Khoa học Công nghệ tạo điều kiện thuận lợi để thực đề tài Xin chân thành cảm ơn Ban Lãnh đạo Viện Sinh học Nhiệt đới tạo điều kiện thuận lợi để thực đề tài Xin chân thành cảm ơn đề tài: “Nghiên cứu đánh giá thay đổi cấu trúc khung tế bào thể sống điều kiện mô trạng thái vi trọng lực (simulated microgravity)”, thuộc Chƣơng trình Khoa học công nghệ vũ trụ, mã số: CNVT/16-20 hỗ trợ cho nghiên cứu Tôi xin gởi lời cảm ơn sâu sắc tới TS Lê Thành Long, ngƣời hƣớng dẫn tận tình giúp tơi có hội đƣợc thực đề tài Tôi xin cảm ơn Thầy, Cô, anh chị đồng nghiệp, bạn sinh viên nghiên cứu Viện Sinh học Nhiệt đới ln động viên giúp đỡ tơi q trình cơng tác nghiên cứu Con xin cảm ơn ba, mẹ, em bên con, động viên lúc khó khăn Tp HCM, ngày 19 tháng 04 năm 2021 Hồ Nguyễn Quỳnh Chi iii MỤC LỤC Trang LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN .ii MỤC LỤC iii DANH MỤC THUẬT NGỮ VIẾT TẮT vi DANH MỤC BẢNG viii DANH MỤC HÌNH ix TÓM TẮT xii MỞ ĐẦU CHƢƠNG TỔNG QUAN 1.1 Vai trò nghiên cứu sinh học không gian 1.2 Giới thiệu vi trọng lực vi trọng lực mô 1.2.1 Vi trọng lực 1.2.2 Vi trọng lực mô 1.3 Các hệ thống mô vi trọng lực 1.3.1 Clinostat 10 1.3.2 Buồng quay 13 1.3.3 Máy định vị ngẫu nhiên 14 1.4 Tế bào gốc trung mô cuống rốn 15 1.4.1 Khái niệm 15 1.4.2 Lợi ích tế bào gốc trung mô cuống rốn 16 1.5 Sự tăng sinh tế bào 17 1.5.1 Định nghĩa 17 1.5.2 Các yếu tố điều hòa chu kỳ tế bào 18 1.5.3 Các nghiên cứu ảnh hưởng vi trọng lực lên tăng sinh tế bào 19 1.6 Quá trình apoptosis 20 1.6.1 Khái niệm 20 1.6.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến apoptosis 22 1.6.3 Phương pháp đánh giá apoptosis 23 1.7 Nhân tế bào chất 26 iv 1.7.1 Định nghĩa vai trò nhân tế bào chất 26 1.7.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến hình thái nhân tế bào chất 26 1.8 Bộ khung xƣơng tế bào 27 1.8.1 Khái niệm 27 1.8.2 Cấu trúc khung xương tế bào 27 1.8.3 Các nghiên cứu ảnh hưởng vi trọng lực lên khung xương tế bào 29 CHƢƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 31 2.1 Vật liệu 31 2.1.1 Thiết bị dụng cụ cần thiết 31 2.1.2 Mơi trường hóa chất sử dụng 32 2.1.3 Tế bào gốc trung mô 33 2.1.4 Hệ thống vi trọng lực mô (clinostat 3D) 33 2.2 Nội dung phƣơng pháp nghiên cứu 35 2.2.1 Nuôi cấy tế bào 36 2.2.1.1 Phương pháp giải đông 36 2.2.1.2 Phương pháp cấy chuyền 36 2.2.1.3 Phương pháp đông lạnh 36 2.2.2 Đánh giá thị marker tế bào gốc trung mô 37 2.2.3 Thử nghiệm vi trọng lực 38 2.2.4 Đánh giá tăng sinh tế bào 39 2.2.4.1 Đánh giá mật độ tế bào 39 2.2.4.2 Đánh giá chu kỳ tế bào 39 2.2.5 Đánh giá trình apoptosis 44 2.2.5.1 Thu hoạch tế bào 44 2.2.5.2 Đánh giá tỉ lệ apoptosis 44 2.2.5.3 Đánh giá biểu mức phiên mã gene liên quan đến apoptosis 45 2.2.6 Đánh giá thay đổi hình thái nhân tế bào chất 46 2.2.6.1 Thu hoạch cố định tế bào 46 2.2.6.2 Đánh giá thay đổi hình thái nhân 46 2.2.6.3 Đánh giá thay đổi hình thái tế bào chất 46 2.2.7 Đánh giá thay đổi cấu trúc khung xương tế bào 47 2.2.7.1 Thu hoạch tế bào 47 v 2.2.7.2 Đánh giá biểu mức phiên mã gene mã hóa vi ống, vi sợi 47 2.2.7.3 Đánh giá biểu mức dịch mã gene mã hóa vi ống, vi sợi 48 2.2.7.4 Đánh giá tái cấu trúc khung vi ống, vi sợi tế bào 49 