(Luận án tiến sĩ) khảo sát các đột biến gen ở bệnh nhân ung thư phổi không tế bào nhỏ bằng phương pháp giải trình tự gen thế hệ mới

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH ĐẶNG HUỲNH ANH THƯ KHẢO SÁT CÁC ĐỘT BIẾN GEN Ở BỆNH NHÂN UNG THƯ PHỔI KHÔNG TẾ BÀO NHỎ BẰNG PHƯƠNG PHÁP GIẢI TRÌNH TỰ GEN THẾ HỆ MỚI LUẬN ÁN TIẾN SĨ Y HỌC TP HỒ CHÍ MINH, Năm 2023 Năm 2023 n BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ LỜI CAM ĐẠI ĐOAN HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH Tơi Nguyễn Thị Lan Anh, nghiên cứu sinh Học viện Quân Y, chuyên ĐẶNG HUỲNH ANH THƯ ngành Nội hô hấp, xin cam đoan: Đây luận án trực tiếp thực hướng dẫn GS.TS Đồng Khắc Hưng GS.TS Mai Trọng Khoa KHẢO SÁT CÁC ĐỘT BIẾN GEN Ở BỆNH NHÂN Cơng trình nghiên cứu khơng trùng lặp với bất nghiên cứu khác đượcPHỔI cơng bốKHƠNG Việt Nam UNG THƯ TẾ BÀO NHỎ BẰNG Tôi xin cam đoan số liệu sử dụng luận án trung PHƯƠNG PHÁP GIẢI TRÌNH TỰ GEN THẾ HỆ MỚI thực khách quan, xác nhận chấp thuận sở nơi nghiên cứu NGÀNH: HĨA SINH Y HỌC SỐ:trước 62720112 Tơi hoàn toàn chịu tráchMÃ nhiệm pháp luật cam kết Hà Nội, ngày 28 tháng năm 2017 Tác giả luận án LUẬN ÁN TIẾN SĨ Y HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:Thị Lan Anh Nguyễn PGS.TS.BS LÊ XUÂN TRƯỜNG TS NGUYỄN HOÀI NGHĨA TP HỒ CHÍ MINH, Năm 2023 n MỤC LỤC Trang Danh mục chữ viết tắt i Danh mục đối chiếu thuật ngữ Anh – Việt ii Danh mục bảng iii Danh mục hình iv Danh mục biểu đồ, sơ đồ v ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan ung thư phổi không tế bào nhỏ 1.2 Vai trò đột biến gen ung thư phổi không tế bào nhỏ 11 1.3 Các phương pháp xác định đột biến gen 19 1.4 Một số nghiên cứu đột biến gen bệnh nhân ung thư phổi không tế bào nhỏ 30 CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 36 2.1 Thiết kế nghiên cứu 36 2.2 Đối tượng nghiên cứu 36 2.3 Thời gian địa điểm nghiên cứu 36 2.4 Cỡ mẫu nghiên cứu 36 2.5 Xác định biến số nghiên cứu 38 2.6 Phương pháp, công cụ đo lường, thu thập số liệu 39 2.7 Quy trình nghiên cứu 59 2.8 Phương pháp phân tích liệu 61 2.9 Đạo đức nghiên cứu 61 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 63 3.1 Một số đặc điểm lâm sàng, cận lâm sàng bệnh nhân UTPKTBN 64 3.2 Xác định tỉ lệ đột biến gen (EGFR, ALK, ROS1, BRAF, KRAS, NRAS) phương pháp NGS mô u mối liên quan đột biến gen với số đặc điểm lâm sàng cảu bệnh nhân 66 n 3.3 So sánh tương đồng phát đột biến gen EGFR NGS mô u với ddPCR EGFR Cobas V2 76 3.4 So sánh tương đồng phát đột biến gen NGS sinh thiết lỏng với NGS mô u, ddPCR EGFR Cobas V2 79 CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN 84 4.1 Một số đặc điểm lâm sàng, cận lâm sàng bệnh nhân UTPKTBN 84 4.2 Xác định tỉ lệ đột biến gen (EGFR, ALK, ROS1, BRAF, KRAS, NRAS) phương pháp NGS mô u mối liên quan đột biến gen với số đặc điểm lâm sàng bệnh nhân 86 4.3 So sánh tương đồng phát đột biến gen EGFR NGS mô u với ddPCR EGFR Cobas V2 99 4.4 So sánh tương đồng phát đột biến gen NGS sinh thiết lỏng với NGS mô u, ddPCR EGFR Cobas V2 103 KẾT LUẬN 111 KIẾN NGHỊ 113 DANH MỤC CÁC CƠNG TRÌNH CƠNG BỐ KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU CỦA ĐỀ TÀI LUẬN ÁN TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC n LỜI CAM ĐOAN Đây nhánh cơng trình nghiên cứu “Xây dựng quy trình phát đột biến gen từ mẫu sinh thiết lỏng cơng nghệ giải trình tự gen hệ với ứng dụng chẩn đoán điều trị ung thư” thuộc sở khoa học công nghệ TP Hồ Chí Minh theo định số 1276/QĐ-SKHCN ngày 25/12/2017 Tôi xin cam đoan kết nghiên cứu trình bày luận án trung thực khách quan Tác giả luận án Đặng Huỳnh Anh Thư n [Type here] i [Type here] DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT Viết tắt Nguyên chữ ALK : Anaplastic Lymphoma Kinase ATS : American Thoracic Society AJCC : American Joint Committee On Cancer BN : Bệnh nhân cfDNA : Cell Free DNA ctDNA : Circulating Tumor DNA DNA : Deoxyribonucleic acid EGFR : Epidermal Growth Factor Receptor EML4 : Echinoderm Microtubule-Associated Protein-Like FFPE : Formalin fixed, paraffin embedded IASLC : International Association for the Study of Lung Cancer LBL : Liquid Biopsy Lung LOD : Limits of Detection MAF : Mutant Allele Fraction NCCN : National Comprehensive Cancer Network NGS : Next-Generation Sequencing PCR : Polymerase Chain Reaction TBL : Tumor Biopsy Lung TKI : Tyrosine Kinase Inhibitor TNM : T: tumor; N: lymph node; M: Metastasis UTBM : Ung thư biểu mô UTP : Ung thư phổi UTPKTBN : Ung thư phổi không tế bào nhỏ n ii DANH MỤC ĐỐI CHIẾU THUẬT NGỮ ANH - VIỆT Tiếng Anh Tiếng Việt American Thoracic Society : Hội lồng ngực Hoa Kỳ American Joint Committee On : Ủy ban hợp tác Hoa Kỳ Ung thư Cancer Epidermal Growth Factor : Thụ thể yếu tố phát triển biểu bì Receptor Formalin fixed paraffin embedded : Mô cố định paraffin International Association for the : Hiệp hội quốc tế nghiên cứu ung Study of Lung Cancer thư phổi Limits of Detection : Giới hạn phát Mutant Allele Fraction : Tần suất alen đột biến National Comprehensive Cancer : Mạng lưới Ung thư Quốc gia Hoa Kỳ Network Next-Generation Sequencing : Giải trình tự gen hệ Polymerase Chain Reaction : Phản ứng