Luận án tiến sĩ nông nghiệp nghiên cứu vật liệu khởi đầu phục vụ chọn tạo giống đậu xanh kháng bệnh khảm vàng

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM  LỜI CAM ĐOAN BÙI i liệu trích dẫn đượcTHỊ rõTHU nguồnHUYỀN gốc Hà Nội, ngày tháng năm 2016 Tác giả luận án NGHIÊN CỨU VẬT LIỆU KHỞI ĐẦU PHỤC VỤ Bùi Thị Thu HuyềnKHÁNG BỆNH CHỌN TẠO GIỐNG ĐẬU XANH KHẢM VÀNG LUẬN ÁN TIẾN SỸ NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI – 2016 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM  BÙI THỊ THU HUYỀN NGHIÊN CỨU VẬT LIỆU KHỞI ĐẦU PHỤC VỤ CHỌN TẠO GIỐNG ĐẬU XANH KHÁNG BỆNH KHẢM VÀNG Chuyên ngành : Di truyền và chọn giống trồ ng Mã số : 62.62 01 11 LUẬN ÁN TIẾN SỸ NÔNG NGHIỆP NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC PGS.TS Hà Viết Cường TS Trần Danh Sửu HÀ NỘI – 2016 i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan kết nghiên cứu trình bày luận án thực Các số liệu kết nghiên cứu nêu luận án trung thực chưa công bố cơng trình nghiên cứu khác Tôi xin cam đoan giúp đỡ cám ơn, tài liệu trích dẫn rõ nguồn gốc Hà Nội, ngày tháng Tác giả luận án Bùi Thị Thu Huyền năm 2016 ii LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành luận án này, nghiên cứu sinh nhận tận tình giúp đỡ nhiều tập thể cá nhân Nghiên cứu sinh xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến PGS TS Hà Viết Cường, TS Trần Danh Sửu, người thầy tận tình dẫn dắt, động viên tạo điều kiện thuận lợi suốt trình nghiên cứu khoa học hoàn thành luận án Nghiên cứu sinh biết ơn ý kiến đóng góp quý báu Thầy Cô công tác Ban Đào tạo sau đại học - Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam suốt trình học tập Nghiên cứu sinh xin chân thành cảm ơn cán bộ, bạn bè đồng nghiệp công tác Bộ môn Nhân giống đánh giá nguồn gen, Bộ môn Đa dạng sinh học Nông nghiệp – Trung tâm Tài nguyên Thực vật, Trung tâm nghiên cứu Bệnh nhiệt đới – Học viện Nơng nghiệp Việt Nam, Phịng Virus học Phòng thị Phân tử - Trung tâm Rau Thế giới chia sẻ kinh nghiệm, giúp đỡ động viên suốt trình thực luận án Nghiên cứu sinh xin trân trọng gửi lời cảm ơn tới Ban Lãnh Đạo Trung tâm Tài nguyên Thực vật, Chủ nhiê ̣m tiểu dự án GIZ tại Viê ̣t Nam, TS Nguyễn Thi ̣ Lan Hoa, Chủ nhiê ̣m Dự án GIZ tại AVRDC, TS Lawrence Kenyon, HTX Nam An Nghiệp, huyện Tuy An, Phú Yên tạo điều kiện học tập giúp đỡ tận tình trình thực nghiên cứu Cuối cùng, nghiên cứu sinh xin cảm ơn gia đình bạn bè động viên khích lệ suốt q trình học tập hồn thành luận án Hà Nội, ngày tháng Tác giả luận án Bùi Thị Thu Huyền năm 2016 iii MỤC LỤC Lời cam đoan i Lời cảm ơn ii Mục lục ii Danh mục chữ viết tắt vi Danh mục bảng vii Danh mục hình MỞ ĐẦU ix CHƯƠNG I: TỞNG QUAN TÀI LIỆU, CƠ SỞ KHOA HỌC CỦA ĐỀ TÀI 1.1 Cây đậu xanh 1.1.1 Nguồn gốc phân loại đậu xanh 1.1.2 Đặc điểm nông sinh học yêu cầu sinh thái đậu xanh 1.1.3 Giá trị kinh tế giá trị sử dụng đậu xanh 1.1.4 Tình hình nghiên cứu, sản xuất đậu xanh giới Việt Nam 1.2 Đa dạng di truyền đậu xanh 13 1.2.1 Kích