2.2.8 Phương pháp thống kê 50 CHƢƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 51 3.1 Đánh giá thị marker tế bào gốc trung mô 51 3.2 Đánh giá tăng sinh tế bào 52 3.2.1 Sự thay đổi mật độ tế bào 52 3.2.2 Sự thay đổi chu kỳ tế bào 53 3.2.2.1 Tỉ lệ pha chu kỳ tế bào 53 3.2.2.2 Biểu mức độ phiên mã gene điều hòa chu kì tế bào 54 3.2.2.3 Biểu mức độ dịch mã gene điều hịa chu kì tế bào 55 3.3 Đánh giá trình apoptosis 58 3.3.1 Tỉ apoptosis 58 3.3.2 Biểu mức phiên mã gene liên quan đến apoptosis 58 3.4 Đánh giá thay đổi hình thái tế bào 59 3.4.1 Sự thay đổi hình thái nhân 59 3.4.2 Sự thay đổi hình thái tế bào chất 63 3.5 Đánh giá cấu trúc khung xƣơng tế bào 66 3.5.1 Biểu mức phiên mã gene mã hóa vi ống, vi sợi 66 3.5.2 Biểu mức dịch mã gene mã hóa vi ống, vi sợi 67 3.5.3 Đánh giá tái cấu trúc khung vi ống, vi sợi tế bào 67 3.6 Tóm tắt ảnh hƣởng vi trọng lực mô lên tế bào hucMSC phƣơng thức ức chế tăng sinh tế bào môi trƣờng vi trọng lực mô 73 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 77 DANH MỤC CƠNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ 78 TÀI LIỆU THAM KHẢO 79 PHỤ LỤC vi DANH MỤC THUẬT NGỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Tiếng Anh Tiếng Việt 7-AAD 7-amino-actinomycin 7-amino-actinomycin ATP Adenosine triphosphate Adenosine triphosphate Bax Bcl-2-associated X protein Protein X liên kết Bcl-2 Bcl-2 B-cell lymphoma Protein lymphoma tế bào B-2 bmMSC Bone marrow mesenchymal Tế bào gốc trung mô tủy xƣơng stem cell CDKs Cyclin-dependent kinases Kinase phụ thuộc cyclin DMEM Dulbecco's modified Eagle Môi trƣờng Dulbecco's modified medium Eagle DNA Deoxyribonucleic acid Axit deoxyribonucleic FBS Fetal bovine serum Huyết thai bò GVHD Graft versus host disease Bệnh ghép chống chủ hucMSC Human umbilical cord Tế bào gốc trung mô cuống rốn mesenchymal stem cell ngƣời International Society for Hiệp hội liệu pháp tế bào quốc Cellular Therapy tế Laser scanning confocal Kính hiển vi quét laser đồng tiêu ISCT LSCM microscopy mRNA Messenger ribonucleic acid Axit ribonucleic thông tin MSC Mesenchymal stem cell Tế bào gốc trung mô NASA National Aeronautics and Cơ quan Hàng không Vũ trụ Space Administration Hoa Kỳ OD Optical density Mật độ quang PBS Phosphate-buffered saline Phosphate-buffered saline Pen/Strep Penicillin-Streptomycin Penicillin-Streptomycin PI Propidium iodide Propidium iodide PS Phospholipid Màng phospholipid phosphatidylserine phosphatidylserine Polyvinylidene fluoride Polyvinylidene fluoride PVDF vii qRT-PCR Quantitative reverse Phản ứng định lƣợng chuỗi transcription polymerase chain polymerase phiên mã ngƣợc reaction RNA Ribonucleic acid Axit ribonucleic RPM Random positioning machine Máy định vị ngẫu nhiên RWV Rotating wall vessel Buồng quay SDS-PAGE Sodium dodecyl sulfate– Điện di gel sodium dodecyl polyacrylamide gel sulfate–polyacrylamide electrophoresis SMG Simulated microgravity Vi trọng lực mô TEM Transmission electron Kính hiển vi truyền qua microscopy TUNEL ucMSC Terminal dUTP Nick End- Kĩ thuật gắn nhãn cuối dUTP Labeling Nick Umbilical cord mesenchymal Tế bào gốc trung mô cuống rốn stem cell viii DANH MỤC BẢNG Trang Bảng 2.1 