Xây dựng bộ kit định lượng PCR HBV QPCR để phát hiện virus viêm gan b HBV

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN -    - Nguyễn Quang Duy XÂY DỰNG BỘ KIT ĐỊNH LƯỢNG PCR HBV (QPCR) ĐỂ PHÁT HIỆN VIRUS VIÊM GAN B (HBV) LUẬN VĂN THẠC SỸ KHOA HỌC Hà Nội - 2017 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN -    - Nguyễn Quang Duy XÂY DỰNG BỘ KIT ĐỊNH LƯỢNG PCR HBV (QPCR) ĐỂ PHÁT HIỆN VIRUS VIÊM GAN B (HBV) Chuyên ngành Sinh học Thực nghiệm Mã số: 60420114 LUẬN VĂN THẠC SỸ KHOA HỌC CÁN BỘ HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS Võ Thị Thương Lan Hà Nội - 2017 Lời cảm ơn Để hồn thành khóa luận này, em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS TS Võ Thị Thương Lan Cô hướng dẫn truyền đạt cho em kiến thức kinh nghiệm quý báu Cô nhắc nhở, bảo ban động viên em suốt thời gian hoàn thành luận văn Dưới hướng dẫn cô, em không học nhiều kiến thức chun mơn mà cịn có học sống Đây hành trang quý báu để em bước tiếp nghiệp Em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới Ths Phạm Anh Thùy Dương, chị người tận tình hướng dẫn bảo tận tình suốt trình em thực đề tài Chị người dạy cho em tính tự giác thái độ nghiêm túc công việc giao Em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến ThS Tạ Bích Thuận, người ln động viên chia sẻ với em khó khăn suốt thời gian qua, giúp em hồn thành tốt luận văn Em xin gửi lời cảm ơn đến NCS Ngô Thị Hà, CN Nguyễn Thu Trang người bạn phịng thí nghiệm Sinh Y giúp đỡ động viên tinh thần em suốt thời gian thực đề tài Cuối em xin gửi lịng biết ơn tới gia đình hỗ trợ em vật chất tinh thần thời gian em thực khóa luận Hà Nội, ngày tháng Học viên cao học Nguyễn Quang Duy năm DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT PCR : Polymerase Chain Reaction (Phản ứng chuỗi trùng hợp) Real-time PCR : Real-time Polymerase Chain Reaction (PCR thời gian thực) HBcAg : Hepatitis B core antigen (Kháng nguyên lõi virus) Anti - HBc : Kháng thể HBcAg HBeAg : Hepatitis B envelope antigen (Kháng nguyên vỏ virus) Anti - HBe : Kháng thể HBeAg HBsAg : Hepatitis B surface antigen (Kháng nguyên bề mặt virus) Anti - HBs : Kháng thể HBsAg HBV : Hepatitis B virus (Virus viêm gan B) cccDNA : Covalently closed circular DNA (Cấu trúc DNA siêu xoắn) Genotype : Kiểu gen Sub genotype : Dưới kiểu gen ORF : Open Reading Frame (Khung đọc mở) HBxAg : Hepatitis B virus X antigen (Kháng nguyên X virus) DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 1.1 : So sánh kit thương mại sử dụng để định lượng HBV 15 Bảng 2.1 : Trình tự mồi sử dụng nghiên cứu 25 Bảng 2.2 : Trình tự đầu dị Taqman sử dụng nghiên cứu 25 Bảng 2.3 : Điều kiện phản ứng PCR tối ưu để khuếch đại HBV 26 Bảng 2.4 : Thành phần điều kiện phản ứng real-time PCR 27 Bảng 2.5 : Thành phần gel polyacrylamide 8% dùng điện di DNA 27 Bảng 2.6 : Thành phần điều kiện phản ứng cắt plasmid HBV 29 Bảng 3.1 : Giá trị Ct plasmid HBV sử dụng nồng độ 41 Taqman khác Bảng 3.2 : Giá trị Ct plasmid HBV plasmid IC nồng độ khảo 42 sát Bảng 3.3 : Giá trị Ct plasmid HBV plasmid IC từ hai điều kiện bảo 43 quản khác Bảng 3.4 : Giá trị Ct plasmid HBV mẫu bệnh phẩm 46 DANH MỤC CÁC HÌNH Trang Hình 1.1 : Hình ảnh kính hiển vi