Tài liệu hóa sinh

KHOA CN SINH HỌC – MÔI TRƯỜNG THÍ NGHIỆM HÓA SINH MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP TỦA PROTEIN I. Phương pháp tủa bằng các tác nhân gây tủa là dung môi hữu cơ (Ethanol 80%, Aceton) Độ hòa tan của protein trong dung dịch phụ thuộc vào nhiều yếu tố, một trong số đó là hằng số điện môi của dung dịch. Nhìn chung, những phân tử dung môi có hằng số điện môi lớn (như nước, dimethylsulphoxid) có thể ổn định tương tác giữa chúng với các phân tử protein và tạo điều kiện thuận lợi cho sự hòa tan của protein trong dung dịch. Ngược lại, các dung môi với hằng số điện môi nhỏ (aceton, ethanol…) ngăn cản sự phân tán của các phân tử protein trong môi trường. Do đó, độ hòa tan của những phân tử protein giảm và xảy ra kết tủa do sự làm giảm hằng số điện môi hiện hữu của môi trường. Điều này có được bằng cách thêm một dung môi hòa tan trong nước như aceton vào dung dịch chứa protein. Sự tủa bằng aceton hoặc ethanol 80% có nhiều thuận lợi hơn vì nó tương đối rẻ, có sẵn ở dạng tinh khiết với ít chất tạp nhiễm gây độc hay ức chế đối với enzym, do nhiệt độ bay hơi của dung môi thấp nên dễ tách bỏ dung môi khỏi chế phẩm enzym bằng phương pháp sấy nhẹ bằng quạt gió. II. Phương pháp tủa bằng muối Người ta có thể dùng muối (NH 4 ) 2 SO 4 , NaCl… để tủa protein vì các muối này vừa làm trung hòa điện (do các ion tác động tương hỗ với các nhóm tích điện trái dấu), vừa loại bỏ lớp vỏ hydrat của phân tử protein. Các protein khác nhau có thể bị kết tủa với nồng độ muối khác nhau, vì vậy có thể dùng muối để tách riêng các protein ra khỏi hỗn hợp của chúng. Phần thí nghiệm 1. Dụng cụ và hóa chất Dụng cụ Pipet 5ml, 10ml Becher 50ml, 100ml, 250ml Bình tia Máy ly tâm Hóa chất Nguyên liệu thơm (dứa) Etanol 96% Muối (NH 4 ) 2 SO 4 2. Thực hành Cân khoảng 80g đến 100g thơm, giã nát vắt lấy nước rồi ly tâm ở 6000 vòng/phút trong 15 phút rồi đong xem thể tích của nước thơm là bao nhiêu, ghi nhận thể tích V. Sau đó chia đôi thể tích V nước thơm vùa thu được thành hai phần bằng nhau rồi tiến hành tủa protein bắng hai tác nhân tủa khác nhau: Ethanol 80% và muối (NH 4 ) 2 SO 4 1 KHOA CN SINH HỌC – MÔI TRƯỜNG THÍ NGHIỆM HÓA SINH Quy trình kết tủa enzym Bromelin bằng cồn 80% Lưu ý: Phối trộn cồn với dịch dứa theo tỉ lệ 4:1 (1 dứa : 4 cồn) 2 Làm sạch Nghiền ép, xay nhuyễn Lọc Ly tâm 6000 v/p, trong 15 phút Dịch trong Chồi ngọn, vỏ quả Bã Bã Tủa cồn 4 o C / 2 giờ Ly tâm 6000 v/p, trong 20 phút Thu tủa Sấy khô Bromelin Bỏ dịch trong cồn 80%, làm lạnh 4 0 C KHOA CN SINH HỌC – MÔI TRƯỜNG THÍ NGHIỆM HÓA SINH Quy trình thu nhận enzym Bromelin bằng muối (NH 4 ) 2 SO 4 Lưu ý: Để có muối(NH 4 ) 2 SO 4 bão hòa 70% ta phối trộn với tỷ lệ 47,2g muối trong 100ml nước thơm. 3 Làm sạch Nghiền ép, xay nhuyễn Lọc Ly tâm 6000 v/p, 15 – 20phút Bã Bã Chồi ngọn, vỏ quả Hỗn hợp dịch dứa, để ở nhiệt độ phòng 30 phút Ly tâm 6000 v/p, trong 15 phút Thu tủa Bỏ dịch trong Sấy khô Bromelin Dịch trong Ammonium sulfate 70% bão hòa KHOA CN SINH HỌC – MÔI TRƯỜNG THÍ NGHIỆM HÓA SINH 3. Kết quả: Hãy tính hàm lượng protein có trong 100g nguyên liệu ban đầu. III. Phương pháp tủa protein bằng điểm đẳng điện. 1. Nguyên tắc Giá trị pH mà tại đó phân tử protein trung hòa điện gọi là điểm đẳng điện của protein (pI), ở giá trị pH = pI phân tử protein trung hòa điện sẽ không chuyển dịch trong điện trường, phân tử protein sẽ kém bền nhất dễ kết tủa. Người ta lợi dụng tính chất này để kết tủa protein. 