Một số thiết bị sử dụng đề tài 31 Bảng 2.2 Một số dụng cụ sử dụng đề tài 31 Bảng 2.3 Mơi trƣờng, hóa chất sử dụng đề tài 32 Bảng 2.4 Chu trình nhiệt phản ứng Realtime qRT-PCR cho gene điều hịa chu kì tế bào 42 Bảng 2.5 Trình tự mồi gene điều hịa chu kì tế bào 42 Bảng 2.6 Chu trình nhiệt phản ứng Realtime qRT-PCR cho gene liên quan đến apoptosis 45 Bảng 2.7 Trình tự mồi gene liên quan đến apoptosis 45 Bảng 2.8 Chu trình nhiệt phản ứng Realtime qRT-PCR cho gene mã hóa khung xƣơng tế bào 47 Bảng 2.9 Trình tự mồi gene mã hóa khung xƣơng tế bào 47 ix DANH MỤC HÌNH Trang Hình 1.1 Ngun lý hệ thống clinostat 2D 11 Hình 1.2 Mơ hình clinostat 2D 12 Hình 1.3 Mơ hình clinostat 3D 12 Hình 1.4 Mơ hình buồng quay (rotating wall vessel-RWV) 13 Hình 1.5 Mơ hình máy định vị ngẫu nhiên (RPM) 14 Hình 1.6 Cấu trúc cuống rốn ngƣời 16 Hình 1.7 Chu kỳ tế bào 18 Hình 1.8 Hình ảnh tế bào chuột biểu apoptosis dƣới kính hiển vi quang học 21 Hình 1.9 Hình ảnh tế bào tuyến ức dƣới kính hiển vi điện tử 22 Hình 1.10 Thành phần cấu trúc khung xƣơng tế bào 28 Hình 2.1 Cấu trúc hệ thống máy clinostat 3D tạo môi trƣờng vi trọng lực mơ phỏng33 Hình 2.2 Sơ đồ tóm tắt nội dung nghiên cứu 35 Hình 2.3 Bình ni tế bào hucMSC thử nghiệm vi trọng lực 38 Hình 2.4 Đĩa 96 giếng chứa tế bào hucMSC thử nghiệm vi trọng lực 38 Hình 2.5 Đĩa nuôi hucMSC đƣợc sử dụng phƣơng pháp WST-1 39 Hình 2.6 Phƣơng pháp chuyển màng PVDF 43 Hình 3.1 Đánh giá biểu marker hucMSC 51 Hình 3.2 Mật độ quang hucMSC qua đánh giá phƣơng pháp WST-1 52 Hình 3.3 Chu kì tế bào hucMSC qua phân tích flow cytometry 54 Hình 3.4 Biểu mức phiên mã gene điều hòa chu kỳ tế bào phƣơng pháp Realtime qRT-PCR 54 x Hình 3.5 Biểu mức dịch mã gene điều hòa chu kỳ tế bào phƣơng pháp Western Blot 55 Hình 3.6 Tỉ lệ tế bào sống apoptosis hucMSC qua phân tích flow cytometry sử dụng phƣơng pháp nhuộm FITC Annexin V 58 Hình 3.7 Biểu mức phiên mã gene liên quan đến apoptosis hucMSC phƣơng pháp Realtime qRT-PCR 59 Hình 3.8 Cƣờng độ nhân hucMSC qua phân tích ứng dụng Cell Cycle App 60 Hình 3.9 Diện tích nhân hucMSC qua phân tích ứng dụng Cell Cycle App60 Hình 3.10 Hình dạng nhân hucMSC qua phân tích ứng dụng Cell Cycle App 61 Hình 3.11 Sự phân bố nhân mối tƣơng quan hình dạng nhân cƣờng độ nhân hucMSC qua phân tích ứng dụng Cell Cycle App 62 Hình 3.12 Sự phân bố nhân mối tƣơng quan diện tích nhân cƣờng độ nhân hucMSC qua phân tích ứng dụng Cell Cycle App 63 Hình 3.13 Hình thái tế bào chất hucMSC 64 Hình 3.14 Giá trị FSC biểu thị kích thƣớc tế bào hucMSC 65 Hình 3.15 Biểu mức phiên mã gene mã hóa vi ống, vi sợi phƣơng pháp Realtime qRT-PCR 66 Hình 3.16 Biểu mức dịch mã protein cấu trúc vi sợi, vi ống phƣơng pháp Western Blot 67 Hình 3.17 Ảnh nhuộm huỳnh quang vi ống hucMSC điều kiện bình thƣờng điều kiện vi trọng lực mơ (SMG) 69 Hình 3.18 Ảnh nhuộm huỳnh quang vi sợi hucMSC điều kiện bình thƣờng điều kiện vi trọng lực mơ (SMG) 70 Hình 3.19 Kết đánh giá mật độ vi ống hucMSC 71 5015693 5813861 4345530 4971953 6352375 5870915 7335772 5708086 4295855 4952514 4257335 4541749 6790639 6419981 6530049 5578850 4862617 4756374 4413614 4736299 6553474 5399690 4859951 5708414 4522371 4757287 