Luận án tiến sĩ y học nghiên cứu một số đặc điểm cận lâm sàng, kiểu gen của hbv và hcv ở người nghiện ma túy tại trung tâm cai nghiện thành phố hồ chí minh

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ QUỐC PHÒNG HỌC VIỆN QUÂN Y PHẠM HỮU QUỐC NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM CẬN LÂM SÀNG, KIỂU GEN CỦA HBV VÀ HCV Ở NGƯỜI NGHIỆN MA TÚY TẠI TRUNG TÂM CAI NGHIỆN THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH LUẬN ÁN TIẾN SĨ Y HỌC Hà Nội - 2022 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ QUỐC PHÒNG HỌC VIỆN QUÂN Y PHẠM HỮU QUỐC NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM CẬN LÂM SÀNG, KIỂU GEN CỦA HBV VÀ HCV Ở NGƯỜI NGHIỆN MA TÚY TẠI TRUNG TÂM CAI NGHIỆN THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH Chuyên ngành: Nội khoa Mã số: 9720107 LUẬN ÁN TIẾN SĨ Y HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS TS Trần Việt Tú GS TS Nguyễn Tấn Bỉnh Hà Nội - 2022 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan luận án cơng trình nghiên cứu với hướng dẫn khoa học tập thể cán hướng dẫn Các kết nêu luận án trung thực công bố phần báo khoa học Luận án chưa cơng bố Nếu có điều sai tơi xin hồn tồn chịu trách nhiệm TÁC GIẢ Phạm Hữu Quốc LỜI CẢM ƠN Trong trình học tập, nghiên cứu hồn thành luận án, tơi nhận giúp đỡ tận tình q Thầy, Cơ giáo, nhà Khoa học, anh, chị, em, bạn bè, đồng nghiệp người thân yêu Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành Ban Giám đốc Học viện Quân y Phòng, Ban khác tạo điều kiện thuận lợi cho q trình học tập nghiên cứu Tơi ln biết ơn Bộ mơn Nội tiêu hóa Học viện Qn y dành cho điều kiện tốt để tơi hồn thành chương trình học tập nghiên cứu khoa học Tôi xin trân trọng cảm ơn sâu sắc tới PGS.TS Trần Việt Tú, GS.TS Nguyễn Tấn Bỉnh tận tình giúp đỡ hướng dẫn tơi suốt q trình học tập, nghiên cứu hồn thành luận án Tôi xin cám ơn quý Thầy, Cô giáo tham gia giảng dạy giúp đỡ nhiều thời gian qua Tơi xin tỏ lịng biết ơn kính trọng đến quý Thầy Giáo sư, Tiến sỹ Hội đồng chấm luận án dành nhiều thời gian, công sức dẫn, giúp đỡ q trình hồn thiện bảo vệ thành cơng luận án Tôi chân thành cảm ơn Đảng ủy Chỉ huy Bệnh viện Quận Gò Vấp, Sở Y tế Thành phố Hồ Chí Minh tạo điều kiện tốt để học tập nghiên cứu Tôi biết ơn gia đình, người thân, bạn bè đồng nghiệp hỗ trợ, động viên, tạo điều kiện tốt để yên tâm học tập, nghiên cứu hoàn thành luận án Phạm Hữu Quốc MỤC LỤC Trang Trang phụ bìa Lời cam đoan Mục lục Danh mục chữ viết tắt luận án Danh mục bảng Danh mục biểu đồ Danh mục ảnh ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan chất ma túy .3 1.1.1 Khái niệm chất ma túy 1.1.2 Các chất ma túy thường gặp Việt Nam 1.1.3 Thực trạng xu hướng sử dụng ma túy 1.2 Đặc điểm dịch tễ học nhiễm HBV, HCV người nghiện ma túy 1.2.1 Trên giới 1.2.2 Ở Việt Nam 11 1.3 Một số đặc điểm vi rút biểu lâm sàng, cận lâm sàng nhiễm HBV, HCV .11 1.3.1 Đặc điểm hình thái cấu trúc vi rút viêm gan B C 11 1.3.2 Đặc điểm kiểu gen vi rút viêm gan B C .13 1.3.3 Đường lây