Sử dụng chế phẩm protease trong xử lý cám gạo dùng cho chế biến thức uống dinh dưỡng

Mục tiêu nghiên cứu

Mục tiêu chung

Thông qua việc sử dụng enzyme thương mại, xác lập được các điều kiện tối ưu để vô hoạt enzyme lipase trong nguyên liệu cám gạo và ứng dụng chế biến thức uống dinh dưỡng từ cám gạo.

Mục tiêu cụ thể

- Xác lập điều kiện vô hoạt tối ưu enzyme lipase có trong cám gạo bằng các chế phẩm enzyme protease thương mại.

- Xác lập động học biến đổi của thành phần các hợp chất bay hơi có trong dịch cám gạo trong quá trình xử lý nhiệt và bảo quản.

-Xác lập động học phân hủy nhiệt của hợp chất fructooligosaccharides (FOS) [bao gồm 1-kestose (GF2), nystose (GF3) và 1F-fructosylnystose (GF4)] trích ly từ cám gạo dưới các tác động của nhiệt độ và pH.

- Ứng dụng kết quả nghiên cứu vào chế biến thức uống dinh dưỡng.

Nội dung nghiên cứu

Nghiên cứu được chia làm 4 nội dung:

- Nội dung 1: Nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố đến khả năng vô hoạt enzyme lipase trong cám gạo bằng các chế phẩm protease Protamex và Flavourzyme

- Nội dung 2: Nghiên cứu ảnh hưởng của các chế độ tiệt trùng và thời gian bảo quản lên thành phần hợp chất bay hơi của nước cám gạo.

- Nội dung 3: Nghiên cứu động học phân hủy nhiệt của hợp chất FOS (bao gồm GF2, GF3 và GF4) trích ly từ cám gạo.

- Nội dung 4: Nghiên cứu sử dụng cám gạo đã vô hoạt enzyme lipase để chế biến thức uống dinh dưỡng.

Ý nghĩa của luận án

Hiện nay, ở nước ta việc nghiên cứu về phụ phẩm nông nghiệp rất ít công trình được công bố, do đó, kết quả nghiên cứu về cám gạo đã mang lại một ý nghĩa to lớn và quan trọng, góp phần vào việc định hướng phát triển ngành lúa gạo, một thế mạnh của Việt nam Nghiên cứu chỉ ra việc sử dụng kết hợp chế phẩm protease mang lại hiệu quả trong xử lý cám gạo và ứng dụng nguồn nguyên liệu này chế biến ra những sản phẩm dinh dưỡng là một hướng đi mới đầy tiềm năng Bên cạnh đó, nghiên cứu đã bước đầu khảo sát sự hiện diện cũng như điều kiện chế biến ảnh hưởng đến độ bền nhiệt của thành phần FOS, một prebiotic quan trọng đối với sức khỏe con người Do đó, đề tài có giá trị khoa học, thực tiễn và thời sự cao Hơn nữa, đề tài còn có tính hiện đại vì sử dụng kỹ thuật fingerprinting và headspace để truy vết và định lượng các hợp chất tạo hương vị trong quá trình chế biến nhiệt các sản phẩm nước uống từ cám gạo.

Điểm mới của luận án

Kết quả nghiên cứu đóng góp cơ sở khoa học cho vấn đề nghiên cứu còn bỏ ngõ, cám gạo Việc sử dụng kết hợp chế phẩm protease nhằm rút ngắn thời gian và tăng hiệu quả xử lý enzyme lipase đã giúp cho việc thu hồi dịch thủy phân chứa thành phần dinh dưỡng nổi trội, làm gia tăng giá trị của sản phẩm ứng dụng là sữa chua và bột dinh dưỡng, đây là hai sản phẩm mới có tính khả thi khi được chuyển giao sản xuất thực tế Đồng thời, việc nghiên cứu thành phần FOS trong cám gạo là nội dung nổi bật, có ít công trình nghiên cứu nào đã công bố Ngoài ra, phương pháp “metabolomics” đã được xem như một công cụ đánh giá chất lượng, quá trình chế biến và tính an toàn của nguyên liệu và sản phẩm cuối cùng đã được sử dụng trong nghiên cứu Từ đây cho thấy nghiên cứu này là công trình có tính mới về đối tượng và về phương pháp.

Tổng quan về cám gạo và sự hư hỏng của cám gạo

Giới thiệu chung

Các sản phẩm phụ từ quá trình chế biến gạo có thể bao gồm vỏ trấu, cám gạo, phần cám lau bóng và hạt tấm Lúa được thu hoạch từ ruộng ở dạng lúa nước Sau khi lúa được sấy khô, công đoạn đầu tiên của quy trình xay xát là loại bỏ vỏ, tạo ra gạo lứt. Tiếp theo, lớp bên ngoài được loại bỏ khỏi hạt gạo lứt để thu được gạo trắng Lớp bên ngoài (màu nâu) được tách ra được gọi là cám gạo theo sơ đồ Hình 2.1.

Quy trình sản xuất và chế biến cám gạo (Elizabeth, 2011)

Từ sơ đồ trên, nếu ức chế được enzyme lipase thì cám gạo có thể bảo quản được lâu và chế biến được những sản phẩm dinh dưỡng Cám gạo là một trong những nguyên liệu còn lại thu được sau khi xay xát thóc, nó chiếm khoảng 10% trọng lượng hạt thóc Cám gạo là sản phẩm của vỏ bì, vỏ lụa, lớp cutin của nhân, tầng aleuron, phôi mầm cũng như một phần từ tấm Cám gạo có màu sậm, chiếm 5÷9% trọng lượng gạo lứt Cám gạo có màu sáng và mùi thơm đặc trưng.

Xét theo sự khác biệt hàm lượng thành phần chính có trong cám gạo người ta phân ra ba (03) loại chính:

-Cám thô (cám pa-long): là loại cám thu được sau quá trình bóc vỏ trấu để thu gạo lứt Loại cám này hàm lượng trấu nhiều.

- Cám nhuyễn (cám Y): là loại cám thu được trong quá trình xay xát từ lúa ra gạo trắng Loại này có hàm lượng dầu rất cao.

- Cám khô: là loại cám thu được của quá trình xát trắng gạo Tỉ lệ tấm khá cao, lượng dầu ít hơn loại cám Y.

Thành phần hóa học và dinh dưỡng của cám gạo

Cám gạo là nguồn chất xơ rẻ và cũng là nguồn chất béo có ích để dùng làm dầu ăn (dầu cám gạo) Vì chỉ được xem là thức ăn gia súc nên cám gạo không được dùng nhiều trong chế độ dinh dưỡng và tăng cường sức khỏe của con người Giá trị dinh dưỡng cao của cám gạo đã khiến nó được quan tâm nhiều hơn trong sức khỏe cộng đồng Theo nghiên cứu của giáo sư Elizabeth (2011) đến từ trường đại học Colorado thì một khẩu phần cám gạo (tương đương 28 g theo tiêu chuẩn Bộ nông nghiệp Mỹ USDA) cung cấp nhiều hơn phân nửa nhu cầu các loại vitamin như thiamine, niacin và vitamin B6 trong ngày.

Thành phần hóa học và giá trị dinh dưỡng của cám gạo biến động rất lớn, phụ thuộc vào kỹ thuật xay xát gạo (Trần Thị Thu, 2010) Cám gạo thường có dạng bột, mềm và mịn Cám gạo chứa nhiều chất dinh dưỡng rất quý Với 14÷16% protein, 12÷23% chất béo, 8÷10% chất xơ, cám gạo cũng là nguồn giàu vitamin B và các chất khoáng như sắt, kali, magiê, mangan, clo (Saunder, 1985) Thành phần của cám có nhiều vitamin và chất béo tốt, lại cân đối và có nhiều xơ dễ tiêu có thể xem là rất tốt cho cả con người Cũng theo Bộ Nông nghiệp Hoa Kỳ, cám gạo tốt bằng/hơn cám yến mạch trong việc làm giảm hàm lượng cholesterol và nguy cơ bệnh tim mạch Hơn nữa, cám gạo có vị tốt và giá thấp hơn cám yến mạch Có thể so sánh thành phần hóa học của cám gạo với một số loại cám khác để thấy rõ tính ưu việt của nó (Bảng 2.1 và Bảng 2.2).

Bảng 2.1 So sánh thành phần hóa học của cám gạo và cám một số loại ngũ cốc khác

Thành phần Cám Cám Cám bắp Cám Cám lúa Cám Cám Cám gạo lúa mì bo bo mạch đen yến mạch hạt kê lúa miếng Protein (%) 12,0÷15,6 14,5÷15,7 7,8÷11,5 11,5 14,6 8,8÷16,2 11,5 7,7÷15,0

(Nguồn: George S., 1926) Bảng 2.2 So sánh thành phần acid amin (g/16gN) của cám gạo và ngũ cốc khác

Acid amin Cám gạo Cám lúa mì Cám lúa mạch đen Cám yến mạch

Số liệu ở Bảng 2.1và Bảng 2.2 cho thấy cám gạo giàu dinh dưỡng Ngoài hàm lượng các khoáng cần thiết cho cơ thể, đầy đủ các acid amin, cám gạo còn chứa hàm lượng chất béo cao hơn hẳn các loại cám của ngũ cốc khác, đặc biệt là hàm lượng các chất béo chưa bão hòa, thành phần các acid béo không thay thế như acid linoleic, acid linolenic là những thành phần rất tốt cho con người.

Do đó, hư hỏng lớn nhất, cần quan tâm nhất là sự ôi hóa dầu do hoạt động của enzyme lipase và lipoxygenase làm oxy hóa các acid béo chưa no (chưa bão hòa) như acid linoleic, acid linolenic để hình thành các hydroperoxide và tạo thành các hợp chất có nhóm cacbonyl có mùi ôi khét làm thay đổi mùi vị tự nhiên của cám gạo và có thể tạo thành các chất gây ung thư Việc sử dụng hiệu quả cám gạo chỉ có thể thực hiện được bằng cách khử hoạt tính enzyme lipase, yếu tố phân hủy thành phần cám và biến tính các yếu tố kháng dinh dưỡng Phát triển các kỹ thuật xử lý khác nhau để ổn định chất lượng cám gạo nâng giá trị cám gạo, một sản phẩm phụ quan trọng của ngành công nghiệp xay xát gạo mang lại thành công trong việc khai thác nó (Sharif, Butt, Anjum,

Một số ứng dụng của cám gạo

Theo Alauddina et al (2017), cám gạo là phụ phẩm của quá trình xay xát gạo; nó chiếm 10% lượng gạo, với sản lượng tiềm năng toàn cầu là 48 triệu tấn mỗi năm Phần lớn trong số này được sử dụng làm thức ăn gia súc hoặc bị loại bỏ làm vật liệu phế thải Tuy nhiên, cám gạo thu hút sự chú ý từ các nhà nghiên cứu vì nó phổ biến rộng rãi, rẻ và giàu chất dinh dưỡng như protein, chất béo, carbohydrate, các hợp chất hoạt tính sinh học và chất xơ Các thí nghiệm cho thấy rằng cám gạo và các hợp chất hoạt tính của nó, chẳng hạn như γ-oryzanol, tocopherol, tocotrienol, adenosine và acid ferulic, đóng vai trò như một loại thực phẩm chức năng Điều này có thể khuyến khích các doanh nghiệp sản xuất thực phẩm từ cám gạo quy mô lớn và đáp ứng nhu cầu toàn cầu về siêu thực phẩm và thực phẩm chức năng.

Tuy nhiên, thực tế ở Việt Nam nói chung và khu vực ĐBSCL nói riêng, phụ phẩm cám gạo chưa được khai thác tốt Nó là một nguồn giàu các vitamin, khoáng chất, acid béo thiết yếu, chất xơ và các sterol khác Các nhà khoa học cũng có những công bố về lợi ích sức khoẻ khác nhau liên quan đến cám gạo Người tiêu dùng đối với các loại thực phẩm vì sức khỏe và phạm vi sử dụng thực phẩm chức năng đang gia tăng trên thị trường trong và ngoài nước Cám gạo cũng bắt đầu được gia tăng ứng dụng trong ngành công nghiệp thực phẩm, dược phẩm và mỹ phẩm Phần lớn ứng dụng tiềm năng của cám gạo trong ngành công nghiệp thực phẩm bị hạn chế do sự không ổn định của nó do sự ôi thiu do sự phơi nhiễm dầu với lipase trong quá trình xay xát Nhiều phương pháp ổn định đã được tiến hành, tiên phong cho việc bổ sung cám gạo trong nhiều chế phẩm thực phẩm, nhằm mục đích tập trung vào các chức năng của cám gạo, lợi ích sức khoẻ và các ứng dụng tiềm năng trong ngành công nghiệp thực phẩm (Khalid et al., 2015).

Nhiều nghiên cứu trên thế giới chứng minh sử dụng cám gạo có lợi cho sức khỏe, chống lão hóa, ổn định huyết áp, tăng sức đề kháng, cân bằng đường huyết, điều chỉnh hệ thống nội tiết cho người già, hạn chế sự phát triển của tế bào ưng thư Cám gạo được dùng như vị thuốc Theo phân tích khoa học, trong cám gạo chứa nhiều vitamin như B1, B6, acid folic…rất cần thiết cho phụ nữ mang thai, giúp cho sự phát triển hệ thần kinh của thai nhi Lượng chất béo trong cám rất cao (12÷23%) thường dùng để chiết dầu cám Với 14÷16% protein, 8÷10% chất xơ…cám cung cấp nhiều chất dinh dưỡng cho con người hoặc hỗ trợ chữa bệnh như: đau mỏi bắp chân, tê các đầu chi, gót chân, cổ chân và khớp gối, viêm liệt dây thần kinh, tê phù…Rất nhiều công dụng từ cám đang được khai thác.

- Làm thức ăn công nghiệp: cách sử dụng cám gạo phổ biến nhất tại Việt Nam là làm thức ăn chăn nuôi gia súc và cho cá da trơn.

Cám gạo là thành phần quan trọng của một số loại thức ăn chăn nuôi

- Ép dầu: ở một số nước phát triển, từ lâu cám đã được trích ly dầu Một vài công ty ởViệt Nam cũng đã dùng cám gạo làm nguyên liệu ép dầu (nhà máy chế biến dầu Cái Lân là nơi đầu tiên sản xuất dầu cám) Dầu cám thu được sau khi trích ly có nhiều công dụng như những loại dầu khác Dầu cám cũng có thể cho vào một số thực phẩm khác với tác dụng bổ sung thêm chất béo không no mà cơ thể không tổng hợp được.

- Làm mỹ phẩm: ngoài những thành phần được giới thiệu ở trên thì trong lipid có chứa tinh dầu cám gạo (gamma oryzanol) – là một hoạt chất có tác dụng chống acid hóa, ngăn chặn sự xâm nhập của tia cực tím, cản trở hoạt động bài tiết sắc tố melanin trong biểu bì, do đó có tác dụng phòng chống da sậm màu Vitamin E giúp da chống lại sự lão hóa Cám gạo chứa nhiều chất có tác dụng làm sạch và làm trắng da một cách tự nhiên rất tốt cho cơ thể, có thể dùng để dưỡng da mặt.

Hiện nay, trên thị trường có bán bột cám gạo hoặc hỗn hợp bột cám gạo với các thành phần khác qua sơ chế dùng làm sữa rửa mặt, tẩy tế bào chết… với nhiều công dụng nhưng ở quy mô thủ công, nhỏ lẻ chưa đủ tin cậy Norhaizan Mohd Esa et al.,

(2013) đã chỉ ra những thành phần ưu việt có trong cám gạo và những tác dụng của chúng như: tác dụng chống oxy hóa, chống ung thư, hạ đường huyết, hạ cholessterol trong máu… Nghiên cứu cũng chỉ ra những ứng dụng trong thực phẩm mà chủ yếu là cám gạo có chứa lượng lớn chất xơ giúp hỗ trong tiêu hóa, bài tiết dễ dàng.