4525367 7053789 7507634 5697794 732126 4991000 3779666 5019227 4224428 4695287 8592450 6812855 5873646 5216093 4921243 4780473 4146411 5024025 9795890 5016856 8248247 6078758 3581303 4858832 4298965 6192156 13412162 5913032 6270448 5706486 4427222 4666467 3734410 5508052 1621498 5593872 5476517 5562373 3759605 5354314 4232041 6223179 3947374 6363195 6402544 5069862 4202233 4843887 4335013 4427048 6196360 5811877 6089473 6288476 4442256 4938074 4171518 5979487 8052981 6701308 7062755 5482078 4170146 4547560 4166702 5223629 9101175 5233227 5244149 5689912 4634063 4418183 4318638 5312233 7572376 6173961 7973828 5473320 4091199 4555582 4262865 5561894 4102090 5068644 764326 6127165 4957336 4999124 4258668 5987724 8180821 5534831 7621745 5632074 4322459 5468434 4281843 5007428 5270392 5506044 6904886 5609279 4688153 4823956 4431627 5062068 6788474 5832472 7700343 5817602 5354260 5744090 4085911 5554764 7018190 5497071 5642301 5297148 5110666 799947 4317703 6318036 5667127 5746829 6115281 5170867 3997958 3836806 3044260 4523607 6292827 5818923 7513947 5489545 4067397 4943124 4030756 6648129 5743704 5143079 7997738 4575575 4462689 4840805 3960967 6134055 2661480 5606086 6120738 5186511 4025051 3157027 3935499 4670812 5441249 4904157 6338478 5138873 4297368 4933653 4246122 5328586 7139261 1686891 2605679 4671077 4302858 4606659 4377355 4992663 3357053 5722170 5844414 2770464 3643012 4709743 4434159 6345271 6583733 5464693 7314523 5126200 4554126 5196313 4267104 4998509 9276359 4579960 7808278 5608247 3905600 5709078 4173663 5172266 9236507 5094004 7116553 5774577 3226417 4752500 4221053 5897607 6640400 5655222 8059776 5553283 4276969 4595838 3920919 6162608 7518465 5933636 7092462 5859171 4601472 4794131 4438592 5935772 8767902 5591866 8001801 4470931 4395746 4711533 4457458 4980484 7998215 5526235 8505934 5352202 4277678 4919609 4248100 5314699 7690137 5362363 5616542 4890593 4832600 4516933 4320643 5175644 6089107 5538546 7990380 5358719 4805469 6044700 4255558 5750277 7660824 5780287 6688842 4994410 4247336 5688780 4034187 6104556 5166716 5894843 5193184 5319855 5065830 5024907 4251992 5668502 8001531 5714725 5445989 6198054 4519319 4744259 3794692 6003966 15174018 5672795 6786807 6030895 4021711 4966128 4587565 6409732 6081901 5262945 5496302 5890107 4435288 4937833 3692014 5830211 8224218 6124772 5322845 5243226 4680230 5085137 3917699 6031597 6114499 5564188 6866932 5377540 4658163 4522032 4209002 7435556 1330495 4720453 7929666 5174441 4612339 4220477 4254523 5600528 5305200 4907918 8626171 5052647 6991453 5301980 5084499 4233915 5170765 5036622 5617515 4467459 6273407 5279537 4439026 4804024 4775200 6021177 5504533 4698806 7087319 5291260 4336247 5093226 4865752 5210751 4803160 4938065 5821919 4629056 4608487 5281708 5358634 5145155 5256304 4937520 6502860 4531452 4961563 4398325 4752804 4816234 5183634 5219554 6067158 4726466 4846545 4680427 4538365 5157090 5069154 4525812 6607301 4883319 4906247 4332615 5660006 4715771 5408608 1319459 7049594 4097994 5048507 4601616 5132726 5000070 5429190 4220329 5908667 4574449 4912948 4585225 5303765 4890143 5075691 4441677 7528910 4723567 