truyền HBV, HCV 16 1.3.4 Các dấu ấn sinh học HBV, HCV 18 1.3.5 Biểu lâm sàng nhiễm vi rút viêm gan B C 23 1.3.6 Biểu cận lâm sàng nhiễm vi rút viêm gan B C 25 1.4 Đột biến kháng thuốc DAA vi rút viêm gan C 28 1.4.1 Cơ chế hình thành đột biến kháng thuốc DAA HCV .28 1.4.2 Xét nghiệm tìm đột biến kháng thuốc DAA HCV 30 1.5 Một số nghiên cứu nước 30 1.5.1 Trên giới 30 1.5.2 Tại Việt Nam 32 CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 34 2.1 Đối tượng, địa điểm thời gian nghiên cứu 34 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 34 2.1.2 Địa điểm nghiên cứu .35 2.1.3 Thời gian nghiên cứu 35 2.2 Thiết bị, vật liệu nghiên cứu 35 2.2.1 Thiết bị, hóa chất phục vụ cho xét nghiệm HBsAg, Anti-HCV 35 2.2.2 Thiết bị, hóa chất phục vụ cho xét nghiệm xác định tải lượng vi rút 36 2.2.3 Thiết bị, hóa chất phục vụ cho xét nghiệm xác định enzyme gan 36 2.2.4 Thiết bị, hóa chất phục vụ cho xét nghiệm kiểu gen HBV, HCV kháng thuốc DAA HCV 36 2.3 Phương pháp nghiên cứu .38 2.3.1 Thiết kế nghiên cứu .38 2.3.2 Cỡ mẫu 38 2.3.3 Nội dung nghiên cứu .39 2.4 Nhập xử lý số liệu 48 2.5 Đạo đức nghiên cứu 48 2.6 Sơ đồ nghiên cứu 49 CHƯƠNG KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 51 3.1 Một số đặc điểm chung đối tượng nghiên cứu 51 3.2 Đánh giá tỷ lệ nhiễm HBV, HCV, tải lượng vi rút hoạt độ enzyme gan đối tượng nghiên cứu 52 3.2.1 Tỷ lệ nhiễm HBV, HCV đối tượng nghiên cứu 52 3.2.2 Đặc điểm tải lượng HBV, HCV 55 3.2.3 Đặc điểm hoạt độ enzyme gan đối tượng nghiên cứu 57 3.3 Xác định kiểu gen HBV, HCV đột biến gen liên quan đến kháng thuốc DAA HCV đối tượng nghiên cứu 62 3.3.1 Đặc điểm kiểu gen HBV, HCV 62 3.3.2 Đột biến liên quan đến kháng thuốc DAA HCV 66 CHƯƠNG BÀN LUẬN 78 4.1 Một số đặc điểm chung đối tượng nghiên cứu 78 4.1.1 Đặc điểm giới tuổi .78 4.1.2 Đặc điểm chất gây nghiện, thời gian nghiện, đường sử dụng 80 4.2 Đánh giá tỷ lệ nhiễm HBV, HCV, tải lượng vi rút hoạt độ enzyme gan đối tượng nghiên cứu 83 4.2.1 Tỷ lệ nhiễm HBV, HCV nhóm đối tượng nghiện ma túy 83 4.2.2 Đặc điểm tải lượng vi rút 89 4.2.3 Đặc điểm enzyme gan người nhiễm HBV, HCV 92 4.3 Xác định kiểu gen HBV, HCV đột biến gen liên quan đến kháng thuốc DAA HCV đối tượng nghiên cứu 97 4.3.1 Kiểu gen HBV, HCV 97 4.3.2 Đột biến liên quan đến kháng thuốc DAA HCV 105 KẾT LUẬN 112 KIẾN NGHỊ .114 DANH MỤC CÁC CƠNG TRÌNH CƠNG BỐ KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU CỦA ĐỀ TÀI LUẬN ÁN 115 TÀI LIỆU THAM KHẢO 116 PHỤ LỤC 132 DANH MỤC CÁC CHỮ, KÝ HIỆU VIẾT TẮT TT Phần viết tắt ALT ARV AST ATS BCP BN cccDNA cDNA CIA 10 11 COI DAA 12 13 14 DNA DVS EIA 15 HBcAb 16 17 HBeAb HBeAg 18 HBsAg 19 HBV 20 21 HBV-DNA HBxAg 22 HCC 23 HCV 24 HCV-RNA Phần viết đầy đủ Alanine aminotransferase Antiretroviral Aspartate aminotransferase Amphetamine Type Stimulants Ma túy tổng hợp dạng Amphetamines Basal-Core Promoter Đột biến vùng Basal-Core Promoter Bệnh nhân covalently closed circular DNA DNA vịng đóng đồng hóa trị complementary DNA DNA bổ trợ Chemiluminescent Immunoassay