Luận án tiến sĩ nông nghiệp tạo thể lai mang gen kháng bệnh mốc sương bằng dung hợp tế bào trần giữa khoai tây dại và khoai tây trồng

HỌC VIỆN NƠNG NGHIỆP VIỆT NAM HỒNG THỊ GIANG TẠO THỂ LAI MANG GEN KHÁNG BỆNH MỐC SƯƠNG BẰNG DUNG HỢP TẾ BÀO TRẦN GIỮA KHOAI TÂY DẠI VÀ KHOAI TÂY TRỒNG LUẬN ÁN TIẾN SĨ NHÀ XUẤT BẢN ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP - 2016 HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM HOÀNG THỊ GIANG TẠO THỂ LAI MANG GEN KHÁNG BỆNH MỐC SƢƠNG BẰNG DUNG HỢP TẾ BÀO TRẦN GIỮA KHOAI TÂY DẠI VÀ KHOAI TÂY TRỒNG Chuyên ngành: Di truyền chọn giống trồng Mã số: 62 62 01 11 Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: GS.TS Nguyễn Quang Thạch TS Ramona Thieme HÀ NỘI – 2016 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan công trình nghiên cứu riêng tơi, kết nghiên cứu đƣợc trình bày luận án trung thực, khách quan chƣa dùng để bảo vệ lấy học vị Tôi xin cam đoan giúp đỡ cho việc thực luận án đƣợc cám ơn, thơng tin trích dẫn luận án đƣợc rõ nguồn gốc Hà Nội, ngày… tháng… năm… Tác giả luận án Hoàng Thị Giang i LỜI CẢM ƠN Trong suốt thời gian học tập, nghiên cứu hồn thành luận án, tơi nhận đƣợc hƣớng dẫn, bảo tận tình thầy cô giáo, giúp đỡ, động viên bạn bè, đồng nghiệp gia đình Nhân dịp hồn thành luận án, cho phép tơi đƣợc bày tỏ lịng kính trọng biết ơn sâu sắc tới GS.TS Nguyễn Quang Thạch – Viện Sinh học Nông nghiệp – Học Viện Nơng nghiệp Việt Nam tận tình hƣớng dẫn, dành nhiều công sức, thời gian, tâm huyết tạo điều kiện cho tơi suốt q trình học tập thực đề tài Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS Ramona Thieme, TS Thilo Hammann – Viện Nghiên cứu Chọn tạo Giống Cây trồng (Viện JKI)- CHLB Đức, ngƣời thầy tận tình ln tận tình hƣớng dẫn, dành nhiều thời gian công sức tạo điều kiện cho q trình thực luận án Tơi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới Ban Giám đốc, Ban Quản lý đào tạo, Bộ môn Di truyền Chọn giống trồng, Khoa Nông học- Học viện Nông nghiệp Việt Nam tận tình giúp đỡ tơi q trình học tập, thực đề tài hồn thành luận án Tôi xin chân thành cảm ơn tập thể lãnh đạo, cán viên chức Viện Sinh học Nơng nghiệp, đặc biệt cán Phịng Sinh học phân tử & Công nghệ vi sinh giúp đỡ tạo điều kiện cho suốt trình thực đề tài Xin chân thành cảm ơn gia đình, ngƣời thân, bạn bè, đồng nghiệp tạo điều kiện thuận lợi giúp đỡ mặt, động viên khuyến khích tơi hồn thành luận án./ Hà Nội, ngày tháng năm 20 Nghiên cứu sinh Hoàng Thị Giang ii MỤC LỤC Lời cam đoan i Lời cảm ơn ii Mục lục iii Danh mục chữ viết tắt vi Danh mục bảng vii Danh mục hình ix Trích yếu luận án xi Thesis abstract xiii PHẦN MỞ ĐẦU 1.1 Tính cấp thiết đề tài 1.2 Mục tiêu đề tài 1.3 Phạm vi nghiên cứu 1.4 Những đóng góp đề tài 1.5 Ý nghĩa khoa học ý nghĩa thực tiễn đề tài PHẦN TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Tình hình sản xuất khoai tây giới Việt Nam 2.2 Nguồn gen khoai tây dại tình hình khai khác nguồn gen khoai tây dại 2.2.1 Vai trò nguồn gen kháng bệnh khoai tây 2.2.2 Tình hình khai thác nguồn gen kháng bệnh chọn tạo giống khoai tây 2.3 Cơ sở khoa học phƣơng pháp