5420760 4763381 4729672 5337092 5402469 4599133 6909949 4745162 5386146 4811504 5168013 5064327 5029560 4999341 6227119 4670792 5870009 4176897 5647054 4773694 5450553 4396503 6182829 4662690 5633073 4923755 5320893 4548650 4736440 4541368 7169021 4817588 5429876 4824412 4818490 4721450 4918385 4350478 8002455 5210972 4745344 5144658 4988958 4599142 5572918 5301734 7280572 4744284 2706551 4504889 6020029 5347638 4921173 4891811 7274014 5029433 4468120 4688247 3495261 5218402 4477708 4672748 5755167 4229146 3647541 4758345 4685466 5384354 1247590 5120935 7659817 4681814 3887886 5383051 4445256 5158963 4846335 4212907 8133362 4965976 2410586 4134470 4788610 4974118 4120248 4356878 7423253 5156089 4062432 4515633 2988105 4887139 4996464 5667721 5681815 4718904 4580301 5824106 3968046 4792455 3721458 4866375 6346790 5343796 4607176 5079067 4854857 5047113 3970169 4463380 7538447 5009996 4635554 5242255 4658868 4644114 5234713 5145987 7761314 4346509 4753667 5252326 4223868 5240945 4920763 5162242 8208033 4848259 4243312 5194553 3730474 4472783 4712995 4764772 8094551 4844053 4664550 4716784 4331580 4778531 5636882 5330127 7329029 5144343 5303261 4899281 4560799 4757530 4601586 4319225 7281246 2794669 5224569 4810600 4890498 4536778 5002154 4491133 7094277 4880158 4069069 3506652 5016355 4966653 5930621 4680750 7228249 4577024 4184943 5562375 4663781 1376649 5035217 4610975 7680828 4211078 5080109 4972479 5141308 4413649 4639435 2721082 7205211 3701720 4550467 4347817 5125846 4287967 4162132 5032362 6811627 5392256 4888851 4509021 5234823 5087572 4823761 4470047 8268585 4032410 4297010 4793207 4719317 1981384 5353773 4562644 4000473 4612749 4112739 2884214 4653163 4122112 4984205 1967680 6550482 5555296 5132876 4416126 3677790 4520766 4776200 5019371 7249470 4918433 4074438 5175031 4442750 4983371 4458395 5103723 7601784 4561002 4439998 5919193 4814804 4661310 4595168 4356095 7316526 5224013 4382673 5414190 4674053 5012727 3591380 4459248 5403758 4791650 4247054 4763616 4853991 5531464 4088665 4864066 5294105 4830292 4245091 5063133 4544285 5205662 3574841 4562430 4672603 5230576 4848222 4847072 3554986 5573339 4615252 5838752 4933583 4798748 4708977 4911939 4600697 5429708 4713363 4797784 5064716 4826512 4247548 5313653 5059589 4599944 4631711 4470205 5196552 4627104 4718447 5065903 5000574 5283141 4959230 5080424 4995481 4690280 4690617 5489929 5324198 5245901 5167909 5440967 5155709 4648793 5275973 4909327 5876333 4961266 5087453 4977998 4499088 5114131 5396799 4922710 5220481 5109368 4931971 4844923 4711361 4642539 4995967 4833922 4911103 6090788 4339093 4569327 4579514 4781496 6554202 5004742 837981 5769694 8317675 8203376 5639019 4359121 5733831 4588670 977017 6321257 6263899 7082226 4876384 4719226 7089551 5133434 6539019 4713843 7660240 8209893 4642704 4621169 6800346 4748731 8583456 5999571 7663346 5959439 5280856 4413050 6119740 4997953 12008869 5604103 7700893 9315741 4983839 4845179 7810841 4976379 6251468 6410885 6001659 6310327 4950982 4319897 6777524 5145713 8609175 5695991 7087844 8474054 4789320 5187228 6495892 3951966 7339995 6022199 12950723 7311074 4958659 4713345 