thước gen đậu xanh 13 1.2.2 Các thị ADN dùng cho đánh giá đa dạng di truyền đậu xanh 14 1.2.3 Nghiên cứu đa dạng di truyền đậu xanh thị phân tử 14 1.2.4 Đa dạng nguồn gen đậu xanh 17 1.3 Những nghiên cứu bệnh khảm vàng đậu xanh 18 1.3.1 Bệnh khảm vàng hại đậu xanh lịch sử phát 18 1.3.2 Triệu chứng tác hại bệnh khảm vàng gây 19 1.3.3 Virus gây bệnh khảm vàng đặc điểm cấu trúc gen 21 1.3.4 Con đường lây truyền bệnh 23 1.3.5 Điều kiện sinh thái vectơ virus 24 1.3.6 Phổ ký chủ virus 24 1.3.7 Nghiên cứu nguồn kháng virus vectơ 25 1.3.8 Đánh giá nguồn gen chọn giống đậu xanh kháng bệnh khảm vàng 26 iv 1.4 Nghiên cứu lập đồ di truyền ứng dụng cải tiến giống đậu xanh 29 1.4.1 Nghiên cứu lập đồ di tuyền đậu xanh 29 1.4.2 Lập đồ so sánh gen 34 1.4.3 Nghiên cứu lập đồ gen QTL đậu xanh 35 1.4.4 Lập đồ vật lý đậu xanh 37 1.4.5 Tiềm ứng dụng thành tựu nghiên cứu hệ gen đậu xanh cải tiến di truyền trồng kháng bệnh nhờ MAS 41 1.5 Nghiên cứu sử dụng thị phân tử lập đồ phân tử Việt Nam 43 CHƯƠNG II: VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 44 2.1 Vật liệu nghiên cứu 44 2.2 Nội dung nghiên cứu 45 2.3 Thời gian địa điểm nghiên cứu 45 2.4 Phương pháp nghiên cứu 46 2.4.1 Phương pháp xác định virus gây bệnh khảm vàng đậu xanh 46 2.4.2 Phương pháp đánh giá đa dạng di truyền sử dụng DArT 49 2.4.3 Phương pháp đánh giá khả kháng bệnh khảm vàng đậu xanh 50 2.4.4 Phương pháp đánh giá kiểu gen giải trình tự (GBS) 53 2.4.5 Phân tích QTLs (Quantitative Trait Loci) 57 CHƯƠNG III: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 58 3.1 Phân lập xác định virus gây bệnh khảm vàng đậu xanh 58 3.1.1 Kết thu mẫu bệnh khảm vàng đậu xanh, họ đậu khác Việt Nam 58 3.1.2 Thiết kế mồi phát virus gây hại đậu xanh họ đậu khác kỹ thuật PCR 60 3.1.3 Kết chuẩn đoán bệnh virus đậu xanh họ đậu khác kỹ thuật PCR 64 3.1.4 Kết giải phân tích trình tự ADN-A begomovirus 66 3.1.5 Kết phân tích nguồn gốc phát sinh lồi MYMV từ trình tự ADN-A ADN-B hoàn chỉnh Việt Nam 68 v 3.2 Đánh giá khả kháng bệnh khảm vàng đồng ruộng đặc điểm nông sinh học mẫu giống đậu xanh 72 3.2.1 Đánh giá khả kháng bệnh khảm vàng 72 3.2.2 Đánh giá đặc điểm nông sinh học mẫu giống đậu xanh 79 3.3 Đánh giá đa dạng di truyền nguồn gen đậu xanh 86 3.3.1 Thống kê tiêu đánh giá đa dạng di truyền thị DArT 87 3.3.2 Phân tích khoảng cách di truyền giống đậu xanh 90 3.3.3 Kết chọn tổ hợp lai để xây dựng quần thể lập đồ 95 3.4 Nghiên cứu lập đồ gen đậu xanh 97 3.4.1 Đánh giá kiểu hình tính kháng bệnh khảm vàng 97 3.4.2 Đánh giá kiểu gen kháng bệnh khảm vàng giải trình tự 106 3.4.3 Lập đồ liên kết di truyền, đồ vật lý quần thể đậu xanh nghiên cứu 109 3.4.4 Lập đồ QTL cho tính kháng bệnh khảm vàng đậu xanh 111 Kết luận đề nghị 120 Danh mục cơng trình cơng bố có liên quan đến luận án 122 Tài liệu tham khảo 122 Phụ lục 143 vi DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT ADN AFLP ARN A,C,G,T bp BSA CAPS cM CRM CTAB DArT EST GBS H ISSR LG MAS NBS-LRR PIC PCR QTLs RAPD