Kỹ thuật hóa quang miễn dịch Chỉ số ngưỡng Direct-Acting Antiviral Kháng vi rút trực tiếp Deoxyribonucleic acid Dasabuvir Enzyme Immunoassay Kĩ thuật miễn dịch men Hepatitis B core antibody Kháng thể kháng kháng nguyên lõi vi rút viêm gan B Hepatitis B e antibody Hepatitis B e antigen Kháng nguyên e vi rút viêm gan B Hepatitis B surface antigen Kháng nguyên bề mặt vi rút viêm gan B Hepatitis B virus Vi rút viêm gan B Hepatitis B virus Deoxyribonucleic acid Hepatitis B virus X antigen Kháng nguyên X vi rút viêm gan B HepatoCellular Carcinoma Ung thư biểu mô tế bào gan Hepatitis C virus Vi rút viêm gan C Hepatitis C virus Ribonucleic acid TT 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 Phần viết tắt Phần viết đầy đủ HIV-AIDS Human immunodeficiency virus infection - acquired immunodeficiency syndrome Hội chứng suy giảm miễn dịch mắc phải người HIV IFN Interferon IgG Immunoglobulin G IgM Immunoglobulin M KTC Khoảng tin cậy LDV Ledipasvir LiPA Line Probe Assay Xét nghiệm thăm dò dòng LSD Lysergic acid diethylamide MA MethAmphetamine MDA Methylenedioxyamphetamine MDEA Methylenedioxy-N-ethylamphetamine MDMA Methylenedioxymethamphetamine MSM Men who have sex with men Quan hệ tình dục đồng giới nam NMT Nghiện ma túy ORF Open reading frames Khung đọc mở PC Precore Vùng Precore PCR Polymerase Chain Reaction Phản ứng chuỗi polymerase PT Prothrombin time RAV Resistance-associated Amino acid Variant Biến thể axit amin liên quan đến kháng thuốc RNA Ribonucleic acid SOF Sofosbuvir TPHCM Thành phố Hồ Chí Minh ULN Upper Limited of Normal Giới hạn giá trị bình thường UNODC United Nations Office on Drugs and Crime Văn phòng Liên Hợp Quốc ma túy tội phạm VGC Viêm gan cấp WHO World Health Organization Tổ chức y tế giới DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng Tên bảng Trang 2.1 Cặp mồi đặc hiệu dùng cho nhân dòng đoạn gen S HBV 37 2.2 Cặp mồi đặc hiệu dùng cho nhân dòng đoạn gen C HCV 37 2.3 Cặp mồi đặc hiệu cho nhân dòng đoạn NS5B HCV 38 3.1 Phân bố độ tuổi đối tượng nghiên cứu 51 3.2 Chất gây nghiện, thời gian nghiện đường sử dụng 52 3.3 Tải lượng vi rút nhóm đối tượng nhiễm HBV 55 3.4 Tải lượng vi rút nhóm đối tượng nhiễm HCV 56 3.5 So sánh tải lượng HBV, HCV đối tượng đơn nhiễm 56 3.6 Tải lượng HBV, HCV nhóm đối tượng đồng nhiễm 57 3.7 Hoạt độ enzyme gan nhóm nhiễm HBV 58 3.8 Hoạt độ enzyme gan nhóm nhiễm HCV 58 3.9 So sánh hoạt độ enzyme gan nhóm đơn nhiễm HBV HCV 59 3.10 So sánh hoạt độ enzyme gan với tuổi đối tượng nghiên cứu 59 3.11 Đặc điểm kiểu gen HBV 62 3.12 Đặc điểm kiểu gen HCV 63 3.13 So sánh hoạt độ enzyme gan đơn nhiễm HBV đơn nhiễm HCV 66 3.14 Lựa chọn mẫu HCV làm đột biến kháng thuốc DAA 66 3.15 Phân bố đột biến axit amin gen NS5B liên quan đến kháng thuốc DAA mẫu HCV kiểu gen 1A 67 3.16 Phân bố đột biến axit amin gen NS5B liên quan đến kháng thuốc DAA mẫu HCV kiểu gen 1B 68 3.17 Phân bố đột biến axit amin gen NS5B liên quan đến kháng thuốc DAA mẫu HCV kiểu gen 3A 70 3.18 Phân bố đột biến axit amin