6302594 5983238 8372614 4562974 12729381 7798094 5036434 4664548 6709988 6419857 1131902 6897828 11534779 6840221 4928598 4250918 7248040 5011803 7295120 6728423 11579017 6463888 5083427 5165008 7090997 4884675 9158803 8364327 8137563 7130471 5028796 4920792 7600098 5492302 4293947 7628789 12726422 8178366 5788806 5307310 8295396 4966975 3046724 7940772 4758409 7160302 5172228 4597781 8054237 5636575 10036848 7388198 8550945 5070410 5567903 5392821 7313722 5981265 12318979 8252075 8957454 5052217 4671271 5564432 6926615 5228615 8720308 6418848 7818721 7661131 4532800 4644177 7164868 5310737 8178981 7740932 9573817 6246882 4301353 5191976 6355910 6000717 10490649 7395046 7879308 6274469 5572078 5087597 7838185 5365731 11313544 7041135 9488732 7710238 3968738 4779256 5465321 5742886 9282757 6247695 8860872 7141404 4528407 5169751 7125810 5579588 9159579 6867479 6254187 7218822 4687530 5620458 6482128 5030209 11599010 7792454 6913564 6961624 4426709 5314436 5469994 5327868 11174137 8601559 8899810 6627734 4757241 4396182 6871757 5685673 12971629 8326637 10304292 6924104 5024521 5435766 6826638 4973884 9998622 8167929 10660436 8305495 5430433 4879407 6982941 5125348 8042687 7899149 8756786 7556717 5349097 4894117 6684658 5398267 13873774 8126045 9068968 6978321 4843595 4635449 7426229 5777324 7435190 8874670 7479679 7899469 5269077 4612233 7094453 5766910 7696884 7303630 9790585 6778956 4325406 4902230 6362538 5425866 7562603 8216745 6530825 7441877 5116210 5421271 7854468 5541052 9224776 7103104 6559199 6544693 4909219 2531909 6766766 6466485 8995431 6321994 6484982 6032149 6089717 4999052 6541116 2927137 9097591 7695620 6596744 6033200 5253017 4868774 7419767 6549957 3803109 6887880 6345885 7324984 5417923 4347744 7796655 5473445 10595772 6183112 7096681 3244917 5696058 3435656 6121391 4846059 8016422 5554439 6453685 6514903 4899342 5064214 7122687 5022967 8243932 6454656 6789586 6453123 4854731 5315853 6931874 5083740 8855584 5997959 6086347 8410665 4900598 4083734 6766918 5755798 1242424 6283070 7965571 9897104 5305433 5449187 5979452 4485061 4826429 5425434 6566077 10450212 6314869 4807418 6063594 6618651 955220 5840489 6758859 6044711 6032096 5379446 6525810 5227211 5885595 6661618 8125153 5371885 5275700 4807321 6285842 6418128 5810768 9126529 7474913 7368192 5978232 4559316 6770084 5204738 5776159 7554860 7693382 7441636 6304854 5175140 876631 5860386 5211434 7827635 6414474 8563159 6367312 5003832 928083 5371172 6722675 6845332 7314782 6859281 6771441 5072341 605590 4630339 8810168 7089717 7992853 6940623 6835564 4732689 2747835 4312034 5415602 8090006 7777756 6581283 6891962 5416270 841281 5944716 6491087 7146877 7425264 6050069 7832824 7077565 7708052 4645349 7696463 5770555 5864419 6287036 7137134 7159012 7405486 4468242 7531595 5730839 6361316 5596891 7563397 6926947 6690626 6493986 6633417 6075862 5900206 5260631 5530597 8147924 6365224 6529726 6264366 7546717 5821260 6079748 7871321 7391634 6737475 5984709 6551993 7121374 5748807 8247480 5826752 8959066 6933564 5851578 7397831 6125725 5490621 6492090 6614534 8251793 6440622 5855905 6997079 6965655 6642526 6047089 