tử số lượng gần thành phần liên quan đến HBV ml huyết bệnh nhân mang HBV mãn tính Hình 1.2 : Cấu trúc hệ gen HBV Hình 1.3 : Quá trình xâm nhiễm HBV Hình 1.4 : Phân bố địa lý genotypes HBV giới Hình 1.5 : Phân bố tỷ lệ người nhiễm HBV theo địa lý Hình 1.6 : Kĩ thuật DNA nhánh 12 Hình 1.7 : Kĩ thuật lai bắt giữ 13 Hình 1.8 : PCR cạnh tranh định lượng 14 Hình 1.9 : Biểu đồ khuếch đại mẫu real-time PCR 16 Hình 1.10 : Real-time PCR sử dụng đầu dị Taqman 20 Hình 2.1 : Sơ đồ thí nghiệm 23 Hình 3.1 : Kết khuếch đại gen P từ mẫu dương tính HBV 31 cặp mồi HBV F/R Hình 3.2 : Kết sàng lọc khuẩn lạc mang đoạn chèn HBV 105 bp 32 gel agarose 2% Hình 3.3 : Kết xác định nồng độ điện di kiểm tra plasmid HBV 32 Hình 3.4 : Kết so sánh trình tự đoạn chèn plasmid HBV với 33 trình tự genotype Hình 3.5 : Kết xác định nồng độ điện di kiểm tra plasmid HBV 34 sau cắt với ScaI tinh Hình 3.6 : Sản phẩm IC khuếch đại từ DNA thực khuẩn thể 35 Hình 3.7 : Kết sàng lọc khuẩn lạc mang đoạn chèn IC 218 bp 35 gel agarose 2% Hình 3.8 : Kết xác định nồng độ điện di kiểm tra plasmid IC Hình 3.9 : Kết so sánh trình tự đoạn chèn IC với trình tự 37 NCBI Hình 3.10 : Kết khảo sát dải nồng độ plasmid HBV trộn 105 copy 38 plasmid IC với nồng độ mồi 0.67 µM Hình 3.11 : Kết khảo sát dải nồng độ 102, 103, 106, 107 copy 38 plasmid HBV trộn 105 copy plasmid IC với nồng độ mồi 0.8 µM, 1.0 µM 1.2 µM Hình 3.12 : Kết khảo sát dải nồng độ 3, 5, 102, 105 copy plasmid 39 HBV trộn 105 copy plasmid IC nhiệt độ gắn mồi 62oC Hình 3.13 : Khảo sát độ nhạy phát plasmid HBV Hình 3.14 : Kết phối trộn 5x104 105 copy plasmid IC với 5, 50, 41 102 105 copy plasmid HBV Hình 3.15 : Kết phối trộn 104 5x104 copy plasmid IC với 10, 25, 41 50 102 copy plasmid HBV Hình 3.16 : Đường chuẩn với nồng độ plasmid HBV 108, 104, 102, 25, 42 10 copy Hình 3.17 : Đường chuẩn xây dựng từ hai set plasmid Hình 3.18 : Đường tín hiệu khuếch đại phản ứng định lượng bốn 45 mẫu bệnh phẩm Hình 3.19 : Đường chuẩn định lượng bốn mẫu bệnh phẩm 36 40 44 45 MỤC LỤC MỞ ĐẦU CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu Hepatitis B Virus .2 1.1.1 Cấu trúc HBV 1.1.2 Cơ chế xâm nhiễm HBV .4 1.1.3 Phân loại 1.2 Dịch tễ học viêm gan B 1.2.1 Tình hình mắc viêm gan B giới Việt Nam .7 1.2.2 Phương thức lây truyền .9 1.2.3 Các giai đoạn nhiễm HBV 1.3 Các phương pháp chuẩn đoán nhiễm HBV 11 1.3.1 Kĩ thuật DNA nhánh (Branched DNA technology) 12 1.3.2 Kĩ thuật lai bắt giữ (Hybrid capture technology) 12 1.3.3 PCR cạnh tranh định lượng (Quantitative-competitive PCR) 13 1.3.4 Real-time PCR 16 CHƯƠNG 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGUYÊN CỨU 22 2.1 Thiết kế thí nghiệm 22 2.2 Nguyên liệu, hóa chất thiết bị 24 2.2.1 Đối tượng nghiên cứu 24 2.2.2 Hóa chất sinh phẩm 24 2.2.3 2.2 Trang thiết bị .25 Phương pháp nghiên cứu .26 2.2.1 Phương pháp PCR phương pháp real-time PCR 26 2.2.2 Phương pháp điện di 27 2.2.3 Phương pháp ligate 28 2.2.5 Phương pháp xác định nồng độ DNA .29 2.2.6 Cắt tinh plasmid sau cắt 29 2.2.7 Phương pháp pha loãng .30 Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 31 3.1 Tách dòng plasmid mang đoạn gen P HBV 31 3.2 Tạo mẫu chuẩn HBV 33 3.3 Tạo DNA nội chuẩn .34 3.3.1 