Tổng quan về hợp chất fructooligosaccharides

Cấu tạo của FOS

FOS bao gồm các chuỗi tuyến tính của các đơn vị fructose, liên kết bởi các liên kết β(2-1) Số lượng các đơn vị fructose dao động từ 2 đến 60 và thường chấm dứt trong một đơn vị glucose Công thức tổng quát của đường FOS là GF n , trong đó n = 2, 3, 4(G là gốc đường glucose, F là gốc đường fructose), bao gồm ba đại diện chính là các đường GF 2 (1-kestose), GF 3 (nystose), GF 4 (fructofuranosylnystose) (Hình 2.3).

Cấu tạo hóa học của fructooligosaccharides (bao gồm GF2, GF3 và GF4)

Ghi chú: (a) 1-kestose (GF 2 ), (b) nystose (GF 3 ) và (c) 1- fructosyl-nystose (GF 4 )

Tùy vào độ dài của mạch liên kết này mà FOS được chia thành 2 loại: FOS có cấu trúc mạch ngắn được gọi là oligofructose, FOS có cấu trúc mạch dài được gọi là inulin.

Cấu trúc hóa học của FOS bao gồm glucose và fructose liên kết với nhau, là chuỗi hỗn hợp của fructosyl với một đơn vị cuối cùng là glucose, liên kết bởi các liên kết β-(2-1)-glycosic, chúng có tối đa 5 đơn vị và có nguồn gốc từ đường thông qua các quá trình lên men tự nhiên tạo ra 1-kestose (GF 2 ), nystose (GF 3 ) và 1-fructosyl-nystose(GF 4 ) GF 2 được hình thành bằng cách thêm một phân tử fructose vào một phân tử saccharose Cách hình thành GF 3 là bổ sung một phân tử fructose sau đó, và nếu bổ sung một phân tử fructose khác sẽ tạo thành GF 4

Tính chất của FOS

FOS không bị thủy phân bởi các glycosidases ở ruột non và tiếp cận ruột già với cấu trúc không thay đổi Ở đó, chúng được chuyển hóa bởi vi khuẩn đường ruột để hình thành các acid cacboxylic ngắn, L-lactate, CO 2 , hydro và các chất chuyển hóa khác FOS có một số tính chất thú vị, bao gồm cả độ ngọt nhẹ Chúng không cung cấp năng lượng, không gây ung thư và được coi là chất xơ hòa tan.

FOS có nguồn gốc tự nhiên: nồng độ thấp, enzyme chuyển hóa gốc fructose bị giới hạn bởi thời tiết Fructooligosaccharide có nguồn gốc công nghiệp: thủy phân polysaccharide hoặc tổng hợp từ nguồn nguyên liệu saccharose và enzyme chuyển hóa tạo FOS từ vi sinh vật, chủ yếu từ nấm mốc. Đường kết tinh màu trắng, vị ngọt, hút ẩm mạnh, hòa tan trong nước, độ ngọt tổng gần bằng 30% độ ngọt saccharose, đặc tính này làm cho chúng có tác dụng hữu ích cho các loại thực phẩm, do việc sử dụng saccharose bị hạn chế vì độ ngọt cao Độ nhớt và độ bền nhiệt lớn hơn độ nhớt và độ bền nhiệt của saccharose, bền ở pH 4,0– 7,0, chịu nhiệt đến 140 o C, độ hòa tan, đông đặc, nhiệt độ sôi, thông số trong quá trình kết tinh xấp xỉ bằng saccharose.

FOS cũng không sinh năng lượng: cơ thể con người thiếu các enzyme cần thiết để thủy phân các liên kết beta, do đó chúng không bị thủy phân bởi các enzyme tiêu hóa và không được sử dụng làm nguồn năng lượng trong cơ thể, nên chúng an toàn cho bệnh nhân tiểu đường và người ăn kiêng giảm béo (Rivero-Urgell & Santamaria-Orleans, 2001; Yun, 1996).

Ứng dụng của FOS

Các nhà khoa họa đã chứng minh FOS có khả năng cải thiện hệ vi sinh vật hữu ích trong đường ruột (Bifidobacteria, Lactobaccilli), ít gây sâu răng, giảm lượng triglycerides máu, tăng khả năng hấp thu calcium cho cơ thể…nên có tác dụng tốt đối với trẻ em, người già, các bệnh tiểu đường, béo phì, mỡ máu (Lê Thị Hồng Ánh,

2013) Hiện FOS ngày càng được chú trọng đưa vào các sản phẩm thực phẩm và các công thức cho trẻ sơ sinh do hiệu quả prebiotic kích thích sự phát triển của vi khuẩn đường ruột (Sabater-Molino, Larque’, Torrella, & Zamora, 2009).

FOS được dùng như một thực phẩm bổ sung, rất phổ biến ở các nước Âu - Mỹ do nhiều lợi ích cho sức khỏe như làm phụ gia thực phẩm, bổ sung vào bánh, kẹo, gum, sữa hoặc trộn lẫn với các chất ngọt khác, bổ sung vào thức ăn gia súc, bổ sung vào thực phẩm chức năng, FOS hàm lượng thấp dùng làm chất kích thích môi trường lên men cho Bifidobacterium, hàm lượng trung bình dùng bổ sung vào thực phẩm, loại tinh khiết dùng trong kĩ thuật phân tích. Ứng dụng của FOS trong công thức thực phẩm là những thành phần mang lại một số lợi ích dinh dưỡng quan trọng cũng như đóng góp vào các đặc tính chức năng giúp nâng cao thời hạn sử dụng và mùi vị của các sản phẩm thực phẩm khác nhau như thanh dinh dưỡng (Izzo & Niness, 2001) FOS có mặt trong nguyên liệu tự nhiên và có thể được bổ sung vào thực phẩm (Hình 2.4), những ứng dụng của FOS vào thực phẩm điển hình như:

1 Sản phẩm mứt: FOS có thể được sử dụng làm chất làm ngọt duy nhất và giảm34% calo so với tiêu chuẩn đường sucrose Đặc điểm cảm quan của các sản phẩm được khẳng định là rất giống nhau, với mẫu thử nghiệm có độ ngọt thấp hơn và kết cấu mềm hơn.

2 Kem: FOS có thể được sử dụng cùng với inulin để thay thế tất cả đường và giảm hàm lượng chất béo và mang lại cảm giác ngon miệng tuyệt vời Vì sự suy giảm điểm đóng băng với oligofructose ít hơn so với đường, nên kết cấu có thể cứng hơn.

3 Trong bánh kẹo: có thể được sử dụng để sản xuất kẹo cứng, kẹo cao su và kẹo dẻo trong khi vẫn giảm đáng kể giá trị năng lượng.

Sự hiện diện của FOS trong thực phẩm

Tổng quan về enzyme protease và cơ chế thủy phân

Cấu tạo và phân loại enzyme protease

Protease hay peptide hydrolase là enzyme thuộc nhóm hydrolase-thủy phân các liên kết peptide của protein hay polypeptide (–CO–NH–) tạo thành các acid amin tự do, peptide, pepton, tri-dipeptide Nhiều enzyme protease có khả năng xúc tác phản ứng thủy phân liên kết ester, liên kết amid và phản ứng chuyển vị gốc acid amin (Rao, 2010).

Việc phân loại nhóm enzyme protease được thay đổi qua các thời kỳ (Barrett, 2001b) và protease phân chia thành proteinase và peptidase Việc thủy phân liên kết peptide nên sử dụng danh từ peptidase và được chia thành hai nhóm là endopeptidase và exopeptidase (Hình 2.5).

Theo Tổ chức Liên hiệp Quốc tế về Hóa sinh và Sinh học Phân tử (IUBMB- Internation Union of Biochemistry and Molecular Biology) peptidase chia thành hai nhóm:

+Exopeptidase (còn gọi peptidase hay enzyme phân cắt đầu mạch): thủy phân liên kết –CO–NH– ở đầu tận cùng chuỗi polypeptide, bao gồm amino– peptidase (xúc tác đầu có gốc amin tự do gọi là enzyme aminopeptidase), carboxyl–peptidase (xúc tác cắt liên kết –CO–NH– ở đầu carboxyl tự do gọi là enzyme carboxylpeptidase).

+Endopeptidase (còn gọi proteinase hay enzyme phân cắt nội mạch): xúc tác phản ứng thủy phân liên kết peptide nằm bên trong chuỗi polypeptidase.

Cơ chế xúc tác của endopeptidase và exopeptidase (Barrett, 2001a)

Dựa vào mức hoạt động trong dung dịch có trị số pH khác nhau, protease được chia làm ba nhóm:

+Protease acid: pH tối thích trong khoảng 2÷5 Chúng được thu nhận từ các loại nấm mốc đen: Aspergillus niger (A niger), A awamori, A saitoi và các loài Mucor pusillus, Rhizopus sp., Trametes sanguineara.

+ Protease trung tính: pH tối thích khoảng hẹp 6,0÷7,5 không bền ở nhiệt độ cao và mất hoạt tính khi có sự hiện diện protease kiềm Được thu nhận từ những loài nấm mốc khác nhau nhưng chủ yếu là các loài nấm mốc vàng, điển hình như A oryzae, A. flavus, A fumigatus, A tericola.

+Protease kiềm: pH tối thích trong khoảng 8÷11 được thu nhận từ nấm mốc, nấm men và vi khuẩn Bacillus subtilis Những protease kiềm là nhóm được quan tâm khá nhiều gần đầy vì có thể sử dụng chúng như những chất phụ gia trong quá trình thuộc da, trong chất giặt tẩy, xử lý chất thải môi trường.

Dựa vào cơ chế xúc tác, Barrett (2001) và Hartley (1960) chia protease thành 4 nhóm nhỏ, phụ thuộc vào khả năng xúc tác trong trung tâm hoạt động của enzyme: + Serine protease (E.C.3.4.21.x)

Serine protease có chứa nhóm (-OH) của serine trong trung tâm hoạt động Đại diện cho nhóm là các enzyme có nguồn gốc từ động vật là trypsin, chymotrypsin, elastate, plasmin vsà thrombine Một số được tổng hợp từ nấm mốc và vi khuẩn Bacillus cereus, B. firmus, B lichenoformis, A flavus, A oryzae, A sojae, Streptomyces frachiac, E coli. Nhóm serine protease có khả năng thích ứng trong khoảng pH khá rộng từ trung tính đến kiềm mạnh, làm tăng khả năng ứng dụng ở nhiều lĩnh vực so với các nhóm protease khác. + Cystein protease (E.C.3.4.22.x)

Các enzyme thuộc nhóm này có nhóm thiol (-SH) của cysteine trong trung tâm hoạt động, tác động lên nhóm –CO của liên kết peptide tạo phức hợp trung gian thiolacyl-enzyme Đặc trưng nhóm này là papaine, bromeline, ficine và protease từ

Aspartic protease là những protease chứa nhóm carboxyl (-COOH) trong trung tâm hoạt động, tác động lên liên kết peptide tạo phức hợp trung gian bằng liên kết không cộng hóa trị giữa enzyme và cơ chất Chúng hoạt động trong vùng acid, có đặc hiệu tương đối với các acid amin có vòng thơm hay các acid amin kỵ nước Đại diện là các enzyme có nguồn gốc từ động vật như rennin, pepsin Aspartic protease có nguồn gốc từ vi sinh vật có thể chia hai nhóm cơ bản là thích pepsin và nhóm thích rennin. Nhóm thích pepsin được thu nhận từ A oryzae, A niger, A awamori, A saitoi,

Rhizopus chinensis, Penicillium spp, Trametes sanguinea… Nhóm thích rennin được thu nhận từ A usami, Mucor pusillus, Endothia parasitica.

Metallo peptidase (còn gọi là protease kim loại) có trung tâm hoạt động chứa các ion kim loại Các protease kim loại này hoạt động mạnh nhất ở vùng pH trung tính và có tính đặc hiệu về phía gốc acid amin chứa nhóm (-NH) của liên kết peptid Enzyme nhóm này bao gồm exopeptidase, dipeptidase, amino peptidase, carboxylpeptidase, prolidase, prolisase và một số protease thu nhận từ vi sinh vật như A oryzae, Bacillus cereus, B megaterium, B subtillis, B thermoprotealyticus, S naraensis, Acremonium kiliense, Clostridium,…

Cơ chế thủy phân bằng enzyme

Enzyme là chất xúc tác sinh học, do đó trước tiên chúng mang đầy đủ đặc điểm của chất xúc tác nói chung Các phản ứng hóa học chỉ có thể xảy ra khi phân tử các chất tham gia phản ứng phải va chạm với nhau ở vị trí xảy ra phản ứng và phải ở trạng thái hoạt động Muốn hoạt hóa các phân tử thì cần cung cấp năng lượng cho chúng. Năng lượng đó gọi là năng lượng hoạt hóa Các chất xúc tác nói chung và xúc tác enzyme đều có khả năng làm giảm năng lượng hoạt hóa mà phản ứng yêu cầu bằng cách tiến hành qua các phản ứng tạo phức trung gian mà tổng số năng lượng hoạt hóa của chúng nhỏ hơn trường hợp không có chất xúc tác Sự tạo thành phức ES và biến đổi phức này thành sản phẩm P trải qua 3 giai đoạn sau:

+Giai đoạn 1: enzyme tác dụng với cơ chất băng liên kết yếu tạo thành phức hợp enzyme-cơ chất (ES) không bền Phản ứng xảy ra nhanh và đòi hỏi năng lượng thấp,các liên kết yếu tạo thành giữa enzyme và cơ chất trong phức hợp ES là tương tác tĩnh điện, liên kết hyđrogen, liên kết Van der Waals.

+ Giai đoạn 2: giai đoạn tạo phức chất hoạt hóa xảy ra biến đổi cơ chất dưới tác dụng của một số nhóm chức trong trung tâm hoạt động của enzyme làm cơ chất từ không hoạt động trở nên hoạt động Một số liên kết trong cơ chất bị kéo căng ra và mật độ electron trong cơ chất bị thay đổi.

+ Giai đoạn 3: là giai đoạn tạo ra sản phẩm của phản ứng và giải phóng enzyme Đây là giai đoạn cuối của quá trình phản ứng từ cơ chất sẽ hình thành sản phẩm và enzyme được giải phóng dưới dạng tự do như ban đầu (Nguyễn Trọng Cẩn và ctv., 1998).

Phản ứng thủy phân là yếu tố mở đầu cho việc hình thành mùi, vị và màu sắc của sản phẩm Phản ứng thủy phân sẽ tạo ra các acid amin sau đó các acid amin này biến đổi theo 4 chiều hướng khác nhau như Hình 2.7

Biến đổi tạo sản phẩm trong phản ứng thủy phân (Trần Thị Luyến, 2006)

Theo chiều hướng (1), các acid amin là cơ chất dinh dưỡng của vi sinh vật gây hương, tạo ra các hợp chất bay hơi tạo mùi Hướng (2) là acid amin tạo nên vị Hướng

(3) tạo màu sắc đặc trưng Và hướng (4) là acid amin bị phân hủy, tạo ra NH 3 Tùy vào mục đích sử dụng mà kiểm soát phản ứng theo hướng biến đổi mong muốn.

Hiện nay, trên thị trường có một số chế phẩm protease phổ biến như:

-Alcalase 2,4 AU/g: Là sản phẩm được sản xuất từ vi khuẩn Bacillus licheniformis, thuộc nhóm endoprotease EC 3.4.21.62 Nhiệt độ tối ưu 30 đến 65 o C, dải pH hoạt động 7,0–9,0, được bảo quản ở nhiệt độ 4 o C Chế phẩm có dạng lỏng, màu nâu đen, sánh.

