Sử dụng chế phẩm protease trong xử lý cám gạo dùng cho chế biến thức uống dinh dưỡng

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ LÊ HOÀNG PHƯỢNG SỬ DỤNG CHẾ PHẨM PROTEASE TRONG XỬ LÝ CÁM GẠO DÙNG CHO CHẾ BIẾN THỨC UỐNG DINH DƯỠNG LUẬN ÁN TIẾN SĨ CHUYÊN NGÀNH CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM MÃ SỐ: 62.54.01.01 NĂM 2023 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ LÊ HOÀNG PHƯỢNG MÃ SỐ NCS: P1115003 SỬ DỤNG CHẾ PHẨM PROTEASE TRONG XỬ LÝ CÁM GẠO DÙNG CHO CHẾ BIẾN THỨC UỐNG DINH DƯỠNG LUẬN ÁN TIẾN SĨ CHUYÊN NGÀNH CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM MÃ SỐ: 62.54.01.01 NGƯỜI HƯỚNG DẪN PGS.TS LÝ NGUYỄN BÌNH NĂM 2023 LỜI CẢM ƠN Mỗi thành lao động không đơn giản nỗ lực thân mà cịn đóng góp nhiều người Tôi may mắn nhận giúp đỡ, đồng hành nhiều cá nhân tổ chức Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn chân thành sâu sắc Đầu tiên, xin gửi lời cảm ơn đến PGS,TS Lý Nguyễn Bình người thầy hướng dẫn, hỗ trợ tơi xun suốt q trình học tập nghiên cứu sau đại học Thầy truyền thụ kiến thức chun mơn, thầy cịn người thầy vơ đáng kính hoạt động khoa học sống Được học tập thầy may mắn vinh dự cho Xin cảm ơn thầy bao dung giúp đỡ suốt thời gian qua Bên cạnh đó, tơi cịn nhận quan tâm nhiều thầy, cô Bộ môn Công nghệ Thực phẩm, Khoa Nông nghiệp, Khoa Sau đại học Trường Đại học Cần Thơ Quý thầy cô, anh chị em giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi cho em học tập nghiên cứu Trong đó, tơi xin dành lời cảm ơn đến PGS,TS Trần Thanh Trúc Nhờ có động viên, hỗ trợ lúc khó khăn, tơi vượt qua trở ngại có ngày hơm Xin chân thành cảm ơn Ngồi ra, tơi cộng tác bạn sinh viên ngành Công nghệ Thực phẩm, học viên cao học Hồng Diệp Thanh Nghị góp phần làm cho kết luận án thêm phong phú chuyên sâu Xin cảm ơn bạn nhiều Và, đồng hành suốt thời gian qua, anh chị em đồng nghiệp, quý lãnh đạo Trường Đại học Kiên Giang chia sẻ, gánh vác công việc tạo điều kiện thuận lợi cho tơi hồn thành chương trình học Tơi xin cảm ơn tri ân tất giúp đỡ quý bàu Cuối cùng, muốn gửi lời cảm ơn đến đại gia đình Nơi cho tơi động lực, cho tơi niềm tin để tiếp tục phấn đấu đạt mục tiêu Đặc biệt cảm ơn anh Trần Hữu Phúc đồng hành, ủng hộ tinh thần tài cho tơi Cảm ơn hai Trần Duy Quỳnh Trần Vũ Phong ln ngoan ngỗn để mẹ yên tâm học tập Một lần nữa, xin cảm ơn tất giúp đỡ cá nhân, đơn vị dành cho thời gian qua Xin kính chúc q thầy cơ, anh chị em nhiều sức khỏe, bình an hạnh phúc Cần Thơ, ngày tháng năm 2023 Tác giả thực Lê Hoàng Phượng i TÓM TẮT Cám gạo nguồn phụ phẩm dồi chứa hàm lượng dinh dưỡng cao Trong nghiên cứu hai chế phẩm protease thương mại sử dụng để vô hoạt enzyme lipase cám gạo Kết nghiên cứu cho thấy sử dụng 0,4% Flavourzyme hay 0,4% Protamex, lipase bị vô hoạt nhiệt độ 50oC thời gian hay