gen NS5B liên quan đến kháng thuốc DAA mẫu HCV kiểu gen 3B 70 3.19 Phân bố đột biến axit amin gen NS5B liên quan đến kháng thuốc DAA mẫu HCV kiểu gen 6A 71 Thành phần phản ứng PCR (vịng 2): Thành phần Thể tích (µl) Taq PCR 2x Master mix MgCl2 (25 mM) DMSO S7 (10 µM) A5 (10 µM) Sản phẩm PCR vòng H2O 25 2 1 17 Tổng thể tích phản ứng 50 Chu kỳ nhiệt phản ứng PCR (vịng 2) Các bước Biến tính giai đoạn Biến tính giai đoạn Gắn mồi Kéo dài Kéo dài lần cuối Nhiệt độ 95oC 95oC 60oC 72oC 72oC Thời gian phút 30 giây 30 giây phút phút 35 chu kỳ  Bước 3: Điện di kiểm tra sản phẩm PCR Sản phẩm PCR vòng điện di kiểm tra gel agarose 1,2% với dung dịch đệm TAE 1X  Chuẩn bị gel Agarose 1,2%: Đun sơi cho tan hồn tồn agarose đệm TAE lị vi sóng Đợi nhiệt độ dung dịch gel hạ xuống 56 60oC, đổ gel vào phiến nhựa điện di (6 x 5,5 cm x 11 cm tuỳ theo số lượng mẫu cần điện di), phiến nhựa đặt thăng mặt phẳng nằm ngang khay cài sẵn lược tạo giếng  Để gel đơng lại (khoảng 30 phút nhiệt độ phịng), gỡ bỏ lược cách kéo theo phương thẳng đứng (tránh làm thủng giếng), đặt gel vào buồng điện di ngang cho chìm hẳn dung dịch đệm TAE 1X  Sử dụng micropipette hút – 10 µl sản phẩm PCR trộn với µl loading dye cho hỗn hợp vào giếng gel, với giếng tích lớn điện di 20 µl sản phẩm PCR  Điện di với hiệu điện 120 V, cường độ dòng điện 100 mA thời gian 30 phút  Các mẫu thực nghiệm điện di song song với chứng âm dương  Ln có thang ADN chuẩn để đối chiếu kết đọc  Nhuộm ADN đọc kết Bản gel sau điện di ngâm dung dịch Gel red 1% pha nước cất (trong phút) (hoặc bổ sung khâu chuẩn bị gel), sau vớt gel ngâm vào nước cất 10 phút để rửa thạch Sau nhuộm, vạch ADN gel phát sáng ánh đèn cực tím Đọc kết điện di hệ thống máy GelDoc (BioRad), chụp ảnh thiết bị phần mềm chuyên dụng lưu máy tính  Bước 4: Đo nồng độ ADN sản phẩm PCR Sử dụng máy Bio photometer (Đức), chuẩn bị 02 ống:  Ống chứng: 50 l dung dịch PBS 1X nước cất  Ống mẫu: l sản phẩm PCR + 45 l dung dịch PBS 1X nước cất Đo bước sóng 260 nm: đơn vị = 50 g/ml Đọc kết quả: Lượng ADN có mẫu (g/ml) x 10 x 103/103(l) = nanogam (ng)/l (x 10: Độ pha loãng 10 lần, x 103/103: đổi đơn vị từ g/ml sang ng/l)  Bước 5: Giải trình tự gen đoạn gen Core HCV Sử dụng kít BigDye® Terminator v3.1 sequencing Kit (Mỹ), pha mix theo hướng dẫn nhà sản xuất:  Kỹ thuật PCR sequencing Mẫu xét nghiệm: Thành phần phản ứng PCR sequencing 1: Thành phần Thể tích (µl) Big Dye® Terminator (Ready mix) Big Dye® Terminator (5X buffer) Primer A5 (10 µM) ADN template (sản phẩm PCR tinh sạch) Nước khử ion 4,0 2,0 1,0 2,0 11,0 Tổng thể tích phản ứng 20,0 Thành phần phản ứng PCR sequencing 2: Thnh phn Th tớch (àl) Big Dyeđ Terminator (Ready mix) Big Dye® Terminator (5X buffer) Primer S7 (10 µM) ADN template (sản phẩm PCR tinh sạch) Nước khử ion 4,0 2,0 1,0 2,0 11,0 Tổng thể tích phản ứng 20,0 Chứng dương: Thành phần phản ứng chng dng: Thnh phn Th tớch (àl) Big Dyeđ Terminator (Ready mix) Big Dye® Terminator (5X buffer) Primer M13F Vector pGEM-3Zf Nước khử ion 4,0 2,0 1,0 