- Bromelain: Được chiết xuất từ quả dứa, thuộc nhóm endoprotease EC 3.4.21.62. Nhiệt độ tối ưu 50 – 60 o C, dải pH hoạt động 5,0 – 9,0, được bảo quản ở nhiệt độ 4 o C Chế phẩm có dạng bột.

- Flavourzyme 500MG: Được sản xuất từ nấm mốc Aspergillus oryzae, Flavourzyme vừa thuộc nhóm endoprotease và exoprotease Điều kiện tối ưu của Flavourzyme là: Nhiệt độ 45 – 55 o C, pH 6 – 8 Chế phẩm được bảo quản trong tủ lạnh ở4 o C Chế phẩm dạng bột màu trắng nâu (trong từng lô, từng đợt sản xuất thì mức độ đậm nhạt của màu sắc của chế phẩm có thể khác nhau) Flavourzyme có thể thuỷ phân trên 70% mối liên kết peptide, sản phẩm thuỷ phân bằng Flavourzyme thơm ngon, không có độ đắng khi thuỷ phân ở mức độ vừa phải Chế phẩm không có các chất độc hại, hàm lượng muối thấp.

- Neutrase 0,8L: Được sản xuất từ vi khuẩn Bacillus amyloliquefaciens, thuộc nhóm endoprotease EC 3.4.24.28 Điều kiện tối ưu của Neutrase là: Nhiệt độ 40–50 o C, pH 7,0 Chế phẩm được bảo quản ở nhiệt độ 4 o C Chế phẩm này không chứa amylase, chứa một lượng β-glucanase không xác định Cần ion kẽm cho hoạt động của nó, ion

Ca 2+ có tác dụng làm bền enzyme, enzyme bị ức chế bởi EDTA Neutrase bị vô hoạt ở

- Protamex®: Là sản phẩm được sản xuất từ vi khuẩn Bacillus licheniformis, có hoạt tính 1,5 AU/g, thuộc nhóm endoprotease EC 3.4.21.62 Nhiệt độ tối ưu 35 – 60 o C, dải pH hoạt động 5,5 – 7,5, được bảo quản ở nhiệt độ 4 o C Chế phẩm có dạng bột.

Phương pháp xử lý bằng enzyme là phương pháp thân thiện với môi trường, điều kiện sản xuất bằng enzyme không đòi hỏi nhiệt độ cao, áp suất cao, ít tốn năng lượng.Cách thức thủy phân bằng enzyme khá đa dạng từ sử dụng một enzyme đơn đến kết hợp nhiều enzyme, thông thường là 2 protease (kết hợp giữa exo-protease với endo- protease) để tăng cường hiệu quả mong muốn.

Ứng dụng của enzyme protease trong thực phẩm

Do đặc điểm của cơ chất bị thủy phân bởi enzyme là những chất có liên kết bị thủy phân hay còn gọi là liên kết nhị dương và theo quá trình phản ứng thì sản phẩm gồm các polypeptide, peptone, peptide và acid amin Điều này có nghĩa là khối lượng phân tử của các chất trong sản phẩm sẽ rất khác nhau, có nhiều công trình nghiên cứu ứng dụng chế phẩm protease thương mại để thủy phân tạo sản phẩm theo mục đích sử dụng Riêng trong ngành công nghệ thực phẩm, ở mỗi một chuyên ngành hay công đoạn chế biến thì quá trình thủy phân được ứng dụng để đáp ứng một hay nhiều tiêu chí đặt ra.

Trong ngành công nghiệp chế biến thịt cá

Với mục đích chế biến sản phẩm giàu protein, các chế phẩm enzyme có nguồn gốc khác nhau sẽ cho ra những sản phẩm rất đa dạng như: papain, bromelain (nguồn thực vật) sẽ phân giải các amit, este, sản phẩm thu được là những este Còn đối với các enzyme có nguồn gốc vi sinh vật thì xúc tiến quá trình thủy phân protein cho sản phẩm giàu dinh dưỡng và hương vị đặc trưng (Đặng Thị Thu và ctv, 2012) Trong công nghệ chế biến, nguyên liệu có thể được ngâm, ướp hay tiêm chế phẩm enzyme vào động vật trước khi giết mổ làm cho thịt mềm hơn thích hợp cho chế biến bít-tết, quay nhưng lưu ý có thể lượng enzyme sử dụng tích tụ trong nội tạng động vật gây mùi khó chịu.

Ngoài ra, trong chế biến còn thủy phân những phần phụ của thịt như xương, đầu,da…được nghiền nhỏ trước khi thủy phân bằng chế phẩm enzyme trong thời gian 30 phút đến khoảng 4 giờ, sản phẩm của quá trình gồm mỡ, dịch lỏng, protein hòa tan…có thể tách những thành phần không mong muốn bằng phương pháp ly tâm, gạn lọc, sau đó trộn vào các khối thịt làm chất độn giống thịt Trường hợp này, sản phẩm sau trộn có hàm lượng protein phân bố đồng đều hơn, có độ dai dẻo tốt hơn (do tính keo dính của chất thủy phân), hương vị được tẩm vào tốt hơn (Đặng Thị Thu và ctv, 2012).

Theo Nguyễn Thị Quỳnh Hoa và Đống Thị Anh Đào (2016) sử dụng enzyme Alcalse để thủy phân protein thịt heo thu được dịch thủy phân chứa nhiều loại protein có khối lượng phân tử từ 3 đến trên 750 kDa, trong đó protein có kích thước dưới 50 kDa chiếm tỷ lệ khá cao (60,07%) thích hợp cho bệnh nhân có đường tiêu hóa yếu và bắt đầu phụ hồi chức năng tiêu hóa.

Sản phẩm thủy phân là hỗn hợp protein hòa tan và không hóa tan bao gồm những acid amin thay thế và không thay thế, đồng thời chứa ít chất béo phù hợp làm thức ăn cho người như bột dinh dưỡng, bánh snack hay làm thức ăn cho ngành nuôi trồng thủy sản (Nguyễn Thị Mỹ Hương, 2014).

Tác giả Trần Kiều Anh và ctv (2017) đã nghiên cứu các điều kiện thủy phân phụ phẩm cá hồi (Salmo salar), dịch thủy phân thu được có hàm lượng acid amin đạt 29,48 mg/ml và có hoạt tính chống ôxy hóa là 70,34% (đo qua khả năng bắt góc tự do DPPH) Kết quả này đã góp phần vào sự thành công của đề tài “Nghiên cứu tách chiết peptide mạch ngắn có hoạt tính sinh học để sản xuất thực phẩm chức năng dành cho bộ đội làm nhiệm vụ đặc biệt của Bộ Công Thương.

Nước mắm là chế phẩm thu được từ quá trình thủy phân cá dưới tác dụng của enzyme tạo thành peptide, acid amin, đồng thời màu sắc, mùi vị của nước mắm cũng dần dần được hình thành và mang tính đặc trưng cho mỗi loại Nước mắm là một gia vị nhưng cũng là loại thực phẩm có giá trị dinh dưỡng cao và được sử dụng rất phổ biến ở châu Á nói chung và Việt Nam nói riêng Nước mắm Việt Nam đã được phát triển từ lâu đời cùng với lịch sử dân tộc và mang bản sắc đặc thù Việt Nam Nước mắm hấp dẫn mọi người bởi cái hương vị đặc biệt của nó và bởi giá trị dinh dưỡng cao (Nguyễn Trọng Cẩn và ctv, 2011) Nước mắm truyền thống mang giá trị đặc trưng về mùi vị rất độc đáo nhưng thời gian chế biến kéo dài nên sử dụng chế phẩm enzyme thương mại thêm vào để rút ngắn thời gian, tăng độ đạm Để tạo được những thành phẩm đạt chất lượng cao, đặc trưng, nhiều nghiên cứu chỉ ra rằng enzyme protease trong sản xuất nước mắm gồm 3 hệ:

- Hệ men metalo-protease còn gọi là aminopeptide hay apazase có thể chịu được môi trường có nồng độ muối cao, hoạt tính khá mạnh thủy phân rộng rãi các pepetide.

- Hệ enzyme serin-protease: sản phẩm của hệ enzyme này là tạo ra những protein hòa tan Thường nó hoạt động mạnh sau khi các apazase thủy phân protein nguyên liệu từng đợt từ đầu ngoài amin vào tạo điều kiện cho hệ serin-protein hoạt động mạnh và sản phẩm của hệ đóng vai trò rất quan trọng trong sản phẩm cuối.

- Hệ men acid protease: hệ này thủy phân protein rất mạnh nhưng bị ức chế bởi nồng độ muối cao, do đó nó sẽ bị giảm dần khi muối hòa tan.

Do tính chất đặc hiệu của enzyme và các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình thủy phân, nhiều nghiên cứu đã chỉ ra sự khác biệt về thành phần acid amin và thành phần protein hoàn hảo (tỷ lệ acid amin thiết yếu trên tổng số acid amin) có trong nước mắm của các cơ sở sản xuất, các hợp chất bay hơi được giải phóng trong quá trình thủy phân tạo sản phẩm cũng rất đa dạng (Nguyễn Xuân Duy & Nguyễn Anh Tuấn, 2013).

Trong ngành công nghiệp chế biến ngũ cốc

Mỗi đối tượng khác nhau được thủy phân sẽ cho ra những sản phẩm mang tính rất đặc trưng của chúng Đối với cám gạo, sản phẩm thủy phân ngoài protein có khối lượng phân tử thấp còn có hợp chất phenoic hay acid gallic…dùng làm thực phẩm hay nước giải khát (Thamnarathip et al., 2016).

Bánh đậu nành có hàm lượng protein cao (41-50 %) được ứng nhiều trong chăn nuôi và trong thực phẩm nhưng trong đậu nành có những thành phần kháng dinh dưỡng, do đó cần thủy phân đậu nành để thu sản phẩm dinh dưỡng cao hơn là những acid amin, các polypeptide mạch ngắn (Dương Thị Hương Giang và ctv, 2006). Đối với đậu tương, thủy phân phải dùng tổng hợp nhiều enzyme nội phân và ngoại phân nhằm tạo ra sản phẩm đáp ứng được yêu cầu công nghệ như: tạo ra các hợp chất thơm hay những cơ chất cần thiết cho phản ứng Maillard (Đặng Thị Thu và ctv, 2012).

Trong ngành công nghiệp sản xuất sản phẩm từ sữa

Sữa và các sản phẩm chế biến từ sữa là những sản phẩm thực phẩm quan trọng ở các nước châu Âu và châu Mỹ Ngày nay, sữa và các sản phẩm từ sữa rất phổ biến ở châu Á và cả ở Việt Nam Chế biến các sản phẩm sữa không thể không sử dụng các chế phẩm enzyme Có thể nói, các chế phẩm enzyme đóng vai trò quyết định để tạo ra các sản phẩm từ sữa, đặc biệt chế phẩm protease (Nguyễn Đức Lượng, 2004).

Bước then chốt trong sản xuất pho-mai là quá trình tạo ra khối sữa đông Sữa sẽ tạo được cấu trúc gel nhờ các enzyme gây đông tụ sữa, hay còn gọi là tác nhân đông tụ Casein trong sữa mất đi trạng thái keo và tập hợp lại thành cấu trúc gel Sau khi cắt khối gel ra, dịch nhũ tương (liquid whey fractional) bao gồm protein nhũ tương (whey protein) các chất khoáng, đường lactose sẽ được tách ra khỏi khối sữa đông Khối sữa đông sau đó sẽ được ủ với nấm mốc Sau bước ép nước và tẩm muối, pho-mai sẽ được gữ trong một điều kiện nhất định để quá trình ủ chín xảy ra, thời gian ủ có thể từ vài tuần đến vài tháng thậm chí nhiều năm tùy loại phô mai.

Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình thủy phân bằng enzyme

Ảnh hưởng của nồng độ enzyme

Trong điều kiện dư thừa cơ chất, nghĩa là [S] >> [E] sẽ làm tăng tốc độ phản ứng vì nồng độ enzyme tăng Sự tăng tốc độ phản ứng trong tế bào sinh vật lại phụ thuộc rất nhiều vào khả năng điều hòa của gen Tốc độ phản ứng V = K[E] có dạng y = ax. Giá trị [E] được xác định bằng cách đo vận tốc phản ứng do enzyme đó xúc tác Nhìn chung tốc độ phản ứng phụ thuộc tuyến tính với lượng enzyme Nhưng nếu tăng nồng độ enzyme quá lớn, vận tốc phản ứng chậm.

Có nhiều trường hợp trong môi trường có chứa chất kìm hãm hay hoạt hóa thì vận tốc phản ứng do enzyme xúc tác không phụ thuộc tuyến tính với [E] đó. Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất

Khi nồng độ cơ chất thấp, tốc độ phản ứng phụ thuộc tuyến tính vào nồng độ cơ chất Khi tăng nồng độ cơ chất đến mức nào đó, nếu tiếp tục tăng nồng độ cơ chất thì tốc độ phản ứng cũng sẽ không tăng hoặc ức chế ngược lại hoạt động xúc tác của enzyme Với từng enzyme, nồng độ tới hạn của cơ chất cũng như với từng cơ chất, nồng độ tới hạn của enzyme phụ thuộc vào điều kiện của quá trình phản ứng Vì vậy, với từng enzyme khi dùng để thủy phân một cơ chất cụ thể, trong những điều kiện cụ thể, cần nghiên cứu để xác định nồng độ tới hạn của enzyme. Ảnh hưởng của điều kiện thủy phân

Theo quy luật của các phản ứng hóa học thông thường, nhiệt độ, thời gian và pH là các yếu tố có ảnh hưởng lớn nhất đến khả năng thủy phân, đặc biệt là nhiệt độ, thời gian thủy phân.

Tốc độ phản ứng tăng khi nhiệt độ tăng Tuy nhiên, tốc độ phản ứng chỉ tăng đến một giới hạn nhiệt độ nhất định Vượt quá giới hạn đó, tốc độ phản ứng sẽ giảm và dẫn đến mức triệt tiêu.Vì enzyme có bản chất là protein do đó khi tăng nhiệt độ tới một giới hạn nào đó thì tốc độ phản ứng enzyme sẽ bị giảm do sự biến tính của protein Sự gia tăng nhiệt độ làm tăng tốc độ phản ứng, vì các nguyên tử trong phân tử enzyme có năng lượng cao hơn và xu hướng lớn hơn để di chuyển Tuy nhiên, nhiệt độ bị giới hạn trong phạm vi sinh học bình thường Mỗi enzyme có một nhiệt độ tối thích khác nhau, nó phụ thuộc vào nhiều yếu tố như nguồn enzyme, cơ chất, pH môi trường, thời gian phản ứng… Khi nhiệt độ tăng, sự biến tính nhiệt phá hủy các hoạt động của các phân tử enzyme Điều này là do sự mở ra của chuỗi protein sau khi bị mất các liên kết yếu như liên kết hydro, vì thế vận tốc phản ứng bị giảm (Nguyễn Công Hà & Lê Nguyễn Đoan Duy, 2011).

Trong quá trình thủy phân, thời gian tác dụng của enzyme lên cơ chất dài hay ngắn phụ thuộc vào nhiều yếu tố: độ mịn của nguyên liệu, pH, nhiệt độ,… Thời gian thủy phân cần đủ dài để enzyme phân cắt các liên kết trong cơ chất tạo thành các sản phẩm cần thiết của quá trình thủy phân Khi cơ chất cần thủy phân đã thủy phân hết, quá trình thủy phân kết thúc Thời gian thủy phân phải thích hợp để đảm bảo hiệu suất cao đồng thời đảm bảo chất lượng sản phẩm tốt Trong thực tế, thời gian thủy phân phải xác định bằng thực nghiệm và kinh nghiệm thực tế cho từng quá trình thủy phân cụ thể (Nguyễn Trọng Cẩn và ctv, 1998).