2. Dụng cụ và hóa chất Dụng cụ Máy khuất từ Máy ly tâm Cân phân tích Bercher 100ml, 250ml Pipet 5ml, 10ml Hóa chất Dung dịch NaOH 20% Dung dịch HCl 10% Ete Etanol Giấy pH 3. Thực hành Tách chiết protein cá: Cân 100g cá đã xay nhuyễn trong một bercher rồi cho 4 lần nước. (1 cá : 4 nước, g/l) Khuấy đều rồi cho từ từ NaOH 20% vừa cho vừa khuấy cho đến pH 11 thử bằng giấy pH, khuấy khoảng 45 phút rồi ly tâm, giữ lại dịch chiết trong một bercher 250ml, bã còn lại thêm nước chiết tiếp lần hai rồi ly tâm lấy dịch bỏ bã. Dịch thu được cho vào bercher 250ml gộp chung với phần dịch chiết bên trên. Cho từ từ HCl 100% vào dịch chiết vừa cho vừa khuấy đến pH thích hợp là 6 sẽ thấy kết tủa, ly tâm 4000 vòng/phút trong 30 phút, rồi bỏ dịch thu tủa protein, rửa tủa với ete : ethanol với tỷ lệ 2:1, tủa protein sạch khi rửa tủa vài lần với ete : ethanol. Cân lượng tủa protein thu được (mg tủa) để tính ra hiệu suất protein có trong 100g cá. 4 KHOA CN SINH HỌC – MÔI TRƯỜNG THÍ NGHIỆM HÓA SINH KHẢO SÁT HOẠT TÍNH ENZYM BROMELIN (Xác định hoạt tính enzym Bromelin bằng phương pháp Anson cải tiến) 1. Nguyên tắc Phương pháp này dựa trên sự thủy phân protein casein bằng enzym Bromelin có trong dịch nghiên cứu, tiếp đó làm vô hoạt enzym và kết tủa protein chưa bị thủy phân bằng dung dịch acid trichloracetic. Định lượng sản phẩm được tạo thành trong phản ứng thủy phân bằng phản ứng màu với thuốc thử Folin. Dựa vào đồ thị chuẩn của Tyrosin để tính lượng sản phẩm do enzym xúc tác tạo nên. 2. Dụng cụ và hóa chất Dụng cụ Ống nghiệm Pipet 1ml, 2ml, 3ml, 5ml, 10ml Máy quang phổ Becher 50ml, 250ml, 500ml Bình tia Hóa chất Dung dịch Casein 1% Dung dịch TCA 5% Dung dịch NaOH 0,5N Thuốc thử Folin Dung dịch HCl 0,2N Dung dịch Tyrosin chuẩn 1 mM/l trong dung dịch HCl 0,2N 3. Chuẩn bị đường chuẩn Tyrosin Các bước dựng đường chuẩn Tyrosin Dung dịch hóa chất Ống nghiệm 1 2 3 4 5 6 Dung dịch Tyrosin chuẩn (ml) 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 Lượng Tyrosin tương ứng (µM) 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 Dung dịch HCl 0,2N (ml) 5,0 4,8 4,6 4,4 4,2 4,0 Dung dịch NaOH 0,5N (ml) 10 10 10 10 10 10 Thuốc thử Folin (ml) 3 3 3 3 3 3 Lắc mạnh, sau 10 phút đo OD ở bước sóng 660nm Ống số 1 là ống thử không (TK), các ống còn lại là ống thí nghiệm (TN). Vẽ đường chuẩn Tyrosin tương quan giữa lượng Tyrosin (µM) và ΔOD (ΔOD = OD TN – OD TK ). 