Thiết kế đoạn IC 35 3.3.2 Tách dòng IC .35 3.4 Chuẩn hóa điều kiện phát HBV IC 37 3.4.1 Tối ưu thành phần điều kiện phản ứng 37 3.4.2 Khảo sát độ giới hạn phát HBV 39 3.4.3 Tối ưu hóa nồng độ plasmid IC phối trộn với plasmid HBV 40 3.4.4 Tối ưu điều kiện phản ứng real-time PCR 42 3.5 Xây dựng đường chuẩn định lượng HBV xác định giới hạn phát HBV real-time PCR .42 KẾT LUẬN 47 KIẾN NGHỊ 47 TÀI LIỆU THAM KHẢO 48 khẳng định tính ổn định kết chúng tơi tiến hành lặp lại thí nghiệm (Hình 3.13) Hình 3.13: Khảo sát độ nhạy phát plasmid HBV A: Khảo sát nồng độ 50, 25, 10, 5, copy B: Lặp lại thí nghiệm M: Marker DNA 100 bp; (-): Đối chứng âm khơng có DNA khn Hình 3.13 cho thấy phản ứng có độ nhạy phát copy Kết thí nghiệm giữ ổn định lần lặp lại Điều cho thấy chúng tơi tối ưu hóa thành cơng điều kiện phản ứng cho giới hạn phát copy pHBV 3.4.3 Tối ưu hóa nồng độ plasmid IC phối trộn với plasmid HBV Vì sử dụng cặp mồi nên tượng cạnh tranh PCR xảy nồng độ khuôn pIC pHBV chênh lệch Khi nồng độ pIC vượt nhiều lần nồng độ pHBV, gen đích khơng phát hiện, gây tượng âm tính giả Để khắc phục tượng đảm bảo độ nhạy kit, nồng độ pIC thả vào trì giá trị trung bình, khơng gây ức chế phản ứng khuếch đại gen đích nồng độ gen đích thấp Ở thí nghiệm trên, phối trộn 105 copy pIC, phát 100 copy pHBV Do đó, thí nghiệm tiếp theo, chúng tơi tiến hành khảo sát nồng độ pIC phối trộn thấp Đầu tiên, so sánh kết 5x104 105 copy pIC với nồng độ khác pHBV Kết trình bày Hình 3.14 40 Hình 3.14: Kết phối trộn 5x104 105 copy plasmid IC với 5, 50, 102 105 copy plasmid HBV M: Marker DNA 100 bp; (-): Đối chứng âm khơng có khn Hình 3.14 cho thấy khơng có khác biệt hai nồng độ 5x104 105 copy pIC phối trộn với pHBV Đồng thời, băng đặc hiệu cho HBV phát với 50 copy âm tính nồng độ copy pHBV Chúng tiếp tục giảm nồng độ pIC xuống lần (104 copy) khảo sát thêm nồng độ pHBV khoảng từ copy đến 50 copy Kết thể Hình 3.15 Hình 3.15: Kết phối trộn 104 5x104 copy plasmid IC với 10, 25, 50 102 copy plasmid HBV M: Marker DNA 100 bp; (-): Đối chứng âm khơng có khn Kết trộn 5x104 copy pIC cho phép phát HBV nồng độ 25 copy Tuy nhiên, trộn 104 copy pIC có giới hạn phát 10 copy pHBV Chúng tin real-time PCR có giới hạn phát cao nên lựa chọn 104 copy plasmid IC để phối trộn thí nghiệm 41 3.4.4 Tối ưu điều kiện phản ứng real-time PCR Sử dụng điều kiện PCR tối ưu, thực real-time PCR có bổ sung thêm đầu dị Taqman nồng độ 0.1 µM, 0.4 µM 0.8 µM với khn dải nồng độ từ 103 đến 107 copy pHBV Giá trị Ct mẫu trình bày Bảng 3.1 Bảng 3.1: Giá trị Ct plasmid HBV sử dụng nồng độ Taqman khác Nồng độ HBV 0.1 µM Taqman 0.4 µM Taqman 0.8 µM Taqman 107 16.60 15.86 16.05 106 20.86 20.39 20.12 105 23.77 23.61 23.14 104 27.44 27.40 26.67 103 30.28 29.61 29.96 Quan sát giá trị Bảng 3.1 cho thấy tăng nồng độ Taqman giá trị Ct mẫu có giảm ít, khơng gây ảnh hưởng đến kết real-time PCR Do đó, chúng tơi chọn nồng độ Taqman 0.1 µM cho thí nghiệm 3.5 Xây dựng đường chuẩn định lượng HBV xác định giới hạn phát HBV real-time PCR Để xây dựng đường chuẩn định lượng HBV, tiến hành real- time PCR khảo sát dải nồng độ pHBV từ copy đến 108 copy phối trộn với 104 copy pIC Lựa chọn nồng độ pHBV: 108 , 104, 102, 25, 