1,0 12,0 Tổng thể tích phản ứng 20,0 Chu kỳ nhiệt: Bước nhiệt 96oC 96oC 50oC 60oC 4oC Thời gian phút 10 giây giây phút Giữ mẫu 25 chu kỳ - Bước 6: Tinh sản phẩm PCR sequencing: Sử dụng kit BigDye® X Terminator Purification Kit (Mỹ) để tinh sạch:  Cho vào ống PCR sequencing tích 20 l (sản phẩm PCR dùng cho bước giải trình tự nucleotide) dung dịch sau:  SAM TM Solution: 90l (nếu có tủa ủ 37oC/10 phút, sau vortex trước dùng)  X TerminatorTM Solution (Big Dye X): 20 l (trước dùng phải vortex thật kỹ)  Sau cho dung dịch vào ống, đặt máy lắc 30 phút  Ly tâm 1.000 vòng phút  Cho hỗn dịch vào giếng GeneAmpđ 96-Well microtiter plate 20 l, đặt đĩa máy sequencer tiến hành chạy Trong trình giải trình tự, cần sử dụng chất chuẩn (stADNard) để kiểm tra trình sequencing Sử dụng kít Big Dye® Terminator v1.1/Matrix StADNard Kit:  Pha 170 – 200 l Hi-DiTM Formamide vào ống Matrix StADNard vortex  Ủ 95oC phút, chuyển vào khay đá  Cho vào giếng chứng 20 l - Bước 7: Giải trình tự nucleotide máy 3130:  Trên hình chính, mở phần mềm Run 3130 data Collection v3.0  Đợi tín hiệu chuyển sang màu xanh bắt đầu cài đặt chương trình  Bấm chuột vào biểu tượng +  Lựa chọn Plate manager  Chọn New o Cài đặt tên o Chọn Sequencing analysis o Đặt Owner name o Đặt Operator name o Chọn OK bảng Sequencinganalysis plate editor  Cột Sample name: đặt tên mẫu  Cột Results group: lựa chọn nơi kết lưu lại  Cột Instrument protocol 1: chọn BDx_Seq_POP7_Cap50_fast  Cột Analysis protocol: chọn 3130POP7_BDTv3-KB-Denovo-v5.2  Các cột lại bỏ trống  Bấm OK  Lựa chọn Plate view o Chọn Find all o Chọn chương trình cài đặt o Click đúp chuột vào vị trí plate để kết nối o Xuất biểu tượng ►màu xanh o Bấm vào biểu tượng ► màu xanh để bắt đầu chạy  Thu nhận kết giải trình tự nucleotide: Kết chạy sequencing tự động lưu lại thư mục chọn  Trên hình chính, bật phần mềm Sequence Analysis 5.4  Vào thư mục file, nhập kết giải trình tự lưu thư mục máy tính  Bấm vào biểu tượng ►màu xanh để tiến hành xử lý liệu  Vào thư mục file chọn Save để lưu liệu xử lý  Sao chép sữ liệu vào đĩa CD  Bước 8: Phân tích trình tự đoạn gen Core HCV  Sử dụng phần mềm ATGC phiên 7.02 (Nhật) để phân tích trình tự nucleotide đoạn gen Core HCV  Cài đặt phần mềm ATGC phiên 7.02 vào máy tính, hình mở phần mềm  Vào thư mục File → New → Add file (nhập hai trình tự nucleotide với mồi A5 S7 mẫu HCV) chọn OK  Vào thư mục Analyze → Assemble để tiến hành bắt cặp trình tự chuỗi Sense (có nghĩa) Anti-sense (đối nghĩa)  Vào thư mục View → Wave window để thị bước sóng nucleotide (A màu xanh lá, T màu đỏ, G màu tím, C màu xanh da trời)  Đối chiếu cặp nucleotide đối mã (A – T, G – C) trình tự bước sóng để khẳng định tính xác trình tự nucleotide  Loại bỏ đoạn trình tự nucleotide hai đầu có chất lượng kém, thu nhận đoạn trình trình có chất lượng đọc tốt  Lưu trình tự phân tích vào file đặt tên theo mẫu xét nghiệm  Bước 9: Tìm kiểu gen HCV  Vào trang liệu https://hcv.lanl.gov/content/index kiểu gen HCV National Institute of Health (Mỹ)  