khuếch đại chuỗi Tyrosine Kinase Inhibitor : Chất ức chế Tyrosine Kinase n [Type here] iii [Type here] DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 1.2 1.3 2.1 2.2 2.3 3.1 3.2 3.3 3.4 3.5 3.6 3.7 3.8 3.9 310 3.11 3.12 3.13 3.14 3.15 Tên bảng Trang Phân nhóm giai đoạn UTPKTBN theo AJCC VII Tóm tắt thuốc nhắm trúng đích đích tế bào ung thư phổi 10 Các phương pháp phát đột biến gen UTPKTBN 25 Các biến số sử dụng nghiên cứu 38 Các dòng tế bào mang đột biến khảo sát nghiên cứu 52 Thông tin chứng dương Tru-Q1 52 Đặc điểm giới tính 64 Đặc điểm tiền sử hút thuốc 65 Tỉ lệ phân bố đột biến theo exon gen EGFR 68 Tỉ lệ loại đột biến gen EGFR 68 Tỉ lệ loại đột biến gen KRAS 70 Tỉ lệ loại đột biến đồng thời gen EGFR KRAS 71 Mối liên quan loại đột biến gen giới tính 72 Mối liên quan loại đột biến gen tuổi 73 Mối liên quan loại đột biến gen hút thuốc 74 Mối liên quan loại đột biến gen phân loại mô học 75 So sánh sinh thiết mô NGS ddPCR 76 Kết NGS ddPCR 30 mẫu sinh thiết mô phát đột biến L858R, T790M, del19 77 So sánh sinh thiết mô NGS Cobas phát đột biến EGFR 78 So sánh sinh thiết lỏng NGS ddPCR 79 Kết NGS ddPCR 34 mẫu sinh thiết lỏng phát đột biến L858R, T790M, del19 80 n 3.16 3.17 4.1 4.2 4.3 4.4 So sánh sinh thiết lỏng NGS EGFR Cobas V2 phát đột biến EGFR 81 So sánh sinh thiết lỏng NGS sinh thiết mô NGS 82 Tỉ lệ đột biến gen số nghiên cứu 89 Phân tích trường hợp khơng tương đồng NGS mô u EGFR Cobas V2 102 Phân tích trường hợp không tương đồng NGS sinh thiết lỏng EGFR Cobas V2 107 Phân tích trường hợp khơng tương đồng NGS sinh thiết lỏng NGS mô u 109 n [Type here] iv [Type here] DANH MỤC CÁC HÌNH Hình Tên hình Trang 1.1 Các đường truyền tín hiệu nội bào khởi nguồn từ EGFR 12 1.2 Sơ đồ biến thể dung hợp ALK UTPKTBN 15 1.3 Con đường truyền tín hiệu đột biến ROS1 16 1.4 Các biến thể dung hợp gen ROS1 UTPKTBN 17 1.5 Giải trình tự gen hệ tổng hợp (Illumina) 27 2.1 Hệ thống máy giải trình tự Nextseq 550 (Ilumina/Mỹ) 40 n LBL053 EGFR del19 LBL054 LBL055 LBL056 LBL057 (-) KRAS KRAS (-) (-) G12 Q61 (-) LBL061 EGFR del19 LBL063 LBL064 LBL065 (-) (-) (-) (-) (-) (-) LBL066 EGFR del19 LBL068 LBL069 LBL071 LBL072 (-) EGFR (-) (-) (-) L858 (-) (-) LBL073 EGFR Del19 LBL074 LBL076 LBL077 LBL078 (-) (-) EGFR (-) (-) (-) L858 (-) LBL079 EGFR Del19 LBL081 EGFR Del19 LBL083 KRAS G12 NC_000007.14:g.55174771_55174786delGGAA TTAAGAGAAGC (-) G12D Q61R (-) NC_000007.14:g.55174771_55174786delGGAA TTAAGAGAAGC (-) (-) (-) NC_000007.14:g.55174771_55174786delGGAA TTAAGAGAAGC (-) L858R (-) (-) NC_000007.14:g.55174775_55174789delATTA