6811059 7630036 6701587 4831989 6414680 7865181 7686252 4975414 5398971 5444847 6839248 6146733 7396424 5123071 3219687 6710106 6595622 6065300 6799617 4539602 7001227 6340645 7048355 6228682 6135521 5487144 5581658 4569801 6606359 5489058 6258084 7285927 7114141 6461844 6755539 4837493 4572214 5308152 8599467 4767430 6029930 6691380 7952417 6595637 7469472 4936889 7526729 4933093 6441848 6777105 5958143 6568914 7652819 5318506 5942137 4969960 7472823 5009797 7127474 7207527 5581830 6283782 6963850 5492513 6177207 6527734 6157186 6200948 6414524 6738154 5015130 6395700 6276301 6469601 6957961 7197222 6318382 5967235 5947313 6869902 6094149 6255327 6306465 5849753 7747040 6195311 6624469 6062350 6808106 6102203 5640089 6217826 6856959 6844088 5421743 6255681 6668025 5506533 5873348 6500484 7048161 5919340 5021439 5668475 6284580 6136773 6508278 6594315 7403173 4976598 5096617 6801857 7210943 6967550 6831050 6456358 7669861 5210354 6225142 6594382 8410019 5959774 7713775 7756737 7375199 7392578 5417271 6695981 7546138 6395091 6481908 6884165 7399557 6143276 5714790 7047907 6021553 6949511 7159796 6627027 7946078 5767095 4971387 6533210 7379599 6467803 6103707 6449320 7179592 6649283 5552579 5429092 5945992 7132446 7222345 6607512 6816359 5652518 6321195 7083973 6262300 6955859 5203362 6451271 6384060 7957419 6268025 6529686 5458884 6518319 5342959 6727555 5663836 7033577 7675802 5363968 5953284 6343213 6326490 6923593 6020568 5807043 5655652 6554859 5842324 7837496 7834709 6348972 6482410 6383549 8531015 7678322 6314029 6481646 6554873 6682436 5811162 6039444 5206798 8005165 7255340 6585488 7258143 6186469 7206501 5547856 5317390 6818111 5506184 5712843 6348593 6541010 5551297 6230777 6016217 6207647 5882475 7118076 7231839 6670507 6862795 6798243 6392838 5850739 5486410 6001574 5826146 6189349 6941073 7410796 7521839 7905880 6348768 7802835 6095063 7075779 8085008 6012867 5711390 6199552 8731800 6153874 6595224 6985231 6752270 4973311 7673837 6393452 6020929 7227776 6021717 5688491 5915848 6756909 5534487 6132274 4883701 7069068 5966760 6914014 6468646 5579932 5480366 6006141 6091829 6587548 5630874 9547529 9646995 5123335 5802284 6848277 6875994 6513252 7462722 5128499 7054546 3346889 5740268 7088354 5225289 6901573 6833559 5444195 5800997 8786094 6620175 6751053 7136967 5146562 6672198 6034676 6422786 5580352 6677507 7057128 5788785 6877724 5283806 5566500 7649458 6222112 5696645 6142184 7435238 5341384 5949941 7448676 5498092 6654078 5704408 6253189 6197986 6193703 6379853 5907578 7873373 6438456 7264225 5406501 5493957 6425111 4534175 6922823 6157414 7072950 5154501 6849218 4915341 5244145 4718675 6209678 5628649 6402137 6849458 6735891 6620100 6905896 5521855 7302404 5061275 5931597 6680340 One Way Analysis of Variance Data source: Data in Notebook1 Normality Test: Failed (P < 0.050) Equal Variance Test: Failed (P < 0.050) Group Name N Col 784 Col 815 Source of Variation Between Groups Residual Total Missing 0 DF 1597 1598 Mean 5967253.571 5629317.186 SS 4.563E+013 3.632E+015 3.678E+015 Std Dev 1821776.295 1126784.347 MS 4.563E+013 2.274E+012 SEM 65063.439 39469.534 F 20.065 P