giờ, tương ứng Lipase vô hoạt kết hợp Flavourzyme Protamex với tỷ lệ enzyme sử dụng 0,4% cho loại, xử lý nhiệt độ 50 oC đặc biệt thời gian vơ hoạt rút ngắn cịn Sau vô hoạt lipase, dịch cám gạo xử lý nhiệt (tiệt trùng), theo dõi thay đổi thành phần hợp chất bay thời gian bảo quản Bên cạnh đó, chất xơ prebiotic fructooligosaccharides (FOS) xác định có mặt cám gạo chịu ảnh hưởng điều kiện chế biến Kết xác định độ bền nhiệt FOS điều kiện pH nhiệt độ khác cho thấy phân hủy FOS (bao gồm 1-kestose (GF2), nystose (GF3) 1-fructosyl-nystose (GF4)) trích ly từ cám gạo theo thời gian xử lý nhiệt giá trị pH 5,0, 6,0 7,0 tn theo mơ hình động học bậc Các giá trị số tốc độ phân hủy nhiệt (k) GF 2, GF3 GF4 tăng nhiệt độ xử lý tăng Hằng số tốc độ phân hủy k GF2, GF3 GF4 có giá nhỏ pH mẫu cám gạo có giá trị lớn khoảng từ 5,0 đến 7,0 FOS cám gạo bền nhiệt vùng pH trung tính, nhạy cảm vùng pH acid Sự phụ thuộc nhiệt độ số tốc độ phân hủy nhiệt k GF2, GF3 GF4 khoảng nhiệt độ khảo sát mơ tả đầy đủ phương trình Arrhenius Năng lượng hoạt hóa (Ea) khoảng pH từ 5,0 đến 7,0 tương ứng với GF tăng từ 61,80 đến 77,67 kJ/mol, GF3 từ 67,46 đến 92,31 kJ/mol GF4 từ 49,24 đến 72,06 kJ/mol Cám gạo sau vô hoạt lipase Flavourzyme Protamex sử dụng chế biến sữa chua bột dinh dưỡng Chất lượng cảm quan sản phẩm đánh giá mức tốt thời gian bảo quản bột dinh dưỡng tháng Kết ban đầu nguồn dẫn liệu khoa học có giá trị định hướng phát triển khai thác nguồn phụ phẩm nông nghiệp tương lai Từ khóa: cám gạo, fructooligosaccharides, hợp chất bay hơi, lipase, protease ii ABSTRACT Rice bran is the main by-product of rice milling processing and contains high quantities of valuable nutrients and bioactive compounds significantly related to human health In the study, protease preparations were applied to inactivate lipase enzymes in rice bran The results showed that when using 0.4% Flavorzyme or 0.4% Protamex, lipase was inactivated at 50oC for and hours, respectively Lipase was also inactivated by a combination of Flavorzyme and Protamex at a level of 0.4% each for hours After lipase inactivation, the rice bran extract was thermally treated at different temperatures and the changes in volatile compounds were monitored during storage Besides, the prebiotic fiber, fructooligosaccharides (FOS), was identified in rice bran that was influenced by processing conditions The results of determining the thermal stability of FOS at different pH and temperature conditions showed that the decomposition of FOS (including 1-kestose (GF2), nystose (GF3) and 1-fructosyl-nystose (GF4)) according to heat treatment time at pH 5.0, 6.0, and 7.0 was followed a first-order kinetic model; rate constant (k) values for the thermal decomposition of GF2, GF3 and GF4 were increased with increasing