dung hợp tế bào trần 10 2.3.1 Tách tế bào trần 10 2.3.2 Nuôi cấy tế bào trần 11 2.3.3 Tái sinh tế bào trần 12 2.3.4 Dung hợp tế bào trần 13 2.3.5 Chọn lọc lai soma 14 2.4 Bệnh mốc sƣơng khoai tây 15 2.4.1 Giới thiệu bệnh mốc sƣơng 15 2.4.2 Đặc điểm xâm nhiễm nấm P infestans 17 2.4.3 Cơ sở phân tử tính kháng bệnh mốc sƣơng nấm P infestans gây 18 iii 2.4.4 Các nghiên cứu gen kháng bệnh mốc sƣơng khoai tây 20 2.5 Các phƣơng pháp chọn tạo giống khoai tây 23 2.5.1 Chọn tạo giống khoai tây phƣơng pháp truyền thống 23 2.5.2 Chọn tạo giống khoai tây phƣơng pháp chuyển gen 23 2.5.3 Chọn tạo giống khoai tây phƣơng pháp dung hợp tế bào trần 24 PHẦN PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 30 3.1 Địa điểm thời gian nghiên cứu 30 3.1.1 Địa điểm nghiên cứu 30 3.1.2 Thời gian nghiên cứu 30 3.2 Vật liệu nghiên cứu 30 3.2.1 Vật liệu thực vật 30 3.2.2 Hóa chất 31 3.2.3 Thiết bị 32 3.3 Nội dung nghiên cứu 32 3.3.1 Nội dung 1: Tách dung hợp tế bào trần dòng khoai tây dại với giống khoai tây trồng 3.3.2 32 Nội dung 2: Xác định lai soma phƣơng pháp xác định độ bội (Flow cytometry) thị phân tử SSR 3.3.3 Nội dung 3: Đánh giá đặc tính kháng bệnh mốc sƣơng lai soma đặc tính nơng sinh học 3.3.4 33 33 Nội dung 4: Lai lại lai soma với giống khoai tây trồng để tạo quần thể chọn lọc 34 3.4 Phƣơng pháp nghiên cứu 34 3.4.1 Tách dung hợp tế bào trần dòng khoai tây dại với giống khoai tây trồng 3.4.2 34 Xác định lai soma đo độ bội (Flow cytometry) thị phân tử SSR 3.4.3 38 Đánh giá tính kháng bệnh mốc sƣơng lai soma lây nhiễm nhân tạo thị phân tử 3.4.4 3.5 39 Lai lại lai soma với giống khoai tây trồng để tạo quần thể chọn lọc 43 Phƣơng pháp xử lý số liệu 44 iv PHẦN KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 45 4.1 Kết 4.1.1 Tách dung hợp tế bào trần dòng khoai tây dại với giống 45 khoai tây trồng 4.1.2 45 Dung hợp tế bào trần dòng khoai tây dại với dòng khoai tây trồng thu thập đƣợc 48 4.1.3 Nuôi cấy tái sinh tổ hợp lai sau dung hợp 51 4.1.4 Xác định lai soma phƣơng pháp đo độ bội (Flow cytometry) thị phân tử SSR 4.1.5 Đánh giá đặc tính kháng bệnh mốc sƣơng lai soma lây nhiễm nhân tạo thị phân tử 4.1.6 4.2 55 58 Nghiên cứu tạo lai trở lại lai soma với giống khoai tây trồng 73 Thảo luận 84 PHẦN KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 91 5.1 Kết luận 91 5.2 Kiến nghị 92 Danh mục cơng trình cơng bố 93 Tài liệu tham khảo 94 Phụ lục 104 v DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT BA : 6-benzyl amino purine BC : Backcross CNSH : Công nghệ sinh học CT : Công thức CV : Coefficient of variation DAS – ELISA : Double Antibody Sandwich – Enzyme linked imunosorbent assay DNA : Deoxyribonucleic acid ELISA : Enzyme – linked imunosorbent assay FAO : Food and Agriculture Organization GA3 : Gibberellic Acid IAA : Indole-3-acetic acid JKI : Julius Kuehn Institute KLCTB : Khối lƣợng củ trung bình LSD : Least significant difference MS : Murashige and Skoog NAA : Naphthaleneacetic acid NSLT : Năng suất lý thuyết NSTT : Năng suất thực thu OD : Optical density PCR : Polymerase chain reaction PEG : Polyethylene glycol