RFLP RGAs RIL SFR SSRs SNP Acid Deoxyribo Nucleic Amplified Fragment Length Polymorphism Acid Ribonucleic Adenine, Cytosine, Guanine, Thyamine Base pair Bulked Segregant Analysis Cleaved Amplified Polymorphic Sequences Centimorgan Comprehensive reference map Cetyltrimethylammonium bromide Diversity Array Technology Expressed Sequence Tag Genotyping by Sequencing Observerd Heterogeneity Inter-Simple Sequence Repeat Linkage group Marker Assisted Selection Nucleotide binding site – leucine rich repeat Polymorphism Information Content Polymerase chain reaction Quantitative trait loci Randomly amplified polymorphic DNA Restriction fragment length polymorphisms Resistance gene analog Recombinant inbred lines Super Fine Resolution Simple sequence repeats Single nucleotide polymorphisms Axít Deoxyribonucleic Đa hình chiều dài đoạn phân cắt nhân bội Axít Ribonucleic Cặp bazơ Phân tích phân ly nhóm Đa hình phân đọan nhân cắt giới hạn Đơn vị khoảng cách đồ di truyền Bản đồ tham khảo Cơng nghệ phân tích đa dạng Đoa ̣n trin ̀ h tự biể u hiê ̣n (là đoạn trình tự ngắn chuỗi cDNA) Đánh giá kiểu gen giải trình tự Hê ̣ sớ di ̣hơ ̣p Trin ̀ h tự xen giữa các SSR Nhóm liên kết Chọn lọc nhờ chỉ thị phân tử Vị trí liên kết nucleotide Vùng lặp lại giàu leucine Hệ số đa dạng gen Phản ứng chuỗi trùng hơ ̣p Những locut tính trạng số lượng Đa hình ADN nhân bơ ̣i ngẫu nhiên Đa hình chiều dài đoạn phân cắt giới hạn Những yếu tố tương tự gen kháng Dòng thuầ n tái hơ ̣p Đơ ̣ phân giải cao Những trình tự lặp lại đơn giản Đa hình nucleotid vii DANH MỤC BẢNG TT bảng 1.1 Tên bảng Một số loài hoang dại loài trồng thuộc chi Vigna với tên Trang thường gọi nguồn gốc phát sinh 1.2 Diện tích suất đậu xanh Việt Nam 13 2.1 Nguồn gốc nguồn gen đậu xanh đánh giá khả 44 kháng bệnh khảm vàng Phú Yên 2.2 Các mồi chung phát ADN-A ADN-β 47 2.3 Thang điểm (1-6) đánh giá bệnh khảm vàng (MYMD) 51 3.1 Tổng hợp kết điều tra, thu thập mẫu bệnh Begomovirus 58 3.2 Kết thiết kế mồi cho ADN-A begomovirus 63 3.3 Tổng hợp kết thu thập theo nhóm trồng 64 3.4 Trình tự cặp mồi chống lưng thiết kế để khuếch đại 67 toàn ADN-A ADN-B MYMV thu thập từ Việt Nam 3.5 Các mẫu bệnh giải trình tự đoạn ADN-A ADN-B có 71 chiều dài hoàn chỉnh (full length) 3.6 Thống kê mức độ nhiễm bệnh khảm vàng tập đoàn đậu xanh 74 Phú Yên vụ Hè 2012 2013 3.7 Danh sách nguồn gen đậu xanh có khả kháng bệnh 75 khảm vàng đánh giá Phú Yên qua năm 2012 2013 3.8 Kết phân tích ANOVA ổn định tính kháng nguồn 77 gen đậu xanh nghiên cứu qua năm 3.9 Thời gian sinh trưởng chiều cao nguồn gen đậu 82 xanh tập đoàn 3.10 Tham số thống kê phân bố yếu tố cấu thành suất suất nguồn gen tập đoàn đậu xanh 84 viii 3.11 Danh sách mẫu giống đậu xanh triển vọng tập đoàn 86 đậu xanh vụ Hè 2013 3.12 Các giá trị nội dung thơng tin đa hình (PIC) cho 560 thị DarT 87 3.13 Mối quan hệ chất lượng thành phần khác 88 thị DArT với 92 nguồn gen đậu xanh 3.14 Các giá trị PIC cho thị DArT đa hình với 54 nguồn gen 89 đậu xanh 3.15 