Hơn thế nữa, enzyme rất nhạy cảm với pH của môi trường, do đó pH có ảnh hưởng mạnh mẽ đến tốc độ phản ứng của enzyme vì ảnh hưởng đến mức độ ion hóa cơ chất, ion hóa enzyme và đến độ bền của protein – enzyme Mỗi enzyme có một giá trị pH tối ưu cho độ hoạt động của nó Cùng một loại enzyme nhưng thu từ các nguồn khác nhau cũng có pH tối ưu khác nhau (Phan Thị Bích Trâm, 2010) Ở pH tối ưu, tốc độ phản ứng của enzyme là tốt nhất, với những giá trị lớn hơn hoặc nhỏ hơn pH tối ưu, tốc độ phản ứng enzyme giảm dần Tuy nhiên, đối với một enzyme nhất định, pH tối ưu không phải lúc nào cũng cố định mà phụ thuộc vào nhiều yếu tố khác như: tính chất và nồng độ cơ chất, dung dịch đệm, nhiệt độ phản ứng… Với nhiều enzyme protease, pH thích hợp ở vùng trung tính, nhưng cũng có một số enzyme có pH thích hợp rất thấp (pepsin, protease acid của vi sinh vật,…) hoặc khá cao như subtilin, có pH thích hợp lớn hơn 10 (Nguyễn Trọng Cẩn và ctv., 1998).

Enzyme bị ảnh hưởng bởi sự thay đổi pH Giá trị pH giảm thấp hay quá cao ngoài điểm tối ưu thì tốc độ phản ứng thường giảm nhanh và hoạt tính của hầu hết enzyme giảm một phần hay hoàn toàn, có thể do enzyme bị biến tính hay bị phân ly một co-factor quan trọng nào đó Tại điểm đẳng điện, enzyme bị biến tính dẫn đến không còn hoạt tính sinh học Nếu có biện pháp làm cho enzyme hòa tan trở lại thì khả năng hồi phục một phần hoạt tính tối đa của enzyme là có thể.

Hợp chất bay hơi và phương pháp xác định

Sự hình thành hợp chất bay hơi

Những hợp chất hữu cơ bay hơi (Volatile organic compounds - VOC) là những hợp chất hữu cơ chứa một hoặc nhiều nguyên tử cacbon có áp suất bốc hơi cao, dễ dàng bay hơi trong không khí Chúng được hình thành bởi một nhóm chất hóa học phức tạp như ester, rượu, andehyde, cetone, lactone, ketone và terpenoid Các hợp chất bay hơi có thể sinh ra từ chất béo, các acid amin, terpenoid và carotenoid (El Hadi & Zhang, 2013; Goff & Klee, 2006) Ngoài ra, một số hợp chất sulfur như S-methyl thiobutanoate, 3-(methylthio) propanal, 2-(methylthio) ethyl acetate, 3-(methylthio) ethyl propanoate, và 3-(methylthio) propyl acetate cũng góp phần vào hương vị của trái cây (Song & Forney, 2007).

Hợp chất terpene: hợp chất terpene gồm mono- và sesquiterpene hiện diện trong rau quả, gia vị Monoterpene với nhóm hydroxyl như linalool, geraniol và nerol hiện diện trong nước ép trái cây có ít nhất một phần là glycoside Terpene với hai hoặc ba nhóm hydroxyl qua các phản ứng tạo thành hotrienol và neroloxide từ 3,7-dimethylocta-

1,3-dien-3,7-diol, hoặc cis và trans-furanlinalool oxide từ 3,7-dimethylocta-1-en-3,6,7- triol trong nước ép nho (Belitz, Grosch, & Schieberle, 2009).

Các hợp chất bay hơi có thể đặc trưng cho mùi vị của một loại trái cây, như đặc trưng về hương vị của dâu tây, cam quýt Hợp chất dễ bay hơi terpenoid có khả năng có nguồn gốc từ các carotenoid, là những thành phần quan trọng của hương vị và hương thơm trong nhiều loại trái cây Trong số này có β-ionone, geranylacetone (6, 10-dimethyl-5,9-undecadien-2-one), pseudoionone (6,10-dimethyl-3,5,9-undecatrien- 2-one), β-cyclocitral, geranial, theaspirone, α-damascenone and β-damascenone Dựa vào cấu trúc cho thấy, chúng có nguồn gốc cơ bản isoprenoid và được xem như là sản phẩm của sự oxy hóa carotenoid (Wishart, 2008).

Các hydrocarbon và este: trong các loại trái cây và rau quả như táo, khóm, chanh dây, kiwi, ngò, cần tây chứa các hydrocacbon C11 chưa bão hòa với vai trò là chất tạo nên hương vị, như (E, Z)-1,3,5-undecatriene và (E, Z, Z)-1,3,5,8- undecatetraene. Người ta cho rằng, các hydrocacbon được hình thành từ các acid béo không bão hòa bởi oxy hóa β, xúc tác bởi lipoxygenase, quá trình oxy hóa của các gốc tự do với các ion carbonium và phản ứng khử carboxyl Trong quá trình đồng hóa được sử dụng trong quá trình chế biến nước trái cây, các este nhanh chóng bị thủy phân bởi sự hiện diện của các enzyme thủy phân và hình thành mùi thơm trái cây.

Các lactone: nhiều lactone được tìm thấy trong thực phẩm Một số đại diện thuộc các nhóm chất là hương thơm đặc trưng của bơ, dầu dừa, và nhiều loại trái cây Mùi thơm của lactone phần nào rất dễ chịu, đáng chú ý các chất này làm hợp chất thơm thương mại của thực phẩm.

Các thành phần carbonyl và rượu: Các acid béo và acid amin là tiền chất của một số lượng lớn của các aldehyde dễ bay hơi, trong khi carbohydrate thoái hóa là nguồn gốc tạo ethanal Sự hình thành các hợp chất bay hơi có mùi thơm từ linoleic và acid linolenic trong trái cây và rau quả bởi sự oxy hóa lipoxygenase hoặc kết hợp với một emzyme lyase hydroperoxide Việc phân cắt do oxy hóa cho ra acid oxo, các aldehyde và rượu Trong số các aldehyde được hình thành như hexanal, (E)-2-hexenal,

(Z)-3-hexenal and/or (E)-2-nonenal, (Z)-3-nonenal, (E, Z)-2,6-nonadienal và (Z, Z)-3,6- nonadiena là các hợp chất bay hơi quan trọng nhất Aldehyde hình thành bởi sự phân hủy Strecker cũng có thể thu được bởi chuyển hóa các sản phẩm của enzyme từ chuyển hóa amin hoặc khử amin do oxy hóa của các acid amin Đầu tiên, các acid amin được chuyển đổi enzyme với acid α-keto và sau đó với aldehyde bằng phản ứng khử carboxyl.

Hầu hết các loại trái cây sản sinh số lượng đáng kể các hợp chất dễ bay hơi như là chất chỉ thị của quá trình chín của trái cây Nhiều trong số các hợp chất dễ bay hơi được sản sinh với dạng vết, dưới ngưỡng của hầu hết các công cụ phân tích, nhưng có thể được phát hiện bằng khứu giác của con người Chất dễ bay hơi có thể được phân loại như các hợp chất chính hay phụ, cho biết chúng đã có mặt trong mô quả còn nguyên vẹn hoặc được sản sinh ra như là một kết quả của sự phá vỡ mô Các hợp chất bay hơi ảnh hưởng trực tiếp đến giá trị cảm quan của sản phẩm trái cây tươi và chế biến, chúng được hình thành bởi một nhóm chất hóa học phức tạp như ester, rượu, andehyde, cetone, lactone, ketone và terpenoid Các hợp chất bay hơi có thể sinh ra từ chất béo, các acid amin, terpenoid và carotenoid [45, 46] Ngoài ra, một số hợp chất sulfur như S-methyl thiobutanoate, 3-(methylthio) propanal, 2-(methylthio) ethyl acetate, 3-(methylthio) ethyl propanoate, và 3-(methylthio) propyl acetate cũng góp phần vào hương vị của trái cây (Song & Forney, 2007).

Ta có thể thấy rõ trong sản phẩm nước mắm Cũng là sản phẩm nước mắm nhưng mỗi loại lại có những hợp chất bay hơi khác nhau Theo nghiên cứu của Nguyễn Xuân Duy và Nguyễn Anh Tuấn (2013về các hợp chất bay hơi trong nước mắm thì thành phần và hàm lượng các chất bay hơi rất phức tạp và khác nhau tùy thuộc vào loại nước mắm, ởViệt Nam nước mắm CSFS và 584FS có 22 hợp chất dễ bay hơi, trong khi KHFS có

19 hợp chất, NTFS chỉ có 16 hợp chất bay hơi ) (Nguyễn Xuân Duy & Nguyễn Anh Tuấn, 2013) Trong đó CSFS có 5 hợp chất bay hơi chiếm hàm lượng cao là n-Decyl acetate (25,31%), cacbon disulfide (14,04%), sorbic (11,05%) và isovaleric (9,18%), tổng hàm lượng của chúng chiếm 69% trong tổng số các chất bay hơi được nhận diện trong mẫu nước mắm Hay chanh Nhật Bản được sử dụng như một loại thực phẩm, đồ uống thậm chí là mỹ phẩm, khi nghiên cứu về Chanh Nhật Bản chứa 39 hợp chất thơm trong đó monoterpene chiếm 90,52%, gồm limonene, γ-terpinen, β-phellandrene, β- myrcene và α-pinene (Yoshihiko, Mei, Yukinori, & Mamoru, 2008).

Một số loại nước ép có chứa các hợp chất dễ bay hơi sinh ra do ảnh hưởng quá trình chế biến do hoạt động của enzyme lipoxygenase, oxy hóa carotenoid và phản ứng Maillard có thể được kích hoạt trong xử lý nhiệt (Elizabeth, 2011) Xử lý nhiệt trong chế biến làm thay đổi một số hợp chất bay hơi liên quan đến hương vị cà chua như alcohol, chất thơm aldehyde, terpenoid, citral, P-ionone, 6-methyl-5-hepten-2-one và pseudo-ionone Ngoài ra, xử lý nhiệt cũng gây ra mùi không tốt do sinh ra các hợp chất furfural, dimethyl disulfide, 2-isobutyl-thiazole và 3-methyl-butanal Các hợp chất như 2-methylfuran,

2-ethylfuran, 3-(4-methyl-3- pentyl)-furan, 2- or 3-ethyl-thiophene, 2-methyl-2- thiazoline, cis- and trans-2- hexenal, 2-octanone và 6-methyl-5-hepten-2-ol sinh ra khi xử lý nhiệt ở 80 o C Theo Vervoort et al., 2012, nước ép cam sau khi xử lý nhiệt và bảo quản ở nhiệt độ 4 o C trong 28 ngày, các hợp chất bay hơi được hình thành như β- Pinene, Decana, α-Copaene, β-Copaene, α-Caryophyllene, Germacrene D, β- Caryophyllene, α-Panasinsen, Valencene, δ-Selinene Nước ép trộn giữa cam và cà rốt sau khi thanh trùng ở 100 o C trong 10 phút và được bảo quản lạnh Kết quả sau 14 ngày bảo quản các thành phần bay hơi của sản phẩm được xác định gồm 7 rượu, 4 aldehyde,

Con đường sinh ra các hợp chất bay hơi có nguồn gốc từ acid linoleic (El Hadi & Zhang, 2013)

Với nguồn phụ phẩm là cám gạo, nhìn chung những nghiên cứu liên quan rất ít, đặc biệt là những hợp chất bay hơi Tác giả Henk (1991) đã chỉ ra những chất tạo nên mùi đặc trưng của cám gạo là những nhóm chất gồm este, rượu, các acid, Kenton, aldehyde

Bảng 2.3 Số lượng các hợp chất dễ bay hơi thuộc các lớp hóa học khác nhau được báo cáo trong cám gạo (Nguồn: Henk, 1991)

Thành phần Số hợp chất (chất)

Cũng theo công bố của Henk (1991), mùi của cám gạo cũng được ảnh hưởng từ mùi của loại gạo Gạo khi nấu lên các mùi được hình thành phần lớn do các tiền chất là acid béo không no dưới tác dụng của nhiệt (nấu) chúng tạo thành chất mùi Bảng 2.4.

Bảng 2.4 Chất bay hơi trong gạo nấu truyền thống (Nguồn: Henk, 1991)

Bảng 2.4 cho thấy các chất tạo mùi là những chất béo không no, đây là thành phẩn chất béo chiếm tỷ lệ cao trong cám gạo, do đó, khi chế biến nhiệt và trong bảo quản cần chú ý kiểm soát chúng Tuy nhiên, có một vài tác giả đã xác định nhóm chất bay hơi có trong gạo thơm Jasmin của Việt Nam bằng các phương pháp khác nhau như: kết hợp chưng cất và trích ly, tẩm trích hay kết hợp vi ly trích pha rắn với sắc ký khí khối phổ để phân tích trực tiếp mùi thơm trong gạo (Mã Thái Hòa & Lê Ngọc Thạch, 2011) Việc phân tích xác định một chất bay hơi hay mùi thơm có thể để giải mã và định lượng chất lượng hương vị được xác định bởi đặc tính quan trọng nhất để nhận ra và ưu tiên các hợp chất hương thơm hữu cơ và phân biệt chúng với các hợp chất dễ bay hơi khác (Kritel Kaseleht, 2012) Điều này rất quan trọng khi chế biến những sản phẩm thực phẩm mang hợp chất bay hơi.

Phương pháp xác định hợp chất bay hơi

Các hợp chất bay hơi là thành phần quan trọng trong thực phẩm Đây là thành phần tạo nên đặc điểm đặc trưng, khác biệt Chúng có thể được tổng hợp và phát ra từ nguồn nguyên liệu (như mùi của trái cây được hình thành trong quá trình sinh trưởng, phát triển) cũng có thể được sinh ra hay thêm vào công đoạn chế biến, là một chỉ tiêu quan trọng để phản ánh chất lượng của sản phẩm Chúng chủ yếu bao gồm các este, rượu, andehyde, ceton, lacton, tecpenoit và apocarotenoit Nhiều yếu tố ảnh hưởng đến thành phần dễ bay hơi, bao gồm cấu tạo gen, mức độ trưởng thành, điều kiện môi trường, xử lý và bảo quản sau thu hoạch Có một số con đường liên quan đến sinh tổng hợp dễ bay hơi bắt đầu từ lipid, acid amin, tecpenoit và carotenoit (El Hadi & Zhang,

2013) Do đó, tùy vào mỗi loại thực phẩm, mục đích sử dụng sẽ có những phương pháp xác định hợp chất bay hơi phù hợp Có thể sử dụng một phương pháp hoặc kết hợp nhiều phương pháp nhằm đạt được mục đích nghiên cứu Thiết bị thường dùng là hệ thống sắc ký khí (GC) và khối phổ (GC/MS).

Servili (1998) đã so sánh giữa vi phân đoạn pha rắn (SPME) và tĩnh truyền thống (SHSA) và không gian đầu động (DHSA) dùng phân tích những hợp chất này thuộc các lớp hóa học sau: ceton, andehyde, rượu, este, ete, hydrocacbon, lưu huỳnh, hợp chất nitơ và oxy, phenol, hợp chất dị vòng chứa oxy, acid tự do và lacton trong nước ép cà chua Sự khác biệt quan trọng nhất giữa các phương pháp này liên quan đến việc lấy mẫu, thời gian và nhiệt độ tối ưu của quá trình thực hiện.