5 KHOA CN SINH HỌC – MÔI TRƯỜNG THÍ NGHIỆM HÓA SINH 4. Phương pháp tiến hành Lấy 6 ống nghiệm sạch, khô, tiến hành làm 3 ống thử thật, 3 ống thử không Các bước chuẩn bị mẫu enzym để đo hoạt tính Dung dịch hóa chất Ống nghiệm Thử thật Thử không Dung dịch Casein 1% (ml) 5 5 Dung dịch TCA 5% (ml) 0 10 Dung dịch enzym mẫu (ml) 1 1 Lắc đều và giữ ở 35,5 o C trong 20 phút Dung dịch TCA 5% (ml) 10 0 Để yên 30 phút, lọc lấy dịch trong Lấy 2 ống nghiệm mới khác, cho vào ống thứ nhất 5ml dịch lọc của ống thử thật và cho vào ống thứ hai 5ml dịch lọc cùa ống thử không. Tiếp tục thêm vào mỗi ống 10ml NaOH 0,5N và 3ml thuốc thử Folin, lắc mạnh, sau 10 phút đo OD ở bước sóng 660nm. Tính ΔOD = OD TT – OD TK , sau đó dựa vào đồ thị chuẩn suy ra được số µM Tyrosin. 5. Tính kết quả Định nghĩa đơn vị Anson: một đơn vị Anson là lượng enzym tối thiểu trong điều kiện thí nghiệm (35,5 0 C: pH 7,6 …) thủy phân Casein trong 1 phút tạo thành sản phẩm hòa tan trong TCA, phản ứng với thuốc thử Folin cho ta độ hấp thu OD ở bước sóng 660nm tương ứng với 1µM Tyrosin trong đường chuẩn. Hđ Protease = )( ** *sin* UI vmt LVTyroM µ Với: Hđ Protease : hoạt độ enzym protease (UI/g) V : tổng thể tích hỗn hợp trong ống thử thật hoặc ống thử không (ml) v : thể tích dịch lọc đem phân tích (ml) t : thời gian thủy phân (phút) m : khối lượng mẫu enzym đem đi xác định hoạt tính (g) L: độ pha loãng enzym µM Tyrosin: lượng µM Tyrosin trong v (ml) suy ra từ đường chuẩn KHẢO SÁT HOẠT TÍNH INVERTASE 6 KHOA CN SINH HỌC – MÔI TRƯỜNG THÍ NGHIỆM HÓA SINH I. Nguyên tắc: Invertase là một enzym thủy giải saccharose thành glucose và fructose. Trong bài này ta dùng enzym invertase trích trong men bia để cho thủy giải saccharose, từ đó tính được hoạt tính của enzym này. II. Dụng cụ và thuốc thử Dụng cụ Becher 100ml – 250ml Erlen 250ml Ống nghiệm 50ml Pipet 5ml – 10ml Buret 25ml Phễu lọc Hóa chất dung dịch saccharose 10% dung dịch NaOH N/10 Dung dịch Iod N/10 Dung dịch H 2 SO 4 N Hồ tinh bột 1% Dung dịch Na 2 S 2 O 3 N/20 III. Cách tiến hành Điều chế dung dịch invertase: cân 0,5g men bia hòa tan trong 50ml nước cất. Khuấy đều trong 5 phút. Để lắng đem lọc lấy dịch lọc. Thực hiện ba ống nghiệm như sau: Số ống 1 2 3 ml dung dịch saccharose 10% ml nước cất ml enzym invertase ml enzym invertase đã đun sôi 10 10 10 10 10 10 Để thủy giải trong 30 phút ở nhiệt độ phòng. Tiếp đó, đem tất cả các ống đun cách thủy trong 2 phút, làm lạnh dưới vòi nước. Hút 5 ml của hỗn hợp cho vào một erlen 250ml và định phân đường glucose như sau: cho thêm vào bình 10ml dung dịch Iod N/10 và 15 ml dung dịch NaOH N/10. Thời gian nhỏ NaOH phải kéo dài khoảng 2 phút (nhỏ từng giọt). Để yên trong bóng tối 15 -20 phút. Lấy ra thêm vào 2ml dung dịch H 2 SO 4 N. Định phân lượng iod thêm còn thừa bằng dung dịch Na 2 S 2 O 3 N/20 (dùng hồ tinh bột cho thêm vào lúc cuối phản ứng để làm chất chỉ thị màu). IV. Kết quả 7 KHOA CN SINH HỌC – MÔI TRƯỜNG THÍ NGHIỆM HÓA SINH Hoạt tính của invertase được biểu thị bằng số mol saccharose thủy giải bởi lượng enzym invertase có trong 1g men bia trong 1 phút ở nhiệt độ phòng thí nghiệm. Gọi V 1 và V 2 là số ml Na 2 S 2 O 3 N/20 dùng định phân ống số 1 và số 2. Có nhận xét gì về kết quả định phân trong ống số 3? Hoạt tính invertase được tính theo công thức sau: phútgmol mtba BAVV // **22010 **)( 3 21 ∗∗∗∗ − a: thể tích lấy ra trong mỗi ống