treatment temperature Analytical data also showed that GF2, GF3 and GF4 were very heat stable In addition, these k values gradually decrease as the pH of the sample increases from 5.0 to 7.0 Furthermore, the dependence of temperature on the rate constant (k) values for the thermal decomposition of GF2, GF3 and GF4 in the investigated temperature range could be fully described by the Arrhenius equation The activation energy (Ea) of GF2 in the pH range from 5.0 to 7.0 were from 61.80 to 77.67 kJ/mol, the case of GF3 from 67.46 to 92.31 kJ/mol, and in the case of GF4 from 49.24 to 72.06 kJ/mol, respectively In the final study, the treated rice bran was used to make yoghurt and nutritional powder with good sensory quality (yoghurt) and the shelf life (nutritional powder) These were very positive initial results that contributed to the scientific databases on the nutritional composition and application of rice bran byproducts as well as providing data for the development orientation and exploitation of agricultural by-products in the future Keywords: fructooligosaccharides, lipase, protease, rice bran, volatile compound iii MỤC LỤC 1.1 1.2 1.2.1 1.2.2 1.3 1.4 1.5 Đặt vấn đề Mục tiêu nghiên cứu Mục tiêu chung Mục tiêu cụ thể Nội dung nghiên cứu Ý nghĩa luận án Điểm luận án 2.1 2.1.1 2.1.2 2.1.3 2.2 2.2.1 2.2.2 2.2.3 2.3 2.3.1 2.3.2 2.3.3 2.3.4 2.4 2.4.1 2.4.2 2.5 2.6 2.6.1 2.6.2 Tổng quan cám gạo hư hỏng cám gạo Giới thiệu chung Thành phần hóa học dinh dưỡng cám gạo Một số ứng dụng cám gạo Tổng quan hợp chất fructooligosaccharides Cấu tạo FOS Tính chất FOS Ứng dụng FOS 10 Tổng quan enzyme protease chế thủy phân 11 Cấu tạo phân loại enzyme protease 12 Cơ chế thủy phân enzyme 14 Ứng dụng enzyme protease thực phẩm 16 Các yếu tố ảnh hưởng đến trình thủy phân enzyme 19 Hợp chất bay phương pháp xác định 20 Sự hình thành hợp chất bay 20 Phương pháp xác định hợp chất bay 25 Phương pháp Metabolomics nghiên cứu thực phẩm 26 Tình hình nghiên cứu nước 28 Nghiên cứu nước liên quan 28 Nghiên cứu nước liên quan 29 3.1 3.1.1 3.1.2 3.1.3 Phương tiện nghiên cứu 33 Địa điểm thời gian nghiên cứu 33 Dụng cụ, thiết bị 33 Hóa chất 33 v 3.1.4 Nguyên liệu cám gạo 35 3.2 Phương pháp nghiên cứu 35 3.2.1 Các phương pháp phân tích 35 3.2.2 Phương pháp xử lý số liệu .36 3.3 Nội dung nghiên cứu 36 3.3.1 Nội dung 1: Nghiên cứu ảnh hưởng số yếu tố đến khả vô hoạt enzyme lipase cám gạo enzyme protease thương mại (Protamex Flavourzyme) 38 3.3.2 Nội dung 2: Nghiên cứu ảnh hưởng chế độ tiệt trùng thời gian bảo quản lên thành phần hợp chất bay nước cám gạo 43 3.3.3 Nội dung 3: Nghiên cứu động học phân hủy nhiệt hợp chất FOS (bao gồm GF2, GF3 GF4) trích ly từ cám gạo 48 3.3.4 Nội dung 4: Nghiên cứu sử dụng cám gạo vô hoạt enzyme lipase để chế biến thức uống