Năm 2010, một phương pháp được phát triển để phân tích các hợp chất hữu cơ dễ bay hơi (VOC) trong thực phẩm, đồ uống và các mẫu mỹ phẩm VOC được phân lập từ dung dịch tiêu chuẩn hoặc các mẫu bằng hệ thống thanh lọc và bẫy (PT) được xác định và định lượng bằng máy sắc ký khí kết hợp máy dò ion hóa ảnh (GC–PID) Các điều kiện thử nghiệm đã được tối ưu hóa và hiệu suất của hệ thống đã được đánh giá Các đường chuẩn tuyến tính thu được với mối tương quan hệ số ít nhất là 0,9981 Giới hạn phát hiện được tính cho thể tích mẫu 5 ml, nằm trong khoảng từ 0,3056 ng ml -1 đối với toluen đến 7,1373 ng ml -1 đối với propionaldehyde Phương pháp đã được áp dụng thành công để phân tích định lượng các mẫu thực phẩm và mỹ phẩm. Propionialdehyde và butyraldehyde không được tìm thấy trong các mẫu thực phẩm. Benzen và toluen không được phát hiện trong các mẫu rượu vang Axeton được phát hiện trong tất cả các mẫu, ngoại trừ hai mẫu Phương pháp này đáng tin cậy và được sử dụng để giám sát định kỳ trong thực phẩm, đồ uống và mỹ phẩm (Zhao et al., 2010).

Trong nghiên cứu mùi thơm của gạo Jasmine 85, ba phương pháp ly trích chất mùi: phương pháp vi ly trích pha rắn (Solid Phase Microextraction, SPME), phương pháp chưng cất và ly trích đồng thời (Simultaneous Distillation Extraction, SDE), phương pháp tẩm trích đã được sử dụng (Mã Thái Hòa & Lê Ngọc Thạch, 2011) Sau đó sử dụng hệ thống sắc kí khí GC/FID và GC/MS xác định thành phần hợp chất mùi trong mẫu Đối với Nguyễn Xuân Duy và Nguyễn Anh Tuấn (2013) đã lựa chọn chương trình chạy nhiệt phù hợp cho hệ thống sắc ký khí ghép khối phổ để xác định hợp chất bay hơi trong nước mắm thương mại.

Như vậy, hệ thống sắc ký khí là thiết bị hữu hiệu trong xác định hợp chất bay hơi Để tăng hiệu quả, các phương pháp xử lý mẫu, chương trình nhiệt thích hợp sẽ cho kết quả chính xác trong từng nghiên cứu.

Phương pháp Metabolomics trong nghiên cứu thực phẩm

Metabolomics, nghiên cứu chuyển hóa chất, đã nổi lên như là một công cụ quan trọng trong nhiều lĩnh vực như chữa bệnh và dinh dưỡng Trong khoa học thực phẩm, metabolomics gần đây đã được xem như một công cụ đánh giá chất lượng, quá trình chế biến và tính an toàn của nguyên liệu và sản phẩm cuối cùng Metabolomics, nghiên cứu về các chất chuyển hóa nhỏ có thể có trong một hệ thống, đã trở thành một công cụ quan trọng trong nhiều lĩnh vực nghiên cứu Các nghiên cứu và quan điểm về các bệnh của con người, khám phá dược phẩm, phân tích thực vật, dinh dưỡng con người… đã cho thấy tác động rộng lớn và sự phát triển nhanh chóng của sự chuyển hóa (Juan, 2009) Sử dụng công cụ phân tích metabolomics được phân loại ở Hình 2.9.

Metabolomics là một công cụ quan trọng nghiên cứu nhiều nhất chất chuyển hóa nhỏ có thể trong tìm ra thuốc chữa bệnh cho người, phân tích thực vật, dinh dưỡng cho con người và các lĩnh vực khác, đã cho thấy tác động rộng rãi và sự phát triển nhanh chóng của các chất chuyển hóa.

Các phân tích chuyển hóa thường được phân loại là có mục tiêu hoặc không có mục tiêu (Hình 2.9).

Sơ đồ phân loại chung phương pháp phân tích metabolomics (Juan, 2009) Các phân tích mục tiêu rất quan trọng để đánh giá hoạt động của một nhóm hợp chất cụ thể trong mẫu trong các điều kiện xác định Các chất chuyển hóa mục tiêu thường yêu cầu mức độ tinh sạch cao hơn và chiết xuất có chọn lọc các chất chuyển hóa Ngược lại, các chất chuyển hóa không mục tiêu (còn gọi là toàn diện) tập trung vào việc phát hiện càng nhiều nhóm chất chuyển hóa càng tốt để thu được các mẫu hoặc dấu vân tay mà không nhất thiết phải xác định hoặc định lượng một hợp chất cụ thể Vì vậy, dựa vào mục tiêu phân tích và sử dụng, hầu hết những nghiên cứu chuyển hóa được phân loại là phân biệt/tách chất, cung cấp thông tin và tiên đoán Các phân tích phân biệt/tách chất nhằm mục đích tìm ra sự khác biệt giữa các quần thể mẫu mà không cần thiết phải tạo ra các mô hình thống kê hoặc đánh giá các con đường khả thi có thể làm sáng tỏ sự khác biệt đó Sự phân biệt thường đạt được bằng cách sử dụng các kỹ thuật phân tích dữ liệu đa biến nhằm tối đa hóa việc phân loại, phân tích các thành phần chính (PCA) là công cụ được sử dụng nhiều nhất Với các phân tích chuyển hóa tập trung vào cung cấp thông tin đặc điểm nhận dạng và định lượng các chất chuyển hóa được nhắm mục tiêu hoặc không được nhắm mục tiêu để thu được thông tin nội tại của mẫu Các chất chuyển hóa nguyên bản đã được sử dụng trong việc phát triển và cập nhật liên tục các cơ sở dữ liệu về chất chuyển hóa Các con đường khả thi, khám phá các hợp chất hoạt tính sinh học mới, khám phá các dấu ấn sinh học, tạo cơ sở dữ liệu về chất chuyển hóa chuyên biệt và các nghiên cứu về chức năng của chất chuyển hóa cũng có thể được thực hiện bằng các nghiên cứu thu nhận thông tin chuyển hóa Cuối cùng, một số báo cáo về chuyển hóa đã mang tính tiên đoán Trong trường hợp này, các mô hình thống kê dựa trên dữ liệu và độ phong phú của chất chuyển hóa được tạo ra để dự đoán một biến số khó định lượng bằng các phương tiện khác.

Trong khoa học thực phẩm, các chất chuyển hóa có khả năng giải quyết các vấn đề lớn trên toàn thế giới vì nó đang được ứng dụng trong thực phẩm Hơn nữa, chuyển hóa được coi là một công cụ hiệu quả để giải quyết các nhu cầu trong tương lai trong nông nghiệp Các chất chuyển hóa mang tính phân biệt, cung cấp thông tin và dự đoán gần đây đã được sử dụng kết hợp để phân tích chất lượng, dinh dưỡng và thành phần thực phẩm với sự mở rộng đáng kể sang các ứng dụng thực phẩm khác trong những năm qua.

Bảng 2.6 Số lượng đỉnh phổ biến nhận được trong các chất chuyển hóa thực phẩm

STT Thiết bị Số lượng peak

Ghi chú: Trên cùng một đối lượng nghiên cứu là trà xanh

Có nhiều kỹ thuật phân tích được sử dụng trong nghiên cứu metabolomics như kỹ thuật sắc ký khí, sắc ký mao quản, sắc ký lỏng hiệu năng cao hay các kỹ thuật phức hợp như: sắc ký khí-khối phổ, sắc ký lỏng-khối phổ, các kỹ thuật nhận dạng chất và mỗi một loại thiết bị lại cho những kết quả phù hợp với nghiên cứu như Bảng 2.6.

Tóm lại, nghiên cứu chất chuyển hóa đã cho thấy là một công cụ quan trọng cho sự tiến bộ của các lĩnh vực khoa học thực phẩm chính như tuân thủ các quy định, chế biến, chất lượng, an toàn và vi sinh Các nghiên cứu gần đây cho thấy rằng tiềm năng của các chất chuyển hóa trong khoa học thực phẩm có thể được mở rộng sang lĩnh vực phát triển sản phẩm thực phẩm bằng cách xác định các hợp chất có thể phù hợp với sở thích khẩu vị của người tiêu dùng Đồng thời, sự phát triển này cũng cho thấy tiềm năng của các phân tích phân biệt, dự đoán và cung cấp thông tin trong giải quyết các vấn đề quan trọng và cung cấp thông tin cho ngành công nghiệp thực phẩm.

Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước

Nghiên cứu trong nước liên quan

Đối với phụ phẩm xay xát, cám gạo là loại có giá trị kinh tế cao hơn và chứa nhiều chất dinh dưỡng, tuy nhiên, việc khai thác còn nhiều hạn chế Cám gạo được dùng nhiều nhất là làm thức ăn chăn nuôi thủy sản và gia súc.

Nguyễn Đức Tiến và cộng sự (2013) tại Viện cơ điện nông nghiệp và Công nghệ sau thu hoạch, đã nghiên cứu thành công công nghệ sản xuất gamma oryzanol từ cám gạo và đưa ra thị trường với nhiều công dụng: chống oxy hoá, chống viêm loét, đặc biệt là viêm loét dạ dày, giảm mỡ trong máu, hoạt tính như proestrogen, tăng lưu thông máu, giảm cholesterol trong máu, giảm mỡ trong cơ thể, tăng phát triển mao quản trên biểu bì da, ngăn xâm nhập của tia cực tím, cản trở hoạt động bài tiết sắc tố melanin trong biểu bì và phòng chống nám da. Để tận dụng dầu trong tự nhiên làm năng lượng thay thế, Trần Quang Hải và LêThị Vân (2011), Trường Đại học Mỏ địa chất nghiên cứu chiết xuất dầu biodiesel từ cám gạo Theo lý thuyết lượng dầu có thể tách từ 15-32%, tức là cứ 1 triệu tấn cám sẽ thu được 150 – 320 ngàn tấn dầu Lượng dầu cám này qua quá trình este hóa sẽ chuyển thành biodiesel dùng thay thế nguồn năng lượng hóa thạch.

Năm 2015, Hà Thị Dung đã nghiên cứu tách chiết acid phytic và ứng dụng vào việc chống oxy hóa lipid cho thịt cá xay Acid phytic là chất chống oxy hóa tự nhiên chứa nhiều hoạt tính sinh học nhưng ít được biết đến, nó có nhiều trong ngũ cốc, đặc biệt là cám gạo.

Năm 2016, Trần Ngọc Liên và Nguyễn Minh Thủy đã sử dụng enzyme thủy phân cám gạo giống IR5451 thu nhận đường glucose Đây cũng là một công bố hiếm hoi về nguồn phụ phẩm giàu dinh dưỡng này (Trần Ngọc Liên và Nguyễn Minh Thủy, 2016).

Từ giá trị dinh dưỡng cao và nguồn dồi dào, năm 2017, nhóm nghiên cứu của GS.TS Lê Văn Việt Mẫn đã ứng dụng tạo sản phẩm bánh quy giàu chất xơ từ cám gạo tách lipid Nhóm nghiên cứu đã thực hiện hai mẫu bánh quy giàu chất xơ từ cám gạo tách lipid gồm: mẫu bánh quy giàu xơ sử dụng 40% cám gạo tách lipid và chưa qua xử lý enzyme, mẫu bánh quy giàu xơ sử dụng 50% cám gạo tách lipid và đã qua xử lý enzyme Cả hai mẫu bánh đã được gửi đi kiểm nghiệm các chỉ tiêu vi sinh, kiểm nghiệm các chỉ tiêu hóa học, đánh giá cảm quan cho thấy đạt yêu cầu chỉ tiêu vi sinh và cảm quan theo TCVN 5909-1995 Ngoài hàm lượng chất xơ, hàm lượng protein và một số khoáng chất trong bánh bổ sung cám gạo tách lipid cũng cao hơn cũng cao hơn so với bánh quy bình thường Điều này là do trong cám gạo rất giàu protein, khoáng chất (K, Ca, Mg và Fe), vitamin (đặc biệt là vitamin nhóm B), chất xơ hòa tan có khả năng tiêu hóa và các hoạt chất có khả năng chống oxy hóa cao (phenolic, flavonoid, tocotrienol…) Trong nghiên cứu này, mẫu cám gạo chưa xử lý enzyme và đã xử lý enzyme có hàm lượng chất xơ tổng (27,21 và 25,87%) cao hơn rất nhiều so với bột mì (3,7%); hàm lượng protein 15,6%, cao hơn hẳn so với giá trị 9,6% của bột mì Đồng thời, chỉ số đường huyết của sản phẩm ở mức trung bình đến thấp, đáp ứng yêu cầu của người ăn kiêng hiện nay.

FOS ngày càng được sử dụng rộng rãi để bổ sung vào thực phẩm như sữa, bánh kẹo…vì những đặc tính sinh học có lợi cho cơ thể con người Các nhà khoa học đã chứng minh FOS có khả năng cải thiện hệ vi sinh vật hữu ích trong đường ruột(Bifidobacteria, Lactobaccilli), ít gây sâu răng, giảm lượng triglycerides máu, tăng khả năng hấp thu calcium cho cơ thể…nên có tác dụng tốt đối với trẻ em, người già, các bệnh tiểu đường, béo phì, mỡ máu (Lê Thị Hồng Ánh, 2013).

Nghiên cứu ngoài nước liên quan

Gerhardt và Gallo (1998) đã có công trình nghiên cứu về cám gạo chứa chất xơ hòa tan, dầu cám gạo có tác dụng hạ huyết áp Cám gạo đầy đủ chất béo được so sánh với cám yến mạch và giả dược làm từ tinh bột gạo được sử dụng ở người tăng lipid máu để xem liệu nó có thể có vai trò gì trong việc điều trị chứng tăng lipid máu hay không và công trình nghiên cứu đã kết luận rằng cám gạo hoặc cám yến mạch ổn định, chứa đầy đủ chất béo, được thêm vào chế độ ăn uống của người lớn bị tăng lipid máu có kiểm soát làm giảm cholesterol và LDL-C và cải thiện tỷ lệ lipid ở 78% những người này Cám gạo, cũng như cám yến mạch, nên được đưa vào chế độ ăn uống của những người bị tăng lipid máu.

Trong số các sản phẩm phụ của gạo, cám gạo đã được nghiên cứu rất nhiều trên thế giới Do nó chứa chất phytochemicals như γ-oryzanol, vitamin E, chủ yếu là tocotrienols và chất xơ ăn kiêng Theo Norhaizan et al (2013) đánh giá trên các tài liệu hiện có về vai trò tiềm năng của các sản phẩm phụ của gạo, không chỉ tập trung vào vai trò của cám gạo mà còn về vai trò của các sản phẩm phụ khác của gạo, như mầm gạo và trấu, trong việc kiểm soát bệnh tật, các ứng dụng khác trong ngành công nghiệp thực phẩm.

Theriault et al (1999) đã phân tích thành phần acid amin trong dịch chiết protein từ cám gạo cho thấy nguồn protein này có chứa các acid amin thiết yếu cho trẻ 2-5 tuổi giống như kết quả phân tích dịch casein và protein từ đậu nành.

Trước đây, cám gạo được xem là chất thải nông nghiệp, giá trị kinh tế rất thấp, được sử dụng làm thức ăn gia súc, thủy sản Những nghiên cứu trong nước còn rất hạn chế, chủ yếu chỉ mới dừng lại ở việc tách dầu cám Việc nghiên cứu chuyên sâu về ứng dụng cám gạo trong sản xuất thực phẩm cho người được Rawdkuen (2014) công bố. Theo kết quả nghiên cứu thì sử dụng toàn bộ cám gạo hữu cơ để sản xuất sữa cám gạo (RBM-rice bran milk) Các chỉ tiêu chất lượng về lý hóa, độ ổn định, tính chất sinh học và cảm quan của RBM được so sánh với sữa đậu nành thương mại Đánh giá sơ lược cảm quan cho thấy chỉ có thuộc tính màu sắc là gần giống với sữa đậu nành thương mại, trong khi sự khác biệt lớn được quan sát thấy ở các thuộc tính trạng thái, mùi, hương vị, độ ngọt và mức độ ưa thích tổng thể Những phát hiện này có thể được sử dụng làm kết quả sơ bộ để phát triển sữa cám gạo hữu cơ đáp ứng các tiêu chuẩn chất lượng của người tiêu dùng.