10 copy cho real-time PCR, thu kết thể Hình 3.16 Bảng 3.2 42 Hình 3.16: Đường chuẩn HBV với nồng độ plasmid HBV 108, 104, 102, 25, 10 copy Hình ảnh trích xuất từ kết phân tích phần mềm 7500 v2.3 Bảng 3.2: Giá trị Ct plasmid HBV plasmid IC nồng độ khảo sát Nồng độ HBV trộn IC 104 Ct HBV Ct IC 108 12.60 30.35 104 26.14 28.51 102 32.56 28.94 25 34.40 28.89 10 35.61 28.85 36.72 28.94 Từ kết giá trị Ct Bảng 3.2 cho thấy Ct 104 copy pIC phối trộn với nồng độ pHBV khác có giá trị tương đương Sự tương đồng Ct pIC chứng tỏ cạnh tranh pIC pHBV phản ứng xảy nồng độ khảo sát giống Kết đường chuẩn HBV (Hình 3.16) có hệ số tương quan R2 = hiệu suất phản ứng 101.3%, số nằm khoảng cho phép Như vậy, tất nồng độ pHBV khảo sát cho kết tốt nên tiếp tục mở rộng khoảng phát với cận tăng lên 109 copy cận giảm xuống copy pHBV Đồng thời chúng tơi pha lỗng 100, copy pHBV bảo quản 4oC tháng Giá trị Ct nồng độ pHBV thể Bảng 3.3 Bảng 3.3: Giá trị Ct plasmid HBV plasmid IC từ hai điều kiện bảo quản khác Set plasmid HBV Nồng độ HBV trộn IC 104 Ct HBV Set tách triết 109 10.29 32.14 100 33.00 29.30 003 35.88 29.42 100 32.72 29.27 005 37.05 28.66 003 37.90 29.35 Set bảo quản 4oC tháng 43 Ct IC Đặt giả thiết chất lượng plasmid set bảo quản 4oC tháng tương đương với set tách chiết, nồng độ hai set thay cho nhau, nồng độ giống hai set coi mẫu lặp lại, chúng tơi tiến hành dựng đường chuẩn Hình 3.17 Hình 3.17: Đường chuẩn HBV xây dựng từ hai set plasmid Điểm màu xanh: mẫu set tách chiết; điểm màu đỏ: mẫu set bảo 4oC tháng Đường chuẩn HBV tạo thành từ hai set plasmid tách chiết bảo quản 4oC tháng có thơng số mức cho phép Điều cho thấy chất lượng plasmid bảo quản 4oC tháng ổn định sau thời gian sử dụng bảo quản Đồng thời với nồng độ copy chuẩn bị từ set pHBV khác lên lên tín hiệu cho thấy độ giới hạn phát copy hoàn toàn đáng tin cậy Theo Bảng 3.3, giá trị Ct pIC nồng độ 3, 5, 100 copy pHBV tương đương Tuy nhiên nồng độ pHBV 109 có tăng đột biến giá trị Ct pIC nồng độ khuôn pHBV lớn gây ức chế trình khuếch đại IC làm tín hiệu xuất chậm Sự ổn định giá trị Ct IC nồng độ pHBV phối trộn sở quan trọng để đánh giá trình tách chiết DNA trình khuếch đại sản phẩm Với mẫu pHBV nồng độ cao gây ức chế q trình khuếch đại IC, khơng thể đánh giá có hay khơng mát q trình tách chiết Do chúng tơi đến kết luận, sinh phẩm cho giới hạn phát pHBV từ copy đến 108 copy, 44 phối trộn 104 copy pIC Với mẫu HBV có nồng độ lớn 108 copy, chúng tơi tiến hành pha loãng tiến hành kiểm tra lại Từ kết thu được, sử dụng sinh phẩm tiến hành kiểm tra mẫu bệnh nhân (do Trung tâm Y tế dự phòng Quảng Ninh cung cấp) thu kết Hình 3.18, Hình 3.19 Bảng 3.4 Hình 3.18: Đường tín hiệu khuếch đại phản ứng định lượng bốn mẫu bệnh phẩm Hình 3.19: Đường chuẩn định lượng bốn mẫu bệnh phẩm Điểm màu đỏ: mẫu chuẩn pHBV; điểm màu lam: mẫu bệnh phẩm 45 Bảng 3.4: Giá trị Ct plasmid HBV mẫu bệnh phẩm Mẫu Ct trung bình Ct Mẫu 30.46 Mẫu (lặp lại) 30.53 Mẫu 25.71 Mẫu (lặp lại) 25.65 Mẫu 21.97 Mẫu (lặp lại) 22.06 Mẫu 19.79 Mẫu (lặp lại) 19.83 108 copy pHBV 106 copy pHBV Nồng độ trung bình (copy/µl) 30.49 657 25.68 19210 22.02 251161 19.81 1183212 13.27 13.27 100000000 20.20 20.20 1000000 10 copy pHBV 26.94 