dinh dưỡng 50 4.1 Nội dung 1: Ảnh hưởng số yếu tố đến khả vô hoạt enzyme lipase cám gạo chế phẩm Protamex Flavourzyme thương mại 55 4.1.1 Thành phần hóa học nguyên liệu cám gạo .55 4.1.2 Ảnh hưởng điều kiện trích ly enzyme lipase đến khả thu nhận enzyme từ cám gạo 56 4.1.3 Ảnh hưởng số yếu tố đến khả vô hoạt enzyme lipase cám gạo chế phẩm Protamex Flavourzyme .65 4.1.4 Tác dụng phối hợp chế phẩm Protamex Flavourzyme đến khả vô hoạt enzyme lipase cám gạo .72 4.2 Nội dung 2: Ảnh hưởng chế độ tiệt trùng thời gian bảo quản lên thành phần hợp chất bay nước cám gạo 77 4.2.1 Kết khảo sát chương trình chạy nhiệt thích hợp nghiên cứu hợp chất bay có nước cám gạo thủy phân 77 4.2.2 Ảnh hưởng chế độ tiệt trùng lên hợp chất bay dịch thủy phân cám gạo 80 4.2.3 Ảnh hưởng tỉ lệ dung dịch NaCl bão hòa bổ sung, nhiệt độ thời gian cân lấy mẫu headspace tĩnh 82 4.2.4 Ảnh hưởng thời gian bảo quản lên thành phần hợp chất bay nước cám gạo tiệt trùng 87 4.3 Nội dung 3: Động học phân hủy nhiệt hợp chất GF2, GF3 GF4 trích ly từ cám gạo 90 4.3.1 Xây dựng đường chuẩn làm sở định lượng GF2, GF3 GF4 cám gạo 90 4.3.2 Động học phân hủy nhiệt giá trị pH khác hợp chất GF2, GF3 GF4 trích ly từ cám gạo 95 4.3.3 Mơ hình hóa phụ thuộc nhiệt độ pH kết hợp số tốc độ phân hủy hợp chất GF2, GF3 GF4 trích ly từ cám gạo 101 4.4 Nội dung 4: Nghiên cứu chế biến sản phẩm ứng dụng từ cám gạo xử lý enzyme lipase 105 4.4.1 Ứng dụng chế biến sữa chua uống bổ sung dịch cám gạo vô hoạt enzyme lipase 106 4.4.2 Ứng dụng bã cám gạo xử lý enzyme lipase chế biến bột uống dinh dưỡng 112 vi 5.1 5.2 Kết luận 117 Kiến nghị 118 Phương pháp xác định hoạt tính enzyme lipase Xác định hàm lượng glycerol phương pháp quang phổ Phương pháp trích ly xác định fructooligosaccharide (FOS) [1-kestose (GF2), nystose (GF3), 1-fructosyl-nystose (GF4)] từ cám gạo vii DANH SÁCH BẢNG Bảng 2.1 So sánh thành phần hóa học cám gạo cám số loại ngũ cốc khác Bảng 2.2 So sánh thành phần acid amin (g/16gN) cám gạo ngũ cốc khác Bảng 2.3 Số lượng hợp chất dễ bay thuộc lớp hóa học khác báo cáo cám gạo (Nguồn: Henk, 1991) 23 Bảng 2.4 Chất bay gạo nấu truyền thống (Nguồn: Henk, 1991) 24 Bảng 2.5 Các chất bay hình thành tự oxy hóa acid béo khơng no (Nguồn: Henk, 1991) 24 Bảng 2.6 Số lượng đỉnh phổ biến nhận chất chuyển hóa thực phẩm 28 Bảng 3.1 Một số phương pháp phân tích tính chất hóa lý 35 Bảng 3.2 Ba nhân tố dùng phương pháp bề mặt đáp ứng với thiết kế Box-Behnken 40 Bảng 3.3 Ma trận thực nghiệm thí nghiệm tối ưu hóa nồng độ dung dịch NaCl, tỉ lệ dung dịch trích ly/nguyên liệu thời gian trích ly đến hoạt tính lipase 40 Bảng 3.4 Bố trí thí nghiệm xác định nhiệt độ thích hợp vô hoạt lipase cám gạo 41 Bảng 3.5 Bố trí thí nghiệm xác định tỉ lệ enzyme sử dụng thời gian vô hoạt lipase cám gạo 42 Bảng 3.6 Bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng tỷ lệ enzyme Flavourzyme thời gian đến khả vô hoạt enzyme lipase 42 Bảng 3.7 Các nhân tố ảnh hưởng lấy mẫu headspace tĩnh 45 Bảng 3.8 Thiết kế thí nghiệm tối ưu hóa tỉ lệ dung dịch NaCl bão hòa (so với dung dịch mẫu, V/V), nhiệt độ thời gian cân lấy mẫu headspace tĩnh 45 Bảng 3.9 Công thức pha dung dịch đệm photphat-citrat theo TCVN 4320:1986 ứng với giá trị pH 5,0, 6,0 7,0 49 Bảng 3.10 Chương trình pha động A B chạy sắc ký điều kiện phân mảnh để phân tích khối phổ định lượng GF2, GF3 GF4 50 Bảng 3.11 Tỷ lệ phối trộn nguyên liệu tạo bột uống hỗn hợp cám gạo dinh dưỡng vị cacao 53 Bảng 4.1 Thành phần hóa học nguyên liệu cám gạo 55 Bảng 4.2 Hoạt tính lipase thu nhận mẫu ứng với nghiệm thức thí nghiệm theo thiết kế Box-Behnken 61 Bảng 4.3 Kết phân tích hồi quy khơng tuyến tính dự đốn khả thu nhận enzyme lipase từ nguyên liệu cám gạo 62 Bảng 4.4 Giá trị tham số mơ hình hồi quy dự đốn khả thu nhận enzyme lipase từ nguyên liệu cám gạo dựa vào phương trình 4.2 62 Bảng 4.5 Giá trị tối ưu nồng độ dung dịch trích ly NaCl, tỷ lệ dung dịch trích/nguyên liệu thời gian trích ly q trình trích ly lipase từ cám gạo 65 Bảng 4.6 Ảnh hưởng tỷ lệ enzyme Protamex sử dụng thời gian xử lý đến hàm lượng glycerol sinh trình vô hoạt lipase cám gạo (%) 68 Bảng 4.7 Ảnh hưởng tỷ lệ enzyme Flavourzyme sử dụng thời gian xử lý đến hàm lượng glycerol sinh q trình vơ hoạt lipase cám gạo (%) 71 Bảng 4.8 Hiệu vô hoạt enzyme lipase cám gạo kết hợp nội ngoại enzyme 74 Bảng 4.9 Ảnh hưởng tỉ lệ dung dịch NaCl bão hòa (so với dung dịch mẫu, v/v), nhiệt độ thời gian cân lấy mẫu headspace tĩnh đến số lượng hợp chất bay ghi nhận kỹ thuật sắc ký khí khối phổ (GC-MS) 83 viii Mẫu GF2 - 100 - pH 5,0 GF2 - 100 - pH 6,0 PL - 21 GF2 - 100 - pH 7,0 Mẫu GF3 - 100 - pH 5,0 GF3 - 100 - pH 6,0 PL - 22 GF3 - 100 - pH 7,0 Mẫu GF4 - 100 - pH 5,0 GF4 - 100 - pH 6,0 PL - 23 GF4 - 100 - pH 7,0 Mẫu GF2 - 110 - pH 5,0 GF2 - 110 - pH 6,0 PL - 24 GF2 - 110 - pH 7,0 Mẫu GF3 - 110 - pH 5,0 GF3 - 110 - pH 6,0 PL - 25 GF3 - 110 - pH 7,0 Mẫu GF4 - 110 - pH 5,0 GF4 - 110 - pH 6,0 PL - 26 GF4 - 110 - pH 7,0 C2 Số liệu thí nghiệm lần Mẫu GF2 - 90 - pH 5,0 GF2 - 90 - pH 6,0 PL - 27 GF2 - 90 - pH 7,0 Mẫu GF3 - 90 - pH 5,0 GF3 - 90 - pH 6,0 PL - 28 GF3 - 90 - pH 7,0 Mẫu GF4 - 90 - pH 5,0 GF4 - 90 - pH 6,0 PL - 29 GF4 - 90 - pH 7,0 Mẫu GF2 - 100 - pH 5,0 GF2 - 100 - pH 6,0 PL - 30 GF2 - 100 - pH 7,0 Mẫu GF3 - 100 - pH 5,0 GF3 - 100 - pH 6,0 PL - 31 GF3 - 100 - pH 7,0 Mẫu GF4 - 100 - pH 5,0 GF4 - 100 - pH 6,0 PL - 32 GF4 - 100 - pH 7,0 Mẫu GF2 - 110 - pH 5,0 GF2 - 110 - pH 6,0 PL - 33 GF2 - 110 - pH 7,0 Mẫu GF3 - 110 - pH 5,0 GF3 - 110 - pH 6,0 PL - 34 GF3 - 110 - pH 7,0 Mẫu GF4 - 110 - pH 5,0 GF4 - 110 - pH 6,0 PL - 35 GF4 - 110 - pH 7,0