Mối quan hệ chất lượng thành phần khác 89 thị DArT với 54 nguồn gen đậu xanh 3.16 Bảng tổng hợp tiêu chọn cặp bố mẹ 96 3.17 Phân ly kiểu hình tính kháng bệnh khảm vàng quần thể 100 đậu xanh 200 dòng F2:3 71 dòng F2:3 rút gọn 3.18 Phân tích quy luật di truyền tính kháng bệnh khảm vàng 101 quần thể đậu xanh F2:3 đồng ruộng 3.19 Một số đặc điểm nơng sinh học hai dòng đậu xanh F5 105 triển vọng: dòng 148 dòng 178 3.20 Kết gọi thị SNP từ phân tích GBS 108 3.21 Tổng hợp lập đồ di truyền đậu xanh dựa thị SNP 110 3.22 Các QTL quy định tính trạng kháng MYMV quần thể 113 đậu xanh F2:3 lập đồ 3.23 Trình tự ADN chứa thị SNP liên kết với vùng QTL 114 3.24 Các vùng QTL xác định phương pháp SMR 116 3.25 Các vùng QTL xác định phương pháp CIM 118 3.26 Danh sách thị lựa chọn cho việc đánh giá thị 119 Nhiễm sắc thể Vị trí 7 7 7 7 562 563 564 565 566 567 568 569 570 9 9 9 9 9 9 9 1234 1235 1236 1237 1238 1239 1240 1241 1242 1243 1244 1245 1246 1247 1248 Chỉ thị trái Chỉ thị Phải Vr07:6674722 Vr07:11673121 Vr07:6674722 Vr07:11673121 Vr07:6674722 Vr07:11673121 Vr07:6674722 Vr07:11673121 Vr07:6674722 Vr07:11673121 Vr07:6674722 Vr07:11673121 Vr07:6674722 Vr07:11673121 Vr07:6674722 Vr07:11673121 Vr07:6674722 Vr07:11673121 Vùng QTL1 mymv1-4 Vr09:20592571 Vr09:20592377 Vr09:20592571 Vr09:20592377 Vr09:20592571 Vr09:20592377 Vr09:20592571 Vr09:20592377 Vr09:20592571 Vr09:20592377 Vr09:20592571 Vr09:20592377 Vr09:20592571 Vr09:20592377 Vr09:20592571 Vr09:20592377 Vr09:20592571 Vr09:20592377 Vr09:20592571 Vr09:20592377 Vr09:20592571 Vr09:20592377 Vr09:20592571 Vr09:20592377 Vr09:20592377 Vr09:20592336 Vr09:20592377 Vr09:20592336 Vr09:20592377 Vr09:20592336 LOD PVE(%) 4.5752 4.5503 4.5078 4.447 4.3675 4.2692 4.1533 4.0219 3.8789 8.7886 8.7349 8.6246 8.4531 8.2146 7.904 7.5171 7.062 6.5535 6.2999 7.0059 7.58 8.0435 8.4257 8.7443 9.0103 9.2305 9.4087 9.5468 9.6457 9.706 10.1352 10.6688 10.916 15.0816 17.6534 18.8622 19.5805 20.051 20.3589 20.5429 20.6185 20.5872 20.4401 20.158 19.7156 20.3827 21.1631 21.2378 Phụ lục 11 Các vùng QTL xác định Qgen phân tích CIM Permutation analysis QTL mapping method: Composite IM (LS) Statistic: LOD Selected chromosomes: [1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11] Selected trait: [MYMV] Selected background loci: [Vr04:15430209 154.3, Vr06:35603909 356.0, QTL_6_580 58.0, QTL_6_2880 288.0, QTL_9_2060 206.0] Number of iterations: 200 alpha 0.10 = 5.885 alpha 0.05 = 8.176 alpha 0.01 = 10.982 Nhiễm sắc thể Locus name 10 scaffold_183:3173 10 scaffold_184:401589 10 scaffold_183:608490 10 10 4 Vr04:15430209 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 Vị trí 32 34 Vị trí vật MYMV MYMV MYMV lý (Mb) CIM (Add effect) CIM (LOD) CIM (R^2) 0.497 7.189 0.373 0.4 0.498 7.026 0.366 0.6 0.528 7.919 0.402 3.2 0.541 8.542 0.425 3.4 0.451 6.836 0.358 150.3 152.3 154.3 156.3 15.03 15.23 15.43 15.63 0.53 0.521 0.585 0.554 6.731 7.819 10.485 7.048 0.354 0.398 0.493 0.367 22.1 36.1 38.1 40.1 