AGAGAAGCAAC (-) (-) L858R (-) NC_000007.14:g.55174777_55174795delTAAG AGAAGCAACATCTC NC_000007.14:g.55174772_55174786delGGAA TTAAGAGAAGC G12D LBL085 EGFR L858 L858R 39 LBL087 KRAS G12 G12C 47 LBL089 KRAS G12 55 LBL095 EGFR Del19 G12C NC_000007.14:g.55174773_55174787delGGAA TTAAGAGAAGCA LBL096 EGFR Ins20 NC_000007.14:g.55181328_55181330insGTG 46 LBL099 (-) (-) (-) (-) LBL100 (-) (-) (-) LBL101 EGFR Del19 LBL102 EGFR Del19 LBL103 (-) (-) (-) NC_000007.14:g.55174773_55174782delGAAT TAAGA NC_000007.14:g.55174772_55174786delGGAA TTAAGAGAAGC (-) LBL104 EGFR L858 L858R 54 LBL105 EGFR Del19 NC_000007.14:g.55174773_55174782delGAAT n 17 (-) 21 (-) 5% (-) (-) (-) 33 (-) (-) (-) 23 (-) (-) 22 (-) 47 15 43 92 19 (-) TAAGA LBL106 EGFR Del19 LBL107 EGFR Del19 EGFR Del19 KRAS G12 EGFR Ins20 EGFR Del19 EGFR Del19 LBL111 KRAS G12 NC_000007.14:g.55174773_55174782delGAAT TAAGA NC_000007.14:g.55174772_55174786delGGAA TTAAGAGAAGC NC_000007.14:g.55174773_55174782delGAAT TAAGA G12D NC_000007.14:g.55181309_55181317insCAGC GTGGA NC_000007.14:g.55174772_55174786delGGAA TTAAGAGAAGC NC_000007.14:g.55174773_55174782delGAAT TAAGA G12D TBL001 KRAS G12 G12C 13 TBL002 EGFR L858 L858R 32 TBL004 KRAS G12 G12A 26 TBL007 (-) (-) (-) (-) TBL008 (-) (-) (-) (-) TBL009 EGFR Del19 TBL010 EGFR Del19 TBL011 KRAS G13 G13S TBL013 EGFR Del19 NC_000007.14:g.55174772_55174786delGGAA TTAAGAGAAGC 10 TBL014 KRAS G12 G12S 29 TBL015 (-) (-) (-) (-) TBL017 KRAS G12 G12D 35 TBL018 EGFR Del19 NC_000007.14:g.55174777_55174796delTAAG AGAAGCAACATCTC 30 TBL019 (-) (-) (-) (-) TBL020 EGFR L858 L858R 39 TBL022 TBL024 (-) EGFR (-) L858 (-) L858R (-) 11 EGFR G719 G719C 25 EGFR S768 S768I 15 EGFR Del19 NC_000007.14:g.55174772_55174786delGGAA 30 LBL108 LBL109 LBL110 TBL026 TBL027 NC_000007.14:g.55174775_55174789delATTA AGAGAAGCAAC NC_000007.14:g.55174773_55174787delGGAA TTAAGAGAAGCA n 96 30 59 44 40 22 39 30 TTAAGAGAAGC TBL029 TBL032 TBL033 (-) EGFR KRAS (-) KRAS (-) L858 G13 (-) G12 (-) L858R G13S (-) G12V (-) 76 (-) 39 TBL034 (-) - - - TBL035 EGFR L858 L858R 27 TBL036 EGFR L858 L858R 67 TBL037 EGFR L858 L858R 14 TBL038 EGFR Del19 TBL039 TBL040 (-) (-) (-) (-) NC_000007.14:g.55174772_55174786delGGAA TTAAGAGAAGC (-) (-) TBL041 EGFR L858 L858R 87 EGFR KRAS EGFR (-) L858 G12 L858 (-) 29 48 (-) EGFR Del19 KRAS G13 TBL047 EGFR Ins20 L858R G12V L858R (-) NC_000007.14:g.55174774_55174788delGAAT TAAGAGAAGCAA G13S NC_000007.14:g.55181305_55181313insTGGC CAGCG TBL048 EGFR L858 L858R 73 TBL051 EGFR L858 L858R 95 TBL052 BRAF G469 G469R TBL055 EGFR L858 L858R read (