Chọn mục HCV Sequence Database → HCV Blast, nhập trình tự nucleotide xử lý  Chọn Submit để tiến hành tìm trình tự tương đồng có kiểu gen tương ứng có ngân hàng liệu Các kiểu gen HCV ký hiệu số bao gồm 06 kiểu gen: 1, 2, 3, 4, 5, kiểu gen phụ ký hiệu chữ thường a, b, c, d, e, f… Xét nghiệm xác định đột biến kháng thuốc DAA HCV Bao gồm bước sau:  Bước 1: Tách chiết vật liệu di truyền ARN HCV Mẫu huyết tương bảo quản nhiệt độ -80 oC rã đông cách để nhiệt độ phòng 30 phút trước tiến hành tách chiết ARN tổng số sử dụng kit QIAamp Viral RNA Mini Kit hãng Qiagen (Cat No 52904), gồm bước sau đây: - Hút 560 µl đệm AVL có chứa sẵn ARN carier vào ống eppendorf 1,5 ml vơ trùng - Cho 140 µl huyết tương đối tượng vào ống eppendorf chưa AVL, trộn cách vortex mẫu 15 giây - Ủ nhiệt độ phòng 10 phút - Ly tâm nhẹ ống để đẩy dung dịch bám phía xuống đáy ống - Cho thêm 560µl ethanol (96-100%) vào ống, trộn vortex mạnh 15 giây Sau ly tâm nhẹ để đẩy dung dịch phía xuống đáy ống - Chuyển toàn dung dịch bước lên cột QIAamp Mini spin (có ống hứng 2ml phía dưới), tránh làm dính dung dịch miệng ống Ly tâm cột tốc độ 6,000 x g (8,000 vịng) phút, sau chuyển cột sang ống hứng loại bỏ ống hứng phía - Thêm 500µl Buffer AW1, tránh làm ướt miệng ống Đóng chặt nắp ly tâm tốc độ 6,000 x g (8,000 vòng) phút, sau chuyển cột sang ống hứng loại bỏ ống hứng phía - Mở nắp cột QIAamp Mini spin cho 500µl Buffer AW2, tránh làm ướt miệng ống, đóng chặt nắp ly tâm tốc độ tối đa (20,000 x g; 14,000 vòng) phút - Chuyển cột sang ống hứng ly tâm thêm tốc độ tối đa phút - Đặt cột vào ống eppendorf 1,5ml vô trùng, loại bỏ ống hứng cũ phía Mở nắp cột cho 60µl Buffer AVE, ủ nhiệt độ phịng phút sau ly tâm tốc độ 6,000 x g (8,000 vòng) phút Loại bỏ cột lọc thu dung dịch ống hứng phía dưới, ARN tổng số tinh hịa tan nước (buffer), ARN sử dụng trực tiếp làm khuôn cho phản ứng PCR bảo quản nhiệt độ -20 0C  Bước 2: PCR nhân dòng đoạn gen NS5B HCV: gồm phản ứng PCR Thành phần phản ứng PCR (vịng 1): Thành phần Thể tích (µl) 2x Master mix Enzyme MgCl2 (25 mM) DMSO Primer PR1 (10 µM) Primer PR2 (10 µM) ADN khn H2O 25 2 1 14,5 Tổng thể tích phản ứng 50 Chu trình nhiệt: Các bước Tạo cDNA Biến tính giai đoạn Biến tính giai đoạn Gắn mồi Kéo dài Kéo dài lần cuối Nhiệt độ 50oC 95oC 95oC 58oC 72oC 72oC Thời gian 30 phút phút 30 giây 30 giây phút phút 40 chu kỳ Thành phần phản ứng PCR (vòng 2): Thành phần Thể tích (µl) 2x Master mix MgCl2 (25 mM) DMSO Primer PR3 (10 µM) Primer PR4 (10 µM) ADN khuôn H2O 25 1 15 Tổng thể tích phản ứng 50 Chu trình nhiệt: Các bước Biến tính giai đoạn Biến tính giai đoạn Gắn mồi Kéo dài Kéo dài lần cuối Nhiệt độ 95oC 95oC 57oC 72oC 72oC Thời gian phút 30 giây 30 giây phút phút 35 chu kỳ  Bước 3: Điện di kiểm tra sản phẩm PCR Sản phẩm PCR vòng điện di kiểm tra gel agarose 1,2% với dung dịch đệm TAE 1X  Chuẩn bị gel Agarose 1,2%: Đun sôi cho tan hồn tồn agarose đệm TAE lị vi sóng Đợi nhiệt độ dung dịch gel hạ xuống 56 60oC, đổ gel vào phiến nhựa điện di (6 x 5,5 cm x 11 