Trong cám gạo có rất nhiều chất rất tốt cho sức khỏe Chúng có thể dùng điều chế các sản phẩm thực phẩm chức năng Năm 2013, Park et al đã thử nghiệm đặc tính miễn dịch của hợp chất glycoprotein trong cám gạo Kết quả cho thấy tiềm năng củaGFRB (glycoprotein fraction from rice (Oryza sativa) bran) như một chất điều trị chức năng với hoạt tính kích thích miễn dịch trong sản xuất nitric oxide (NO), nhân tố gây hoại tử khối u Đến năm 2015, khoa học đã chứng minh rằng cám gạo là một loại thực phẩm chức năng đầy hứa hẹn và được đánh giá có công dụng trong việc ngăn chặn sự xâm nhập của vi khuẩn Salmonella và điều hòa miễn dịch đường ruột ở người(Goodyear et al., 2015) Tuy nhiên, mỗi giống lúa lại có đặc tính gen ảnh hưởng đến dinh dưỡng khác nhau của cám gạo, do đó nghiên cứu của Zarei et al., (2018) bằng phương pháp “Non-Targeted Metabolomics” đã đánh giá sự biến đổi trong bộ chuyển hóa cám gạo của 17 giống cây trồng và xác định các mối quan hệ giữa gen-chất chuyển hóa có liên quan đến dinh dưỡng và dược chất của cám gạo.

Theo công bố năm 2016 của Thamnarathip và cộng sự, nếu sử dụng nguồn dịch cám thủy phân để sản xuất ra các sản phẩm giàu protein và chất chống oxy hoá thì thủy phân bằng enzyme Alcalase là hiệu quả nhất (trong 3 enzyme Alcalase, Flavourzyme và Neutrase) cung cấp dịch thủy phân với hàm lượng protein cao nhất (Thamnarathip et al., 2016) Các điều kiện thủy phân tối ưu là 2 giờ sử dụng hàm lượng protein Alcalase-năng suất 30,3%, sản lượng protein 56,6%, TPC 22,1 mg GAE/g, ABTS 7,57 mg GAE/g và FRAP của 152 mM Fe2þ/g Các peptide phân đoạn từ quá trình thủy phân này sử dụng sắc ký trao đổi anion cho thấy hoạt tính chống oxy hoá cao chứa cả hai phần tích điện âm và dương với một MW nhỏ là 6 kDa.

Trong công bố của Feiyue et al (2021), đã khẳng định kết hợp các phương pháp xử lý để tạo ra sản phẩm sản phẩm chứa chất xơ ăn kiêng từ cám gạo, đã mở ra một hướng ứng dụng tiềm năng.

Noureen et al (2021) đã sử dụng 25 loại vi khuẩn trong khảo sát quá trình lên men cám gạo để vô hiệu hóa lipase trong cám gạo mà không ảnh hưởng đến giá trị dinh dưỡng ban đầu của nó Nhóm đã kết luận Lactobacillus delbrueckii S2,

Lactobacillus casei S5 và Lactobacillus plantarum S13 có khả năng tăng thời gian sử dụng và ngăn ngừa ôi hóa cám gạo.

Cũng liên quan đến quá trình thủy phân của các enzyme thương mại, nhiều tác giả đã so sánh hiệu suất thủy phân của các enzyme Trên nguyên liệu là cá ngừ, với tỷ lệ nguyên liệu/nước là 1:1 ở pH tự nhiên của nguyên liệu, độ thủy phân, hàm lượng protein và lượng acid amin trong sản phẩm thu được thì ở Alcalase là cao hơn Protamex (Ovissipour, M., Benjakul, S., Safari, R., Motamedzadegan, 2010) Và cũng trên nguyên liệu cá ngừ, tác giả mở rộng hơn cho nhiều enzyme, chế độ thủy phân và lượng acid amin tryptophan tự do của sản phẩm thủy phân cá ngừ bằng các loại proteinase khác nhau (Alcalase, Protamex, Neutrase và Flavourzyme) trong thời gian 60, 120, 180 và

240 phút với tỷ lệ enzyme là 0,5, 1, 1,5 và 2% so với khối lượng nguyên liệu, cho thấy thời gian càng cao thì càng tăng độ thủy phân Alcalase cho độ thủy phân cao nhất tiếp đến là Protamex, Flavourzyme và Neutrase (Herpandi, Huda, Rosma, & Wan Nadiah, 2012).

Từ những công trình khoa học đã công bố nhận thấy rằng cám gạo chứa nhiều dinh dưỡng, nhiều chất có hoạt tính sinh học cao như: nhóm vitamin E, vitamin B, gamma oryzanol, các chất xơ được xem như prebiotic…đây cũng là những chất dễ bị biến đổi hoặc mất đi khi gặp điều kiện bất lợi như nhiệt độ cao Do đó, cần có một định hướng nghiên cứu và phát triển nguồn cám gạo một cách hiệu quả Vì vậy, việc lựa chọn một phương pháp xử lý cám gạo thích hợp trước khi sử dụng là cần thiết giúp cho việc sử dụng cám gạo như một chất bổ sung vào sản phẩm thực phẩm cho người là rất quan trọng, có ý nghĩa về kinh tế và xã hội Trong phạm vi nghiên cứu, luận án đã sử dụng chế phẩm protease trong xử lý tác nhân gây hư hỏng cám gạo Đồng thời, việc sử dụng phương pháp xử lý này còn làm gia tăng giá trị dinh dưỡng, kéo dài được thời gian bảo quản sẽ góp phần nâng giá trị kinh tế cho ngành nông nghiệp, đồng thời, góp phần khai thác, sử dụng hiệu quả nguồn nguyên liệu phụ phẩm dồi dào cám gạo mở ra hướng đi mới cho ngành thực phẩm, dược phẩm và mỹ phẩm trong tương lai.

Phương tiện nghiên cứu

Địa điểm và thời gian nghiên cứu

Quá trình thực nghiệm, thu thập và xử lý số liệu được tiến hành tại bộ môn Công nghệ thực phẩm, Khoa Nông nghiệp, Trường Đại học Cần Thơ; Trung tâm Quản lý Thực hành Thí nghiệm, Trường Đại học Kiên Giang.

Thời gian thực hiện đề tài từ tháng 11/2016 đến tháng 06/2021.

Dụng cụ, thiết bị

- Máy sắc ký khí GCMS (7890B GC System, Mỹ)

- Máy quang phổ tử ngoại khả kiến UV 1800 (Đức)

- Máy quang phổ so màu (ZE-6000/Nippondenshoku, Nhật)

- Máy điều chỉnh hiệu điện thế Metrohm (Herisau, Thụy Sĩ)

- Bể rửa siêu âm gia nhiệt (S100H/Elma, Đức)

- Máy ly tâm (EBA 21/Hettich, Đức)

- Máy phân tích đạm tự động (Kjeltec 8200 Auto Distillation

Unit/FOSS Analytical, Thụy Điển)

- Cân phân tích (CPA 224S/Sartorius, Nhật)

- Máy khuấy từ (C-MAG® MS7/Ika, Đức)

- Bể điều nhiệt (WNB10/Memmert, Đức)

- Cân sấy ẩm (MOC-63u/Shimadzu, Nhật)

- Bể cách thủy (WNB 14/Memmert, Đức)

- Máy đo pH để bàn (Pro BP 3001, Nhật)

- Thiết bị sấy thăng hoa (MODULYOD-230, Mỹ)

- Thiết bị sắc ký lỏng ghép khối phổ (UPLC-ESI-MS/MS) với hệ thống ion hóa(ESI) (Waters Corporation, Milford, MA, Mỹ) được ghép nối với hệ thống phân tích khối phổ song song MS/MS (Xevo TQS Micro, (Waters Corporation, Milford, MA, Mỹ).

Hóa chất

Các hóa chất dùng trong nghiên cứu là loại tinh khiết được sản xuất tại các hãng Merck và Sigma. a) Protamex

Protamex được sản xuất bởi công ty Novozymes (Bagsvaerd, Đan Mạch), do Công ty TNHH Công nghệ Trung Sơn, thành phố Hồ Chí Minh, cung cấp Protamex thuộc nhóm endopeptidase, có nguồn gốc từ Bacillus, được tổ chức FAO/WHO cho phép sử dụng Protamex có hoạt độ ghi trên nhãn là 1,5 AU/g, hoạt động thích hợp trong khoảng pH 5,5÷7,5 và nhiệt độ bằng 45÷65 o C Protamex có thể bị mất hoạt tính trong 30 phút tại 55 o C khi pH 4 và trong 10 phút tại 85 o C khi pH bằng 8 Nhiệt độ bảo quản tốt nhất của Protamex là 0÷5 o C. b) Flavourzyme

Flavourzyme 500 MG được sản xuất bởi công ty Novozymes (Bagsvaerd, Đan Mạch), do Công ty TNHH Công nghệ Trung Sơn, thành phố Hồ Chí Minh, cung cấp, được sản xuất từ Aspergillus oryzae bằng quá trình lên men chìm Flavourzyme thuộc nhóm exopeptidase Flavourzyme hoạt động tốt nhất ở môi trường trung tính hay acid nhẹ khi thủy phân protein Flavourzyme có hoạt tính ghi nhãn là 500 LAPU (Leucine Aminopeptidase Units)/g, pH thích hợp trong khoảng 5÷7 và nhiệt độ thích hợp trong khoảng 50÷55 o C Bảo quản Flavourzyme ở nhiệt độ 0÷4 o C. c) Cellulase

Chế phẩm Cellulase được sản xuất bởi công ty Novozymes (Bagsvaerd, Đan Mạch), do Công ty TNHH Công nghệ Trung Sơn, thành phố Hồ Chí Minh, cung cấp. Chế phẩm cellulase có màu nâu, được ghi nhận với hoạt độ 700 EGU/g và nhiệt độ bảo quản tốt nhất là 0÷4 o C. d) Men giống thương mại (Probiotics Yogurt Starter) (Pháp)

Sản phẩm của Yógourment – Pháp Thành phần gồm các chủng lợi khuẩn hoạt động lên men: L casei, B longum, L bulgaricus, S thermophilus, L acidophilus. e) Bộ kit FOS chuẩn

Bộ kit fructooligosaccharide chuẩn bao gồm 1-kestose (GF 2 ), nystose (GF 3 ) và 1F-fructosylnystose (GF 4 ) được cung cấp bởi Fujifilm Wako Pure Chemical Corporation (Osaka, Nhật Bản):

1 1-kestose, 99.0 + % (HPLC) 250 mg/vial (CAS No.470-69-9, C 18 H 32 O 16 :504,44)

2 Nystose, 99.0 + % (HPLC) 250 mg/vial (CAS No.13133-07-8,

3 1F-fructofranosylnystose, 80.0 + % (HPLC) 250 mg/vial (CAS No 59432-60-

Bộ kit chuẩn 1-kestose (GF2), nystose (GF3) và 1-fructosyl-nystose (GF4)

Nguyên liệu cám gạo

Nguyên liệu cám gạo được sử dụng trong toàn bộ nghiên cứu là cám xay xát từ giống lúa ST24, trồng trong ruộng lúa-tôm, được cung cấp bởi Hợp tác xã Dịch vụ sản xuất nông nghiệp, ấp Căn Cứ, xã Vĩnh Phong, huyện Vĩnh Thuận, tỉnh Kiên Giang. Riêng cám gạo dùng trong nghiên cứu động học phân hủy nhiệt của hợp chất fructooligosaccharide là cám gạo đã loại chất béo được cung cấp bởi Công ty TNHH Wilmar Agro Việt Nam (Cái Răng, Cần Thơ).

Phương pháp nghiên cứu

Các phương pháp phân tích cơ bản

Các chỉ tiêu cơ bản được phân tích theo các phương pháp tiêu chuẩn được tổng hợp ở Bảng 3.1 và phụ lục A.

Bảng 3.1 Một số phương pháp phân tích các tính chất hóa lý cơ bản

Chỉ tiêu Phương pháp phân tích Độ ẩm Sấy mẫu đến khối lượng không đổi ở nhiệt độ 105 o C theo

TCVN 3700-90 Độ nhớt Sử dụng thiết bị đo độ nhớt Brookfield DV1MLTJ0 Hàm lượng protein Phương pháp Lowry (1951)

Hoạt tính lipase, thông qua việc Phương pháp đo quang phổ của Whyte (1964) ở bước định lượng glycerol tạo thành sóng 635 nm

Hoạt tính lipase, thông qua việc Chuẩn độ liên tục bằng NaOH 0,05 N theo phương pháp định lượng acid béo tạo thành chuẩn độ Cherry Crandall

GF 2 , GF 3 , GF 4 Sắc ký lỏng ghép khối phổ (UPLC-ESI-MS/MS) (Prošek et al., 2003)

Phương pháp xác định hoạt tính enzyme lipase: hoạt tính enzyme lipase được xác định thông qua việc định lượng sản phẩm tạo thành là lượng acid béo hoặc glycerol hình thành theo phản ứng:

Nếu dựa vào lượng acid béo thì ta chuẩn độ liên tục mẫu bằng dung dịch NaOH 0,05 N theo phương pháp chuẩn độ Cherry Crandall Một đơn vị hoạt độ lipase (U) được biểu thị là lượng enzyme cần thiết để tạo ra 1 àmol acid bộo trong 1 phỳt ở 37 o C, pH 8,0 Cơ chất phản ứng là dầu ôliu, nồng độ 20%, có sử dụng chất nhũ hóa là gum Arabic Nếu dựa vào lượng glycerol sinh ra thì sử dụng phương pháp đo quang phổ của Whyte (1964) ở bước sóng 635 nm.

Cách chuẩn bị nhũ tương: cho khoảng 50 ml nước nóng (khoảng 70÷80 o C) vào 10g gum arabic, khuấy đều đến khi gum tan hoàn toàn Định lượng dung dịch đến 200 mL. Hút chính xác 20 mL dầu olive cho vào 180 mL dung dịch gum vừa pha Cho hỗn hợp trên vào máy xay, cho máy vận hành trong 3 phút, tắt máy và giữ lạnh trong 3 phút ở4 o C (tiến hành 4 lần), sẽ nhận được thể nhũ tương Thể nhũ tương sử dụng được khi không bị phân thành 2 pha khi giữ lạnh trong 1 giờ và được bảo quản ở 4 o C (Bùi HồngQuân và Nguyễn Đức Lượng, 2009).

Phương pháp xử lý số liệu

Các thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên với 3 lần lặp lại Kết quả của các thí nghiệm được phân tích và thống kê sử dụng chương trình SAS 9.1.3, Statgraphics Centurion 15.1, phần mềm Excel, XLSTAT.

Phương pháp phân tích thành phần chính (PCA): PCA là một trong một số công cụ thống kê có sẵn để giảm tính nhiều chiều của bộ dữ liệu (Breu, Guggenbichler, & Wollmann, 2008) Theo Jollife và Cadima (Jollife & Cadima, 2016), phân tích thành phần chính (PCA) là một kỹ thuật để giảm tính chiều của các bộ dữ liệu đó, tăng tính dễ hiểu. Việc đó được thực hiện bằng cách tạo ra các biến không tương quan mới liên tiếp tối đa hóa phương sai PCA là một kỹ thuật thống kê hữu ích đã được tìm thấy và ứng dụng trong nhiều lĩnh vực, là một kỹ thuật phổ biến để tìm các mẫu trong dữ liệu có kích thước lớn PCA bao gồm độ lệch chuẩn, hiệp phương sai và giá trị riêng (PCA, 2002) Khái niệm PCA được Karl Pearson đưa ra năm 1901 và được sử dụng trong phân tích dữ liệu đa biến như một công cụ khai thác dữ liệu và dự đoán mô hình Một bộ dữ liệu đa biến được biểu diễn dưới dạng một ma trận bao gồm N dòng đại diện cho N đối tượng khảo sát (mẫu) như hợp chất hóa học, các loại phản ứng, thời điểm, và K cột là các biến đại diện cho đặc tính của mẫu, có thể là tín hiệu phổ IR, UV, NMR hay sắc ký đồ, nhiệt độ, áp suất, đo được trong quá trình khảo sát Dữ liệu đa chiều của một ma trận gồm N dòng và

K cột có thể được thể hiện dưới dạng N điểm trong không gian K chiều Chúng ta có thể quan sát sự phân bố của các điểm ấy khi K khá nhỏ (K< 3).