26.94 10000 102 copy pHBV 32.91 32.91 100 Đối chứng âm không xác định Các đường cong tín hiệu khuếch đại (Hình 3.18) mẫu bệnh mẫu chuẩn pHBV lên cao bắt đầu có khuếch đại ngang vào ngưỡng bão hòa, cho thấy phản ứng khuếch đại mẫu chuẩn mẫu bệnh tốt, ức chế phản ứng Đường chuẩn (Hình 3.19) xây dựng từ nồng độ 102 - 108 copy pHBV có thơng số mức cho phép nên giá trị Ct thu đáng tin cậy Mặt khác, mẫu bệnh nằm giới hạn khảo sát mẫu chuẩn mẫu bệnh cần định lượng lặp lại lần có giá trị Ct tương đương cho thấy giá trị định lượng thu xác Nồng độ mẫu định lượng thành công 657, 19210, 251161 119312 copy nằm giới hạn phát từ copy đến 108 Điều khẳng định thành công bước đầu sinh phẩm 46 KẾT LUẬN Từ kết thu đưa kết luận sau đây: - Thiết kế thành công cặp mồi, đầu dị tối ưu hóa điều kiện phản ứng PCR real-time PCR cho giới hạn phát HBV nồng độ copy - Thiết kế thành cơng IC khuếch đại cặp mồi khuếch đại gen P HBV, giúp kiểm soát bước trình xét nghiệm KIẾN NGHỊ Hướng nghiên cứu là: - Kiểm tra khả phản ứng chéo cặp mồi đầu dò với mẫu âm tính với HBV dương tính với loại virus khác HIV, EpsteinBarr, virus viêm gan A, viêm gan C… - Tiến hành kiểm tra mẫu bệnh nhân khác nồng độ HBV khác Đồng thời so sánh tương quan kết định lượng thu với kết định lượng kit thương mại 47 TÀI LIỆU THAM KHẢO Abe A., Inoue K., Tanaka T., Kato J., Kajiyama N., Kawaguchi R., Tanaka S., Yoshiba M., Kohara M (1999), "Quantitation of hepatitis B virus genomic DNA by real-time detection PCR" Journal of Clinical Microbiology, 37(9), p 2899-2903 Aliyu S H., Aliyu M H., Salihu H M., Parmar S., Jalal H., Curran M D (2004), "Rapid detection and quantitation of hepatitis B virus DNA by real-time PCR using a new fluorescent (FRET) detection system" Journal of clinical virology, 30(2), p 191-195 Arya M., Shergill I S., Williamson M., Gommersall L., Arya N., Patel H R (2005), "Basic principles of real-time quantitative PCR" Expert review of molecular diagnostics, 5(2), p 209-219 Bartenschlager R., Junker-Niepmann M., Schaller H (1990), "The P gene product of hepatitis B virus is required as a structural component for genomic RNA encapsidation" Journal of virology, 64(11), p 5324-5332 Bluth M J., Bluth M H (2013), "Molecular pathology techniques" Clinics in laboratory medicine, 33(4), p 753-772 Bustin S A (2000), "Absolute quantification of mRNA using real-time reverse transcription polymerase chain reaction assays" Journal of molecular endocrinology, 25(2), p 169-193 Cao Y., Ho D D., Todd J., Kokka R., Urdea M., Lifson J D., Piatak Jr M., Chen S., Hahn B H., Saag M S (1995), "Clinical evaluation of branched DNA signal amplification for quantifying HIV type in human plasma" AIDS research and human retroviruses, 11(3), p 353-361 Cardullo R A., Agrawal S., Flores C., Zamecnik P C., Wolf D E (1988), "Detection of nucleic acid hybridization by nonradiative fluorescence 48 resonance energy transfer" Proceedings of the National Academy of Sciences, 85(23), p 8790-8794 Chen R W., Piiparinen H., Seppänen M., Koskela P., Sarna S., Lappalainen M (2001), "Real‐ time PCR for detection and quantitation of hepatitis B virus DNA" Journal of medical virology, 65(2), p 250-256 10 Chu C J., Lok A S (2002), "Clinical significance of hepatitis B virus genotypes" Hepatology, 35(5), p 1274-1276 11 Collins M L., Irvine B., Tyner D., Fine E., Zayati C., Chang C.