PVX : Potato virus X PVY : Potato virus Y RAPD : Random Amplified Polymorphic DNA SAS : Statistical Analysis Systems SH : Somatic hybrid SSR : Simple sequence repeat Tm : Nhiệt độ gắn mồi UV : Ultra violet vi DANH MỤC BẢNG Tên bảng TT 2.1 Trang Năng suất lƣợng số lƣơng thực nƣớc phát triển 2.2 Tình hình sản xuất khoai tây giới năm 2013 2.3 Tốp 10 quốc gia có sản lƣợng khoai tây lớn giới 2.4 Diện tích, suất sản lƣợng khoai tây Việt Nam giai đoạn 2006 - 2013 2.5 Tổng kết kết đánh giá tính kháng lồi khoai tây dại số loại sâu, bệnh hại khoai tây chống chịu với điều kiện bất thuận môi trƣờng 3.1 Các vật liệu thu thập, nguồn gốc, độ bội tính trạng mong muốn phục vụ cho lai soma 31 3.2 Các mồi sử dụng để chọn lọc lai 32 3.3 Các cặp mồi phát gen kháng mốc sƣơng 32 4.1 Ảnh hƣởng nồng độ macerozym cellulase dung dịch enzym đến hiệu suất tách tế bào trần dòng/giống khoai tây thí nghiệm 4.2 Ảnh hƣởng thời gian ủ mô dung dịch enzym đến hiệu suất tế bào trần thu đƣợc 4.3 47 Ảnh hƣởng tần số dung hợp số lần xung đến chất lƣợng tế bào sau dung hợp (Nghiên cứu tổ hợp lai Solanum bulbocastanum Delikat) 4.4 45 48 Kết tái sinh độ bội lai tái sinh sau dung hợp mật độ tế bào dung hợp khác (Nghiên cứu tổ hợp lai Solanum bulbocastanum Delikat) 4.5 50 Kết dung hợp dòng khoai tây dại nhị bội với giống khoai tây trồng tứ bội phƣơng pháp xung điện 4.6 4.7 51 Sự phân chia tổ hợp lai sau dung hợp điều kiện môi trƣờng khác 52 Sự phân chia tổ hợp lai môi trƣờng nuôi cấy khác 53 vii 4.8 Ảnh hƣởng môi trƣờng tái sinh khác đến khả tạo chồi tổ hợp lai 54 4.9 Kết nuôi cấy tái sinh chồi tổ hợp lai sau dung hợp 55 4.10 Kết tái sinh phân tích độ bội thể tổ hợp lai sau dung hợp 56 4.11 Kết chọn lọc lai soma phân tích độ bội thị phân tử SSR 58 4.12 Đặc điểm hình thái nấm P infestans q trình ni cấy 59 4.13 Phản ứng số giống khoai tây với mẫu mốc sƣơng thu thập từ Hà Nội Lạng Sơn 4.14 59 Kết đánh giá tính kháng bệnh mốc sƣơng lai soma dòng bố mẹ lây nhiễm nhân tạo đơn tách rời 4.15 Kết đánh giá tính kháng bệnh mốc sƣơng lai soma dòng bố mẹ lây nhiễm nhân tạo lát cắt củ (tuber slice test) 4.16 63 Kết đánh giá lai soma dòng bố mẹ khả kháng bệnh mốc sƣơng đồng ruộng đánh giá thành thục 4.17 61 64 Kết đánh giá tính trạng nơng sinh học dòng/giống khoai tây bố mẹ lai soma 68 4.18 Đánh giá tính trạng củ lai soma dòng bố mẹ 70 4.19 Kết lai lai trở lại lai soma với giống khoai tây trồng làm bố 74 4.20 Đánh giá khả kháng bệnh mốc sƣơng lai BC1 giai đoạn 75 4.21-A Kết đánh giá tính trạng nơng sinh học lai BC 78 4.21-B Kết đánh giá tính trạng nơng sinh học lai BC 79 4.22 Kết đánh giá suất yếu tố cấu thành suất cá lai BC1 80 viii XỬ LÝ SỐ LIỆU theo chƣơng trình SAS 9.1 I- Xử lý số liệu phần đánh giá dòng lai kháng nh mốc sƣơng CHIEU CAO CAY 01:19 Friday, September 15, 2014 The ANOVA Procedure Dependent Variable: N Source DF Model 19 Error Sum of Squares 4730.392750 20 Corrected Total Mean Square F Value 49.375000 39 248.968039 Root MSE 0.989670 3.822236 1.571226 T 19 CHIEU CAO CAY F Anova SS 4730.392750 N Mean 41.10750 Mean Square 248.968039 F Value 100.85 Pr > F