Nội dung nghiên cứu

Nội dung 1: Nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố đến khả năng vô hoạt enzyme lipase

Nguyên liệu cám: được mua tại nhà máy, loại cám gạo mịn vừa xay xát xong. Cám gạo được rây để loại những tạp chất, hạt gạo to…lẫn vào Đồng thời, cám gạo được chia ra thành từng túi nhỏ 100 g và cho vào tủ đông bảo quản ở -20 o C Nguyên liệu được gửi đi xác định thành phần hóa học ban đầu ngay sau khi thu nhận.

Enzyme lipase trong cám gạo được vô hoạt bằng enzyme Protamex và Flavourzyme Các mẫu 5 g cám gạo được pha với nước theo các tỷ lệ khảo sát và được xử lý nhiệt để vô hoạt enzyme lipase ở các điều kiện nhiệt độ, thời gian và tỷ lệ enzyme Protamex và Flavourzyme khác nhau Kết thúc quá trình vô hoạt lipase, Protamex và Flavourzyme được bất hoạt bằng cách đun các mẫu ở nhiệt độ 90 o C trong

10 phút Các mẫu cám gạo sau xử lý nhiệt được phân tích để xác định chất lượng hóa lý và dinh dưỡng (Hình 3.5).

Sơ đồ bố trí thí nghiệm vô hoạt enzyme lipase trong cám gạo bằng chế phẩm

Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng của các điều kiện trích ly đến quá trình thu nhận enzyme lipase trong cám gạo

Mục đích: xác định được các thông số tối ưu về loại dung môi, nồng độ dung môi, nhiệt độ và thời gian trích ly cho quá trình thu nhận enzyme lipase trong cám gạo.

Bố trí thí nghiệm: thí nghiệm được bố trí theo sơ đồ Hình 3.6.

Sơ đồ thí nghiệm xác định điều kiện tối ưu trích ly enzyme lipase trong cám gạo

Cách tiến hành thí nghiệm: tiến hành chuẩn bị số mẫu cám theo sơ đồ, khối lượng mỗi mẫu là 10 gam Kết quả thí nghiệm trước được sử dụng cho thí nghiệm sau Lấy 10 gam cám gạo bổ sung dung môi trích ly với tỷ lệ 1:7, nồng độ dung môi khảo sát từ 0 đến

2 M, bọc kín miệng cốc rồi đặt vào bể ổn nhiệt đến khi nhiệt độ đạt mức khảo sát từ

29 đến 41 o C bắt đầu ghi nhận kết quả Cuối cùng thực hiện so sánh kết quả trong khoảng thời gian trích ly từ 120 đến 360 phút Trong quá trình trích ly thường xuyên khuấy đảo để tăng cường hiệu suất trích ly Tiến hành kiểm tra hoạt tính enzyme lipase trong các mẫu thu được, đánh giá, lựa chọn điều kiện trích ly thích hợp.

Chỉ tiêu theo dõi: hoạt tính enzyme lipase thu được.

Thí nghiệm 2: Nghiên cứu tối ưu hóa các điều kiện trích ly lipase trong cám gạo

Mục đích: xác định được các điều kiện trích ly lipase trong cám gạo bao gồm nồng độ dung dịch trích ly, tỉ lệ dung dịch trích/nguyên liệu, thời gian trích ly.

Bố trí thí nghiệm: thí nghiệm được bố trí với ba nhân tố nồng độ dung dịch muối

NaCl, tỉ lệ dung dịch NaCl/nguyên liệu cám gạo và thời gian trích ly Sử dụng phương pháp bề mặt đáp ứng (RSM) để xác định điều kiện tối ưu cho quá trình trích ly lipase.Thiết kế thí nghiệm, phân tích thống kê và tìm mô hình hồi quy bằng phần mềm SAS9.1.3 Mô hình sử dụng trong nghiên cứu với kiểu thiết kế Box-Behnken Các nhân tố khảo sát có khoảng biến thiên như sau: nồng độ dung dịch NaCl: 0 ≤ X 1 ≤ 2 M; tỷ lệ dung dịch NaCl/cám gạo: 5/1 v/w ≤ X 2 ≤ 9:1 v/w; thời gian trích ly: 4 giờ ≤ X 3 ≤ 12 giờ. mục tiêu Y là hoạt tính lipase thu nhận được (UI/kg).

3.2 Ba nhân tố dùng trong phương pháp bề mặt đáp ứng với thiết kế Box-Behnken

Biến Nhân tố Hệ số mã hóa và tự nhiên tương ứng

X 1 Nồng độ dung dịch NaCl (M) 0 1 2

X 2 Tỉ lệ dung dịch NaCl: cám gạo 5:1 7:1 9:1

X 3 Thời gian trích ly (giờ) 4 8 12

Mỗi biến độc lập có 3 mức độ -1, 0, +1, tổng số nghiệm thức là 15 bao gồm

3 lần lặp lại tại điểm trung tâm được mã hóa là (0,0,0) (Myer et al., 2009) và được thể hiện ở Bảng 3.2.

Ylà hoạt tính enzyme lipase xác định dựa vào các nhân tố được mã hóa (Xi, i = 1,

2, 3), là một phương trình đa thức bậc hai:

Bảng 3.3 Ma trận thực nghiệm thí nghiệm tối ưu hóa nồng độ dung dịch NaCl, tỉ lệ dung dịch trích ly/nguyên liệu và thời gian trích ly đến hoạt tính lipase

Tiến hành thí nghiệm: cám được lấy từ tủ đông -20 o C ra ngoài nhiệt độ phòng. Sau đó, bổ sung dung môi lần lượt là dung dịch muối có ở nồng độ 0, 1 và 2 M với các tỉ lệ và thời gian tương ứng được bố trí ở (mỗi mẫu trích ly là 5 g cám) Cho các mẫu thí nghiệm vào kho lạnh nhiệt độ 15±2 o C, sử dụng máy khuấy từ trong suốt quá trình Bảng

Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ xử lý đến khả năng vô hoạt enzyme lipase trong cám gạo bằng các chế phẩm Protamex và Flavourzyme

Mục đích: xác định được nhiệt độ xúc tác tối ưu của enzyme protease trong hai chế phẩm Protamex và Flavourzyme để vô hoạt enzyme lipase trong cám gạo.

Bố trí thí nghiệm: thí nghiệm được bố trí ngẫu nhiên với 2 nhân tố

Nhân tố A: loại chế phẩm protease

Nhân tố B: nhiệt độ vô hoạt lipase ( o C), 6 mức:

Mỗi nghiệm thức được lặp lại 3 lần Tổng số đơn vị thí nghiệm: 2 × 6 × 3 = 36.

Bảng 3.4 Bố trí thí nghiệm xác định nhiệt độ thích hợp vô hoạt lipase trong cám gạo

Tiến hành thí nghiệm: lấy 5 g cám gạo cho vào cốc và cho dung dịch nước muối

NaCl 1 M theo tỷ lệ 1:7 vào cốc, khuấy đều, cho lượng enzyme tương ứng vào cốc và thủy phân ở nhiệt độ khảo sát trong 6 giờ Bổ sung nhũ tương vào cốc mẫu sau thủy phân Ủ mẫu trong 30 phút để lipase còn lại tác dụng với nhũ tương sinh acid béo và glycerol Đun hỗn hợp mẫu trong bể điều nhiệt ở nhiệt độ 95 o C trong thời gian 10 phút để kết thúc phản ứng Hoạt tính lipase còn lại của các mẫu sau quá trình xử lý nhiệt được xác định bằng phương pháp chuẩn độ điện thế với dung dịch NaOH 0,05 N Hàm lượng protein tổng số của các mẫu được xác định bằng phương pháp Lowry.

Chỉ tiêu theo dõi: hoạt tính lipase còn lại trong mẫu và hàm lượng protein thu được.

Thí nghiệm 4: Khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ enzyme Protamex và thời gian xử lý đến khả năng vô hoạt enzyme lipase trong cám gạo

Mục đích: xác định được tỉ lệ enzyme Protamex và thời gian thích hợp để vô hoạt enzyme lipase trong cám gạo.

Bố trí thí nghiệm: thí nghiệm được bố trí ngẫu nhiên với 2 nhân tố

Nhân tố C: tỉ lệ enzyme Protamex (%), có 5 mức:

Nhân tố D: thời gian vô hoạt (giờ), có 6 mức:

Mỗi nghiệm thức được lặp lại 3 lần Tổng số đơn vị thí nghiệm: 5 × 6 × 3 = 90.

Bảng 3.5 Bố trí thí nghiệm xác định tỉ lệ enzyme sử dụng và thời gian vô hoạt đối với lipase trong cám gạo

Tiến hành thí nghiệm: lấy 5 g cám gạo cho vào cốc và cho dung dịch NaCl 1 M vào cốc theo tỷ lệ 1:7, khuấy đều, cho lượng enzyme tương ứng vào cốc và thủy phân ở nhiệt độ khảo sát trong khoảng thời gian từ 1 đến 6 giờ Bổ sung nhũ tương vào cốc mẫu sau thủy phân Ủ mẫu trong 30 phút để lipase còn lại tác dụng với nhũ tương sinh acid béo và glycerol Đun hỗn hợp mẫu trong bể điều nhiệt ở nhiệt độ 95 o C trong thời gian

10 phút để kết thúc phản ứng Hoạt tính lipase còn lại của các mẫu sau quá trình xử lý nhiệt được xác định bằng phương pháp chuẩn độ điện thế với dung dịch NaOH 0,05 N. Hàm lượng protein tổng số của các mẫu được xác định bằng phương pháp Lowry.

Chỉ tiêu theo dõi: hoạt tính lipase còn lại trong mẫu và hàm lượng protein thu được.

Thí nghiệm 5: Khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ enzyme Flavourzyme và thời gian xử lý đến khả năng vô hoạt enzyme lipase trong cám gạo

Mục đích: xác định được tỉ lệ enzyme Flavourzyme và thời gian thích hợp để vô hoạt enzyme lipase trong cám gạo.

Bố trí thí nghiệm: thí nghiệm được bố trí ngẫu nhiên với 2 nhân tố, 3 lần lặp lại.

Nhân tố E: thời gian vô hoạt (giờ), có 6 mức:

Nhân tố F: tỉ lệ enzyme Flavourzyme (%), có 5 mức:

Mỗi nghiệm thức được lặp lại 3 lần Tổng số đơn vị thí nghiệm: 5 × 6 × 3 = 90.

Bảng 3.6 Bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ enzyme Flavourzyme và thời gian đến khả năng vô hoạt enzyme lipase

Tiến hành thí nghiệm: bổ sung nhũ tương vào bình mẫu đã được vô hoạt Ủ mẫu trong 30 phút để lipase còn lại tác dụng với nhũ tương sinh acid béo và glycerol Đun hỗn hợp mẫu trong bể điều nhiệt với nhiệt độ 85 o C trong thời gian 10 phút để kết thúc phản ứng Sau khi vô hoạt pha loãng hỗn hợp 5 lần bằng dung dịch ethanol 95%. Chuyển mẫu sang ống ly tâm và ly tâm 6000 vòng/phút trong thời gian 5 phút Sau khi ly tâm thu được dịch trong, tiến hành cho 5 mL dịch trong vào bình định mức 100 mL, cho lần lượt vào bình định mức 10 mL NaOH 21%, 60 mL ethanol 95% Thêm từ từ 6 mL thuốc thử CuCl 2 và lắc mạnh Tiếp tục định mức đến vạch bằng ethanol 95% Hỗn hợp được ly tâm 6000 vòng/phút trong thời gian 5 phút Thu được phần chất lỏng màu xanh và tiến hành đo quang phổ với bước sóng 635nm Xác định hàm lượng protein tổng số bằng phương pháp Lowry.

Chỉ tiêu theo dõi: hoạt tính lipase còn lại trong mẫu và hàm lượng protein thu được.

Thí nghiệm 6: Khảo sát khả năng vô hoạt enzyme lipase bằng sự kết hợp chế phẩm Protamex và Flavourzyme

Mục đích: xác định được thời gian thích hợp vô hoạt enzyme lipase trong cám gạo bằng sự kết hợp 2 chế phẩm protease.

Bố trí thí nghiệm: thí nghiệm được bố trí ngẫu nhiên với 1 nhân tố, 3 lần lặp lại

Cố định tỷ lệ enzyme Protamex và tỷ lệ enzyme Flavourzyme đã tìm được ở thí nghiệm trước.

Nhân tố G: thời gian xử lý (giờ), có 5 mức:

Tổng số mẫu thí nghiệm: 5 × 3 mẫu.

Tiến hành thí nghiệm: lấy 5 g cám gạo cho vào cốc và cho dung dịch nước muối

1M theo tỷ lệ 1:7 vào cốc, khuấy đều, cho enzyme Protamex và Flavourzyme ở mức tối ưu từ các thí nghiệm trước vào cốc, xử lý mẫu ở nhiệt độ tối ưu của hai enzyme trong khoảng thời gian từ 1 đến 5 giờ Bổ sung nhũ tương vào cốc mẫu sau thủy phân. Ủ mẫu trong 30 phút để lipase còn lại tác dụng với nhũ tương sinh acid béo và glycerol Đun hỗn hợp mẫu trong bể điều nhiệt ở nhiệt độ 95 o C trong thời gian 10 phút để kết thúc phản ứng Hoạt tính lipase còn lại của các mẫu sau quá trình xử lý nhiệt được xác định bằng phương pháp chuẩn độ điện thế với dung dịch NaOH 0,05 N.

Chỉ tiêu theo dõi: hoạt tính lipase còn lại trong mẫu.

Nội dung 2: Nghiên cứu ảnh hưởng của các chế độ tiệt trùng và thời gian bảo quản lên thành phần hợp chất bay hơi của nước cám gạo

Quy trình nghiên cứu trên dịch cám gạo thủy phân được tiến hành theo Hình 3.7.

Sơ đồ nghiên cứu động học hợp chất bay hơi trong quá trình bảo quản

Thí nghiệm 7: Khảo sát chương trình chạy nhiệt thích hợp trong phân tích hợp chất bay hơi của dịch cám gạo

Mục đích: khảo sát các chương trình nhiệt độ cột được sử dụng nhằm chọn ra chương trình thích hợp.

Bố trí thí nghiệm: thí nghiệm được bố trí ngẫu nhiên với 1 nhân tố, 3 lần lặp lại.

Nhân tố: chương trình chạy nhiệt, 4 chương trình:

Chương trình a: chương trình chạy nhiệt thứ nhất: nhiệt độ bắt đầu 40°C được lên với tốc độ 10°C/phút đến 220°C và giữ trong 3 phút, tiếp tục tăng với tốc độ 15°C/phút đến 300°C và giữ trong 10 phút.

Chương trình b: chương trình chạy nhiệt thứ hai: nhiệt độ bắt đầu 40°C được lên với tốc độ 10°C/phút đến 160°C và giữ trong 3 phút, tiếp tục tăng với tốc độ 15°C/phút đến 300°C và giữ trong 10 phút.