-a., Horn T., Ahle D., Detmer J., Shen L.-P (1997), "A branched DNA signal amplification assay for quantification of nucleic acid targets below 100 molecules/ml" Nucleic acids research, 25(15), p 2979-2984 12 Cooksley W (2010), "Do we need to determine viral genotype in treating chronic hepatitis B?" Journal of viral hepatitis, 17(9), p 601-610 13 Doo E C., Ghany M G (2010), "Hepatitis B virology for clinicians" Clinics in liver disease, 14(3), p 397-408 14 Durand R., Eslahpazire J., Jafari S., Delabre J.-F., Marmorat-Khuong A., di Piazza J.-P., Le Bras J (2000), "Use of molecular beacons to detect an antifolate resistance-associated mutation in Plasmodium falciparum" Antimicrobial agents and chemotherapy, 44(12), p 3461-3464 15 Ezzikouri S., Ozawa M., Kohara M., Elmdaghri N., Benjelloun S., Tsukiyama‐ Kohara K (2014), "Recent insights into hepatitis B virus– host interactions" Journal of medical virology, 86(6), p 925-932 16 Fortin N Y., Mulchandani A., Chen W (2001), "Use of real-time polymerase chain reaction and molecular beacons for the detection of Escherichia coli O157: H7" Analytical biochemistry, 289(2), p 281-288 49 17 Ganem D.,Prince A M (2004), "Hepatitis B virus infection—natural history and clinical consequences" New England Journal of Medicine, 350(11), p 1118-1129 18 Gavilanes F., Gonzalez-Ros J M., Peterson D L (1982), "Structure of hepatitis B surface antigen Characterization of the lipid components and their association with the viral proteins" Journal of biological chemistry, 257(13), p 7770-7777 19 Gerlich W H (2013), "Medical virology of hepatitis B: how it began and where we are now" Virology journal, 10(1), p 239 20 Gibson U., Heid C A., Williams P M (1996), "A novel method for real time quantitative RT-PCR" Genome research, 6(10), p 995-1001 21 Ginzinger D G (2002), "Gene quantification using real-time quantitative PCR: an emerging technology hits the mainstream" Experimental hematology, 30(6), p 503-512 22 Giulietti A., Overbergh L., Valckx D., Decallonne B., Bouillon R., Mathieu C (2001), "An overview of real-time quantitative PCR: applications to quantify cytokine gene expression" Methods, 25(4), p 386-401 23 Glebe D (2007), "Recent advances in hepatitis B virus research: a German point of view" World journal of gastroenterology, 13(1), p 24 Heid C A., Stevens J., Livak K J., Williams P M (1996), "Real time quantitative PCR" Genome research, 6(10), p 986-994 25 Higuchi R., Dollinger G., Walsh P S., Griffith R (1992), "Simultaneous amplification and detection of specific DNA sequences" Nature Biotechnology, 10(4), p 413-417 26 Higuchi R., Fockler C., Dollinger G., Watson R (1993), "Kinetic PCR analysis: real-time monitoring of DNA amplification reactions" Nature Biotechnology, 11(9), p 1026-1030 50 27 Hou Y., Zhang H., Miranda L., Lin S (2010), "Serious overestimation in quantitative PCR by circular (supercoiled) plasmid standard: microalgal pcna as the model gene" PLoS One, 5(3), p e9545 28 