42.1 44.1 46.1 48.1 50.1 52.1 54.1 56.1 58.1 78.1 80.1 82.1 88.1 90.1 92.1 94.1 96.1 98.1 2.21 3.61 3.81 4.01 4.21 4.41 4.61 4.81 5.01 5.21 5.41 5.61 5.81 7.81 8.01 8.21 8.81 9.01 9.21 9.41 9.61 9.81 0.485 0.495 0.517 0.534 0.547 0.554 0.557 0.554 0.55 0.538 0.533 0.528 0.552 0.594 0.584 0.555 0.448 0.464 0.475 0.481 0.484 0.578 7.793 5.971 6.476 6.977 7.466 7.932 8.366 8.764 9.175 9.194 8.927 8.507 8.41 6.779 8.137 9.221 5.916 6.244 6.534 6.78 7.051 8.946 0.397 0.321 0.343 0.364 0.384 0.402 0.419 0.434 0.448 0.449 0.44 0.424 0.42 0.356 0.41 0.45 0.319 0.333 0.345 0.356 0.367 0.44 5 5 5 5 5 5 100.1 102.1 116.1 118.1 120.1 122.1 124.1 126.1 128.1 130.1 132.1 134.1 10.01 10.21 11.61 11.81 12.01 12.21 12.41 12.61 12.81 13.01 13.21 13.41 0.644 0.672 0.883 0.85 0.801 0.744 0.685 0.625 0.568 0.516 0.467 0.47 8.388 7.028 6.016 6.403 6.609 6.672 6.632 6.526 6.382 6.222 6.066 6.499 0.42 0.366 0.323 0.34 0.349 0.351 0.35 0.345 0.339 0.332 0.325 0.344 Phụ lục 12 Các vùng QTL xác định Qgen phân tích CIM Permutation analysis QTL mapping method: Composite IM (LS) Statistic: LOD Selected chromosomes: [1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11] Selected trait: [MYMV] Selected background loci: [Vr04:15430209 154.3, Vr06:35603909 356.0, QTL_6_580 58.0, QTL_6_2880 288.0, QTL_9_2060 206.0] Number of iterations: 200 alpha 0.10 = 5.885 alpha 0.05 = 8.176 alpha 0.01 = 10.982 Nhiễm sắc thể Locus name 10 scaffold_183:3173 10 scaffold_184:401589 10 scaffold_183:608490 10 10 4 Vr04:15430209 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 Vị trí 32 34 Vị trí vật MYMV MYMV MYMV lý (Mb) CIM (Add effect) CIM (LOD) CIM (R^2) 0.497 7.189 0.373 0.4 0.498 7.026 0.366 0.6 0.528 7.919 0.402 3.2 0.541 8.542 0.425 3.4 0.451 6.836 0.358 150.3 152.3 154.3 156.3 15.03 15.23 15.43 15.63 0.53 0.521 0.585 0.554 6.731 7.819 10.485 7.048 0.354 0.398 0.493 0.367 22.1 36.1 38.1 40.1 42.1 44.1 46.1 48.1 50.1 52.1 54.1 56.1 58.1 78.1 80.1 82.1 88.1 90.1 92.1 94.1 96.1 98.1 2.21 3.61 3.81 4.01 4.21 4.41 4.61 4.81 5.01 5.21 5.41 5.61 5.81 7.81 8.01 8.21 8.81 9.01 9.21 9.41 9.61 9.81 0.485 0.495 0.517 0.534 0.547 0.554 0.557 0.554 0.55 0.538 0.533 0.528 0.552 0.594 0.584 0.555 0.448 0.464 0.475 0.481 0.484 0.578 7.793 5.971 6.476 6.977 7.466 7.932 8.366 8.764 9.175 9.194 8.927 8.507 8.41 6.779 8.137 9.221 5.916 6.244 6.534 6.78 7.051 8.946 0.397 0.321 0.343 0.364 0.384 0.402 0.419 0.434 0.448 0.449 0.44 0.424 0.42 0.356 0.41 0.45 0.319 0.333 0.345 0.356 0.367 0.44 5 5 5 5 5 5 - 100.1 102.1 116.1 118.1 120.1 122.1 124.1 126.1 128.1 130.1 132.1 134.1 10.01 10.21 11.61 11.81 12.01 12.21 12.41 12.61 12.81 13.01 13.21 13.41 0.644 0.672 0.883 0.85 0.801 0.744 0.685 0.625 0.568 0.516 0.467 0.47 8.388 7.028 6.016 6.403 6.609 6.672 6.632 6.526 6.382 6.222 6.066 6.499 0.42 0.366 0.323 0.34 0.349 0.351 0.35 0.345 0.339 0.332 0.325 0.344 Phụ lục 13: Hình ảnh phân tích kiểu gen quần thể lập đồ (11 NST) Qgen sử dụng phân tích SMR CIM SMR CIM