Chương trình c: chương trình chạy nhiệt thứ ba: nhiệt độ bắt đầu 40°C được giữ trong 1 phút, sau đó tăng nhiệt độ lên với tốc độ 10°C/phút đến 160°C và giữ trong 3 phút, tiếp tục tăng nhiệt độ với tốc độ 20°C/phút đến 300°C và giữ trong 10 phút.

Chương trình d: chương trình chạy nhiệt thứ tư: nhiệt độ bắt đầu 40°C được giữ trong 5 phút, sau đó tăng nhiệt độ lên với tốc độ 10°C/phút đến 160°C và giữ trong 3 phút, tiếp tục tăng nhiệt độ với tốc độ 20°C/phút đến 300°C và giữ trong 10 phút. Tổng số đơn vị thí nghiệm: 4 × 3

Tiến hành thí nghiệm: thực hiện thí nghiệm trên thiết bị như đã bố trí.

Chỉ tiêu theo dõi: số lượng hợp chất bay hơi thu được.

Thí nghiệm 8: Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ, thời gian ủ và tỉ lệ dung dịch NaCl bổ sung trong lấy mẫu headspace tĩnh

Mục đích: xác định được chế độ lấy mẫu thích hợp khi phân tích headspace tĩnh bao gồm nhiệt độ, thời gian ủ mẫu (cân bằng), tỉ lệ dung dịch NaCl bão hòa (so với dung dịch mẫu, V/V) bổ sung.

Chỉ tiêu đánh giá: số lượng đỉnh xuất hiện trong sắc ký đồ.

Bố trí thí nghiệm: sử dụng phương pháp bề mặt đáp ứng (RSM) để xác định điều kiện tối ưu cho quá trình lấy mẫu phân tích headspace tĩnh Thiết kế thí nghiệm, phân tích thống kê và tìm mô hình hồi qui bằng phần mềm Statgraphic Centurion 15 Mô hình sử dụng trong nghiên cứu với kiểu thiết kế Box-Behnken để đánh giá ảnh hưởng tương tác giữa 3 biến độc lập là nhiệt độ cân bằng lấy mẫu (X 1 ) lần lượt là 40, 50,

60 o C, thời gian ủ là (X 2 ) lần lượt là 20, 30, 40 phút, và tỉ lệ dung dịch NaCl bão hòa (so với dung dịch mẫu, V/V) (X 3 ) lần lượt là 10, 20, 30% (Bảng 3.7).

Mỗi biến độc lập có 3 mức độ: -1, 0, +1, tổng số thí nghiệm là 17, bao gồm 5 lần lặp lại ở điểm trung tâm được mã hóa là (0,0,0) (Myer et al., 2009) và được thể hiện ở Bảng 3.7 và Bảng 3.8.

Bảng 3.7 Các nhân tố ảnh hưởng trong lấy mẫu headspace tĩnh

Biến Nhân tố Hệ số mã hóa tự nhiên tương ứng

Thời gian cân bằng lấy mẫu (phút)

Tỉ lệ dung dịch NaCl bão hòa (so với dung dịch mẫu, V/V) (%)

Bảng 3.8 Thiết kế thí nghiệm tối ưu hóa tỉ lệ dung dịch NaCl bão hòa (so với dung dịch mẫu, V/V), nhiệt độ và thời gian cân bằng trong lấy mẫu headspace tĩnh

Thí nghiệm Tỉ lệ dung dịch NaCl bão hòa Nhiệt độ ủ mẫu Thời gian ủ mẫu

(so với dung dịch mẫu, V/V) (%) ( o C) (phút)

Bước 1: chuẩn bị mẫu Dịch cám thanh trùng được bổ sung dung dịch muối NaCl bão hòa với nồng độ 20% thể tích dịch cám, đậy kín và lắc nhẹ để hỗn hợp muối nước cám hoà tan đều Sau đó cho vào bể điều nhiệt, nhiệt độ 50 o C và thời gian cân bằng lấy mẫu 30 phút.

Mẫu được chuẩn bị trong lọ

Bước 2: chuẩn bị dung mụi Dựng ống tiờm (Hamilton, Thụy Sỹ) hỳt 200 àL dung mụi diclomethan (Merck, Đức) cho vào ống insert 250 àL được đặt trong lọ vial 2,5 mL (LaPhaPack, Đức), sau đó đậy nắp kín bằng nắp có đệm silicon septa (LaPhaPack, Đức) và cho vào tủ lạnh ở nhiệt độ 4 o C.

Bước 3: bơm hợp chất bay hơi vào dung môi Sau khi cân bằng thời gian và nhiệt độ lấy mẫu, dựng ống tiờm hỳt 4 mL hỗn hợp khớ tiờm vào ống insert chứa 200 àL dung môi đã chuẩn bị sẵn Sau đó, các dung dịch này được chuyển đến tủ mát 4 o C trong 3 giờ trước khi chuyển đến khay chứa mẫu của máy sắc ký để ổn định mẫu.

Bơm mẫu vào dung môi

Bước 4: phân tích sắc ký khí (GC-MS) Lọ mẫu được đặt vào khây lấy mẫu tự động của thiết bị sắc ký khí để tiến hành phân tích Quá trình phân tích sắc ký khí được tiến hành trong thiết bị sắc ký khí ghép đầu dò khối phổ (6890N GC system, Shimadzu corp, Kyoto, Nhật Bản) Bơm mẫu được thực hiện ở chế độ không chia dòng (splitless mode) với thể tớch bơm là 1 àL Phõn tớch sắc ký được thực hiện trong cột mao quản dài

30 m, đường kớnh trong 0,25 mm và phủ mặt trong dày 0,25 àm, khụng phõn cực (Rxiđ- 5Sil MS columns, Restek corp., Pennsylvania, US) có pha tĩnh là 1,4- bis(dimethylpolysiloxy)phenylene dimethylpolysiloxane và nhiệt độ giới hạn từ -60 đến 325/350 o C Khí Heli với tốc độ chảy 1,5 mL/phút được sử dụng như khí mang Chương trình chạy nhiệt gồm các thông số như sau: nhiệt độ bắt đầu 40°C được giữ trong 1 phút, sau đó tăng nhiệt độ lên với tốc độ 10°C/phút đến 160°C và giữ trong 3 phút, tiếp tục tăng nhiệt độ với tốc độ 20°C/phút đến 300°C và giữ trong 10 phút Tổng thời gian là

Mẫu được phân tích bằng thiết bị sắc ký khối phổ

Thí nghiệm 9: Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian bảo quản lên thành phần hợp chất bay hơi của nước cám gạo tiệt trùng

Mục đích: đánh giá sự biến đổi thành phần hợp chất bay hơi của nước cám gạo tiệt trùng sau thời gian bảo quản.

Bố trí thí nghiệm: mẫu 1 là mẫu nước cám gạo không tiệt trùng Mẫu 2, 3, 4, 5 là nước cám gạo tiệt trùng lần lượt được bảo quản ở nhiệt độ phòng trong thời gian 0, 1,

Cách tiến hành: mẫu nước cám gạo ban đầu chưa tiệt trùng được mang đi phân tích

GC/MS trước tiên để thấy sự khác biệt của hợp chất bay hơi thu được giữa mẫu không tiệt trùng và mẫu có tiệt trùng Nước cám gạo được tiệt trùng ở chế độ nhiệt 121,1 o C với z bằng 10 o C và F bằng 6 phút, sau đó được bảo quản ở nhiệt độ phòng trong vòng 3 tháng. Thành phần hợp chất bay hơi nước cám được phân tích GC-MS vào ngày đầu tiên của mỗi tháng Thao tác chuẩn bị và phân tích tương tự như thí nghiệm 7.

Chỉ tiêu theo dõi: sự xuất hiện của các hợp chất bay hơi từ sắc ký đồ.

Nội dung 3: Nghiên cứu động học phân hủy nhiệt của hợp chất FOS (bao gồm GF 2 , GF 3 và

Trích ly FOS từ cám gạo

Quá trình trích FOS từ cám gạo đã khử chất béo được thực hiện theo phương pháp của Patindol et al (2007) với một số điều chỉnh nhỏ Mười gam cám gạo đã khử chất béo được phối trộn trong 100 mL nước khử ion và đun nóng ở 100°C trong 30 phút bằng máy khuấy từ Hỗn hợp sau đó được để nguội đến nhiệt độ phòng, được trộn trong 2 phút bằng máy phân tán IKA T25 (IKA T25 digital Ultra-Turrax®, Merck, Darmstadt, Germany) ở tốc độ 5000 vòng/phút, được thêm 0,1 mL cellulase và ủ trong máy lắc cách thủy ở 50°C trong 1 giờ Sau đó, hỗn hợp này được trộn trong 2 phút bằng máy phân tán IKA T25 (5000 vòng/phút), được bổ sung etanol với một thể tích tương đương, khuấy đều, để yên trong 15 phút và ly tâm ở 5252g trong 12 phút (sử dụng thiết bị ly tâm Rotixa 500RS, Hettich, Tuttlingen, Đức) Phần dịch lỏng được thu hồi và làm khô bằng phương pháp sấy đông khô Bột trích ly sấy khô (sau đây gọi là

‘bột FOS trích ly’) được bảo quản ở -20°C để sử dụng cho các thí nghiệm của đề tài. Lượng FOS thô (chứa GF 2 , GF 3 và GF 4 ) thu được đạt mức ~ 700 mg/kg cám gạo.

Thí nghiệm 10: Khảo sát động học phân hủy nhiệt của GF 2 , GF 3 và

Mục đích: tìm ra quy luật biến đổi của GF 2 , GF 3 và GF 4 trong cám gạo dưới tác động của nhiệt độ và pH môi trường.

Bố trí thí nghiệm: thí nghiệm bố trí ngẫu nhiên với 3 nhân tố, 2 lần lặp lại.

Nhân tố A: nhiệt độ xử lý ( o C)

Nhân tố B: pH dung dịch GF 2 , GF 3 và GF 4

Thời gian xử lý (phút):

Tổng số đơn vị thí nghiệm: 3 × 3 × 8 × 2 = 144

Sơ đồ thí nghiệm Hình 3.12

Sơ đồ bố trí khảo sát động học phân hủy nhiệt của GF2, GF3 và GF4 trong cám gạo

Cách tiến hành thí nghiệm: tiến hành pha dung dịch đệm photphat-citrat theo tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 4320:1986 ứng với các giá trị pH 5,0, 6,0 và 7,0 theo Bảng 3.9.

Bảng 3.9 Công thức pha dung dịch đệm photphat-citrat theo TCVN 4320:1986 ứng với các giá trị pH tại 5,0, 6,0 và 7,0 pH Dung dịch Na 2 HPO 4 0,2 M (mL) Dung dịch acid citric 0,1 M (mL)

Bột FOS trích ly (100 mg) và dung dịch đệm (pH 5, 6, hoặc 7; 50 mL) được cho vào các ống ly tâm Falcon dung tích 50 mL (Fisher Scientific, Waltham, MA, Mỹ) và khuấy trộn đều Sau đó, cho lần lượt 5 mL dung dịch đã chuẩn bị vào các ống nghiệm nắp vặn Kimax®culture 16×100 mm (DWK Life Sciences, Milville, NJ, Mỹ), đậy kín nắp lại Tiếp theo, đặt các ống thủy tinh này vào thiết bị gia nhiệt (MG-2200, TokyoRikakikai (EYELA), Tokyo, Nhật Bản), được điều chỉnh theo các mức nhiệt độ khảo

trích ly từ cám gạo

Nội dung 4: Nghiên cứu sử dụng cám gạo đã vô hoạt enzyme lipase để chế biến thức uống

Sau quá trình thủy phân thu được dịch cám gạo giàu dinh dưỡng, do đó, các nghiên cứu tiếp theo là ứng dụng vào việc chế biến thức uống dinh dưỡng (Hình 3.13).

Cám gạo được thu mua tại nhà máy, loại cám ướt, ngay thời điểm đang xay xát. Cám được rây và phân nhỏ từng túi khoảng 1 kg, vận chuyển nhanh về phòng thí nghiệm, đưa vô tủ đông -20 o C bảo quản Mỗi lần thực hiện thí nghiệm lấy một đơn vị nguyên liệu sử dụng Cảm gạo được xử lý bằng chế phẩm protease theo điều kiện được xác định ởmục 3.3.1 Sau khi xử lý tiến hành lọc phân riêng bã và dịch Với phần dịch bổ sung vào hỗn hợp lên men chế biến sữa chua, phần bã dùng chế biến bột dinh dưỡng dùng cho người.

Sơ đồ chế biến thức uống dinh dưỡng bổ sung cám gạo đã vô hoạt lipase

Thí nghiệm 11: Khảo sát tỷ lệ dịch cám gạo đã vô hoạt enzyme lipase bổ sung vào dịch lên men sữa chua uống

Quy trình chế biến sữa chua được thực hiện theo Hình 3.14

Sơ đồ chế biến sữa chua uống bổ sung dịch cám gạo thủy phân Thí nghiệm được bố trí khảo sát tỷ lệ dịch cám gạo bổ sung đã xử lý enzyme lipase

Mục đích: xác định được tỷ lệ dịch cám gạo bổ sung thích hợp cho sản phẩm sữa chua khuấy.

Bố trí thí nghiệm: thí nghiệm được bố trí ngẫu nhiên với 1 nhân tố, 3 lần lặp lại.

Nhân tố M: dịch cám gạo đã xử lý enzyme lipase (%), 3 mức:

Tổng số đơn vị thí nghiệm: 3 × 3 = 9

Cách thực hiện: sữa tươi nguyên liệu (50%) phối chế với 10% sữa đặc có đường, sau đó bổ sung dịch cám gạo thủy phân thay đổi từ 15% đến 35%, còn lại là nước lọc. Sau đó, dịch hỗn hợp được thanh trùng ở nhiệt độ 85 o C trong 30 phút, làm nguội dịch sữa xuống 40-43 o C, bổ sung 0,003% men giống đã được hoạt hóa vào dịch hỗn hợp, thực hiện quá trình lên men ở nhiệt độ 43 o C Quá trình lên men dừng lại khi pH đạt 4,6 Khối sữa được đồng hóa, sau đó được làm lạnh nhanh và bảo quản ở nhiệt độ khoảng 4 o C, sau 24 giờ mẫu được mang đánh giá các chỉ tiêu theo dõi.

Chỉ tiêu theo dõi: chỉ số pH, độ nhớt, độ tách nước và điểm cảm quan.

Thí nghiệm 12: Khảo sát khả năng bảo quản bột cám gạo hỗn hợp

Cám gạo sau khi thủy phân được lọc tách thành 2 phần là dịch và bã Phần bã được tận dụng chế biến bột cám gạo hỗn hợp theo sơ đồ Hình 3.15.

Sơ đồ chế biến bột uống hỗn hợp cám gạo dinh dưỡng

Mục đích: xác định thời gian bảo quản sản phẩm bột cám gạo hỗn hợp.

Bố trí thí nghiệm: mẫu được bảo quản ở điều kiện thường, mẫu được gửi kiểm nghiệm theo tần suất 01tháng/lần đến khi chỉ tiêu theo dõi của mẫu có dấu hiệu hư hỏng.

Cách thực hiện: bã cám gạo được sấy lần 1 ở nhiệt độ từ 50 o C đến khi đạt độ ẩm 5% Lúc này, bã kết lại thành khối nên cần nghiền sơ bộ nhằm tạo độ phân tán tốt ở công đoạn phối trộn Nguyên liệu phụ sử dụng để phối trộn là bột kem sữa, bột cacao, trà xanh tạo hương vị cho sản phẩm, đồng thời cũng để hạn chế mùi cám gạo chưa được quen thuộc đối với người sử dụng Các tỷ lệ phối trộn được cố định (Bảng 3.11). Tiếp theo, bán thành phẩm được sấy lần 2 đạt độ ẩm yêu cầu là