cm tuỳ theo số lượng mẫu cần điện di), phiến nhựa đặt thăng mặt phẳng nằm ngang khay cài sẵn lược tạo giếng  Để gel đông lại (khoảng 30 phút nhiệt độ phòng), gỡ bỏ lược cách kéo theo phương thẳng đứng (tránh làm thủng giếng), đặt gel vào buồng điện di ngang cho chìm hẳn dung dịch đệm TAE 1X  Sử dụng micropipette hút – 10 µl sản phẩm PCR trộn với µl loading dye cho hỗn hợp vào giếng gel, với giếng tích lớn điện di 20 µl sản phẩm PCR  Điện di với hiệu điện 120 V, cường độ dòng điện 100 mA thời gian 30 phút  Các mẫu thực nghiệm điện di song song với chứng âm dương  Ln có thang ADN chuẩn để đối chiếu kết đọc  Nhuộm ADN đọc kết Bản gel sau điện di ngâm dung dịch Gel red 1% pha nước cất (trong phút) (hoặc bổ sung khâu chuẩn bị gel), sau vớt gel ngâm vào nước cất 10 phút để rửa thạch Sau nhuộm, vạch ADN gel phát sáng ánh đèn cực tím Đọc kết điện di hệ thống máy GelDoc (BioRad), chụp ảnh thiết bị phần mềm chuyên dụng lưu máy tính  Bước 4: Đo nồng độ ADN sản phẩm PCR Sử dụng máy Bio photometer (Đức), chuẩn bị 02 ống:  Ống chứng: 50 l dung dịch PBS 1X nước cất  Ống mẫu: l sản phẩm PCR + 45 l dung dịch PBS 1X nước cất Đo bước sóng 260 nm: đơn vị = 50 g/ml Đọc kết quả: Lượng ADN có mẫu (g/ml) x 10 x 103/103(l) = nanogam (ng)/l (x 10: Độ pha loãng 10 lần, x 103/103: đổi đơn vị từ g/ml sang ng/l)  Bước 5: Giải trình tự gen đoạn gen NS5B HCV Sử dụng kít BigDye® Terminator v3.1 sequencing Kit (Mỹ), pha mix theo hướng dẫn nhà sản xuất:  Kỹ thuật PCR sequencing Mẫu xét nghiệm: Thành phần phản ứng PCR sequencing 1: Thnh phn Th tớch (àl) Big Dyeđ Terminator (Ready mix) Big Dyeđ Terminator (5X buffer) Primer PR3 (10 àM) ADN template (sản phẩm PCR tinh sạch) Nước khử ion 4,0 2,0 1,0 2,0 11,0 Tổng thể tích phản ứng 20,0 Thành phần phản ứng PCR sequencing 2: Thành phần Th tớch (àl) Big Dyeđ Terminator (Ready mix) Big Dyeđ Terminator (5X buffer) Primer PR4 (10 µM) ADN template (sản phẩm PCR tinh sạch) Nước khử ion 4,0 2,0 1,0 2,0 11,0 Tổng thể tích phản ứng 20,0 Chứng dương: Thành phần phản ứng chứng dương: Thành phần Th tớch (àl) Big Dyeđ Terminator (Ready mix) Big Dyeđ Terminator (5X buffer) Primer M13F Vector pGEM-3Zf Nước khử ion 4,0 2,0 1,0 1,0 12,0 Tổng thể tích phản ứng 20,0 Chu kỳ nhiệt: Bước nhiệt 96oC 96oC 50oC 60oC 4oC Thời gian phút 10 giây giây phút Giữ mẫu 25 chu kỳ - Bước 6: Tinh sản phẩm PCR sequencing: Sử dụng kit BigDye® X Terminator Purification Kit (Mỹ) để tinh sạch:  Cho vào ống PCR sequencing tích 20 l (sản phẩm PCR dùng cho bước giải trình tự nucleotide) dung dịch sau:  SAM TM Solution: 90l (nếu có tủa ủ 37oC/10 phút, sau vortex trước dùng)  X TerminatorTM Solution (Big Dye X): 20 l (trước dùng phải vortex thật kỹ)  Sau cho dung dịch vào ống, đặt máy lắc 30 phút  Ly tâm 1.000 vòng phút  Cho hỗn dịch vào giếng GeneAmpđ 96-Well microtiter plate 20 l, đặt đĩa máy sequencer tiến hành chạy Trong trình giải trình tự, cần sử dụng chất chuẩn (stADNard) để kiểm tra trình sequencing Sử dụng kít Big Dye® Terminator v1.1/Matrix StADNard