để định đường glucose (ml) A: thể tích tổng cộng trong mỗi ống (ml) b: thể tích dung dịch enzym cho vào mỗi ống (ml) B: tổng thể tích dung dịch enzym có được từ m g – men (ml) t: thời gian thủy giải tính bằng phút. XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH ENZYM ALPHA – AMYLASE 8 KHOA CN SINH HỌC – MÔI TRƯỜNG THÍ NGHIỆM HÓA SINH (THEO PHƯƠNG PHÁP SMITH & ROE) I. Nguyên tắc: Hoạt tính α - amylase biểu thị khả năng của enzym amylase xúc tác phản ứng thủy phân tinh bột đến dextrin trong 1 phút ở 50 0 C và được thể hiện bằng số đơn vị của enzym trong 1g mẫu. Khi phản ứng thủy phân tinh bột xảy ra, lượng tinh bột còn lại chưa được thủy phân hủy sẽ tạo phản ứng màu với iod và được so màu bằng máy so màu quang học ở bước sóng 620 nm. II. Dụng cụ và hóa chất Dụng cụ Bình định mức 50ml, 100ml, 250ml Bếp ổn nhiệt Pipet 1ml, 2ml, 3ml, 5ml, 10ml Becher 50ml, 100ml, 250ml Máy quang phổ Hóa chất Cồn 96 0 Dung dịch tinh bột 1% trong đệm pH 5,6 Dung dịch HCl 1N Dung dịch NaCl 3% Thuốc thử Lugol III. Thực hành 1. Ly trích Amylase Amylase là 1 tạp chất protein không tan trong rượu mạnh. Cân 10g lúa nảy mầm cho vào cối với 30ml nước cất, giã nát lúa dưới nước. Để yên trong 15 phút, đem lọc. Lấy tất cả nước qua lọc, thêm 4 lần thể tích cồn 96 0 . Khuấy đều, ta sẽ thấy amylase và các protein khác tủa dưới dạng nùi lớn. Để lắng, ly tâm lấy tủa. Hòa tan tủa trong 20ml nước cất. Ta có dung dịch amylase khá tinh sạch. Đặc biệt dung dịch này không có chất đường khử (thử 1ml dung dịch thuốc thử Fehling, đun cách thủy 3 phút, ta không có kết tủa đỏ xuất hiện) 2. Khảo sát hoạt tính α-amylase 9 KHOA CN SINH HỌC – MÔI TRƯỜNG THÍ NGHIỆM HÓA SINH Lấy sáu ống nghiệm chia thành 2 lô, mỗi lô 3 ống nghiệm gồm thử thật và thử không để lấy trung bình. Tiến hành thí nghiệm theo bảng sau: Dung dịch hóa chất Ống nghiệm Ống thử thật (t) Ống thử không (o) Nước cất (ml) 0 1 Dịch chiết α - amylase 1 0 Dung dịch đệm (ml) 1 1 Dung dịch tinh bột 1% (ml) 1 1 Dung dịch NaCl 3% (ml) 0,5 0,5 Dung dịch HCl 1N (ml) 0 1 Đem ủ ở 50 0 C trong 30 phút Dung dịch HCl 1N (ml) 1 0 Nước cất (ml) 5,5 5,5 Thuốc thử Lugol (ml) 0,5 0,5 Lắc đều hỗn hợp trong ống nghiệm rồi mang đi so màu ở bước sóng 620nm IV. Kết quả: Hđ A= )( * **)( 0 0 UI tOD LCODOD t − Với OD 0 : mật độ quang của ống thử không OD t: mật độ quang của ống thử thật C: lượng tinh bột ban đầu tham gia phản ứng (mg) T: thời gian phản ứng (phút) L: hệ số pha loãng mẫu enzym. XÁC ĐỊNH ĐẠM TỔNG SỐ THEO PHƯƠNG PHÁP KJELDAHL I. Vô cơ hóa: 10 . KHOA CN SINH HỌC – MÔI TRƯỜNG THÍ NGHIỆM HÓA SINH MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP TỦA PROTEIN I. Phương pháp tủa bằng các tác nhân gây. tủa protein bắng hai tác nhân tủa khác nhau: Ethanol 80% và muối (NH 4 ) 2 SO 4 1 KHOA CN SINH HỌC – MÔI TRƯỜNG THÍ NGHIỆM HÓA SINH Quy trình kết tủa enzym Bromelin bằng cồn 80% Lưu ý: Phối trộn cồn. phút Thu tủa Sấy khô Bromelin Bỏ dịch trong cồn 80%, làm lạnh 4 0 C KHOA CN SINH HỌC – MÔI TRƯỜNG THÍ NGHIỆM HÓA SINH Quy trình thu nhận enzym Bromelin bằng muối (NH 4 ) 2 SO 4 Lưu ý: Để