Kit:  Pha 170 – 200 l Hi-DiTM Formamide vào ống Matrix StADNard vortex  Ủ 95oC phút, chuyển vào khay đá  Cho vào giếng chứng 20 l - Bước 7: Giải trình tự nucleotide máy 3130:  Trên hình chính, mở phần mềm Run 3130 data Collection v3.0  Đợi tín hiệu chuyển sang màu xanh bắt đầu cài đặt chương trình  Bấm chuột vào biểu tượng +  Lựa chọn Plate manager  Chọn New o Cài đặt tên o Chọn Sequencing analysis o Đặt Owner name o Đặt Operator name o Chọn OK bảng Sequencinganalysis plate editor  Cột Sample name: đặt tên mẫu  Cột Results group: lựa chọn nơi kết lưu lại  Cột Instrument protocol 1: chọn BDx_Seq_POP7_Cap50_fast  Cột Analysis protocol: chọn 3130POP7_BDTv3-KB-Denovo-v5.2  Các cột lại bỏ trống  Bấm OK  Lựa chọn Plate view o Chọn Find all o Chọn chương trình cài đặt o Click đúp chuột vào vị trí plate để kết nối o Xuất biểu tượng ►màu xanh o Bấm vào biểu tượng ► màu xanh để bắt đầu chạy  Thu nhận kết giải trình tự nucleotide: Kết chạy sequencing tự động lưu lại thư mục chọn  Trên hình chính, bật phần mềm Sequence Analysis 5.4  Vào thư mục file, nhập kết giải trình tự lưu thư mục máy tính  Bấm vào biểu tượng ►màu xanh để tiến hành xử lý liệu  Vào thư mục file chọn Save để lưu liệu xử lý  Sao chép sữ liệu vào đĩa CD  Bước 8: Phân tích trình tự đoạn gen NS5B HCV  Sử dụng phần mềm ATGC phiên 7.02 (Nhật) để phân tích trình tự nucleotide đoạn gen Core HCV  Cài đặt phần mềm ATGC phiên 7.02 vào máy tính, hình mở phần mềm  Vào thư mục File → New → Add file (nhập hai trình tự nucleotide với mồi PR3 PR4 mẫu HCV) chọn OK  Vào thư mục Analyze → Assemble để tiến hành bắt cặp trình tự chuỗi Sense (có nghĩa) Anti-sense (đối nghĩa)  Vào thư mục View → Wave window để thị bước sóng nucleotide (A màu xanh lá, T màu đỏ, G màu tím, C màu xanh da trời)  Đối chiếu cặp nucleotide đối mã (A – T, G – C) trình tự bước sóng để khẳng định tính xác trình tự nucleotide  Loại bỏ đoạn trình tự nucleotide hai đầu có chất lượng kém, thu nhận đoạn trình trình có chất lượng đọc tốt Lưu trình tự phân tích vào file đặt tên theo mẫu xét nghiệm  Bước 9: Tìm đột biến điểm liên quan đến kháng DAA đoạn gen NS5B  Thu nhận trình tự gốc dạng hoang dã (Wild-type) chủng HCV có kiểu gen (genotype) với mã GenBank tương ứng: 1A (NC_004102), 1B (EU781827), 3A (D17763), 3B (D49374), 6A (Y12083), 6E (KY608690), 6H (KY608700)  Mỗi lần phân tích kiểu gen Mở phần mềm ATGC 7.02, vào thư mục File → New → Add file → OK để nhập trình tự HCV mẫu xét nghiệm trình tự gốc dạng hoang dã kiểu gen  Vào thư mục Analyze → Assemble tìm điểm nucleotide khác biệt chủng HCV mẫu xét nghiệm với chủng HCV tham chiếu  Các điểm đột biến gen NS5B HCV có liên quan đến kháng thuốc DAA bao gồm: o Đột biến kháng Sofosbuvir (SOF) – Nucleotide Inhibitors (NIs): L159, S282, E237, D244, C316, L320, V321 Đột biến kháng Dasabuvir (DVS) – Non-nucleotide Inhibotors (NNIs):N273, D244, Q309, D310, L314, C316, C326, S329, Q330, A333, S368, A395, N411, M414, N444, C445, E446, Y448, C451, A553, G554, S556, G558, D559, Y561, S565