Huang C C., Kuo T M., Yeh C T., Hu C., Chen Y L., Tsai Y L., Chen M L., Chou Y C., Chang C (2013), "One single nucleotide difference alters the differential expression of spliced RNAs between HBV genotypes A and D" Virus research, 174(1), p 18-26 29 İnan N., Tabak F (2015), "Hepatitis B virus: Biology and life cycle" 30 Jonas M M., Block J M., Haber B A., Karpen S J., London W T., Murray K F., Narkewicz M R., Rosenthal P., Schwarz K B., McMahon B J (2010), "Treatment of children with chronic hepatitis B virus infection in the United States: patient selection and therapeutic options" Hepatology, 52(6), p 2192-2205 31 Kann M., Schmitz A., Rabe B (2007), "Intracellular transport of hepatitis B virus" World journal of gastroenterology, 13(1), p 39 32 Kao J.-H., Chen D.-S (2008), "Critical analysis of the immune tolerance phase of chronic HBV infection: natural history and diagnosis" Current Hepatitis Reports, 7(1), p 5-11 33 Kern D., Collins M., Fultz T., Detmer J., Hamren S., Peterkin J J., Sheridan P., Urdea M., White R., Yeghiazarian T (1996), "An enhancedsensitivity branched-DNA assay for quantification of human immunodeficiency virus type RNA in plasma" Journal of clinical microbiology, 34(12), p 3196-3202 34 Konnick E Q., Erali M., Ashwood E R., Hillyard D R (2005), "Evaluation of the COBAS amplicor HBV monitor assay and comparison with the ultrasensitive HBV hybrid capture assay for quantification of hepatitis B virus DNA" Journal of clinical microbiology, 43(2), p 596-603 51 35 Kramvis A., Kew M., Franỗois G (2005), "Hepatitis B virus genotypes" Vaccine, 23(19), p 2409-2423 36 Liang T J (2009), "Hepatitis B: the virus and disease" Hepatology, 49(5 Suppl), p S13-21 37 European Association For The Study Of The Liver (2012), "EASL clinical practice guidelines: Management of chronic hepatitis B virus infection", Journal of hepatology p 167-185 38 Loeb K R., Jerome K R., Goddard J., Huang M l., Cent A., Corey L (2000), "High‐ Throughput Quantitative Analysis of Hepatitis B Virus DNA in Serum Using the TaqMan Fluorogenic Detection System" Hepatology, 32(3), p 626-629 39 Mahoney F J (1999), "Update on diagnosis, management, and prevention of hepatitis B virus infection" Clinical microbiology reviews, 12(2), p 351366 40 Meuer S., Wittwer C., Nakagawara K.-I., Rapid cycle real-time PCR: methods and applications 2012: Springer Science & Business Media 41 Morrison T B., Weis J J., Wittwer C T (1998), "Quantification of low-copy transcripts by continuous SYBR Green I monitoring during amplification" Biotechniques, 24(6), p 954-8, 960, 962 42 Moura I F., Lopes E P., Alvarado-Mora M V., Pinho J R., Carrilho F J (2013), "Phylogenetic analysis and subgenotypic distribution of the hepatitis B virus in Recife, Brazil" Infection, Genetics and Evolution, 14, p 195-199 43 Nassal M (2008), "Hepatitis B viruses: reverse transcription a different way" Virus research, 134(1), p 235-249 44 Neuveut C., Wei Y., Buendia M A (2010), "Mechanisms of HBV-related hepatocarcinogenesis" Journal of hepatology, 52(4), p 594-604 52 45 Ott J., Stevens G., Groeger J., Wiersma S (2012), "Global epidemiology of hepatitis B virus infection: new estimates of age-specific HBsAg seroprevalence and endemicity" Vaccine, 30(12), p 2212-2219 46 Pas S D., Fries E., Robert A., Osterhaus A D., Niesters H G (2000), "Development of a quantitative real-time detection assay for hepatitis B virus DNA and comparison with two commercial assays" Journal of clinical microbiology, 38(8), p 2897-2901 47 Ronsin C., Pillet A., Bali C., Denoyel G A (2006), "Evaluation of the COBAS AmpliPrep-total nucleic acid isolation-COBAS TaqMan hepatitis B virus (HBV) quantitative test and comparison to the VERSANT HBV DNA 3.0 assay" Journal of clinical microbiology, 44(4), p 1390-1399 48 Schadler S., Hildt E (2009), "HBV life cycle: entry and morphogenesis" Viruses, 1(2), p 185-209 49 Smit M L., Giesendorf B A., Vet J A., Trijbels F J., Blom H J (2001), "Semiautomated DNA mutation analysis using a robotic workstation and molecular beacons" Clinical chemistry, 47(4), p 739-744 50 Stryer L (1978), "Fluorescence energy transfer as a spectroscopic ruler" Annual review of biochemistry, 47(1), p 819-846 51 Sum S S M., Wong D K H., Yuen M F., Yuan H J., Yu J., Lai C L., Ho D., Zhang L (2004), "Real-time PCR assay using molecular beacon for quantitation of hepatitis B virus DNA" Journal of clinical microbiology, 42(8), p 3438-3440 52 Sunbul M (2014), "Hepatitis B virus genotypes: global distribution and clinical importance" World J Gastroenterol, 20(18), p 5427-34 53 Tyagi S., Kramer F R (1996), "Molecular beacons: probes that fluoresce upon hybridization" Nature biotechnology, 14(3), p 303-308 53 54 Urban S., Schulze A., Dandri M., Petersen J (2010), "The replication cycle of hepatitis B virus" Journal of hepatology, 52(2), p 282-284 55 Vivekanandan P., Singh O V (2010), "Molecular methods in the diagnosis and management of chronic hepatitis B" Expert review of molecular diagnostics, 10(7), p 921-935 56 Wang Y F W (2006), “Signal amplification techniques: bDNA, hybrid capture” Advanced Techniques in Diagnostic Microbiology, p 228-242 57 WHO (2001), "Introduction of hepatitis B vaccine into childhood immunization services" 58 WHO (2017), "Hepatitis B" 59 Wittwer C T., Herrmann M G., Moss A A., Rasmussen R P (1997), "Continuous fluorescence monitoring of rapid cycle DNA amplification" Biotechniques, 22(1), p 130-139 60 Yao J D., Beld M G., Oon L L E., Sherlock C H., Germer J., Menting S., Thoe S Y S., Merrick L., Ziermann R., Surtihadi J (2004), "Multicenter evaluation of the VERSANT hepatitis B virus DNA 3.0 assay" Journal of clinical microbiology, 42(2), p 800-806 61 Zanella I., Rossini A., Domenighini D., Albertini A., Cariani E (2002), "Quantitative analysis of hepatitis B virus DNA by real-time amplification" European journal of clinical microbiology & infectious diseases, 21(1), p 22-26 62 Zentilin L., Giacca M (2007), "Competitive PCR for precise nucleic acid quantification" Nature protocols, 2(9), p 2092 54 ... Nguyễn Quang Duy XÂY DỰNG B? ?? KIT ĐỊNH LƯỢNG PCR HBV (QPCR) ĐỂ PHÁT HIỆN VIRUS VIÊM GAN B (HBV) Chuyên ngành Sinh học Thực nghiệm Mã số: 60420114 LUẬN VĂN THẠC SỸ KHOA HỌC CÁN B? ?? HƯỚNG DẪN KHOA... kĩ thuật, tiến hành đề tài: ? ?Xây dựng kit định lượng PCR HBV (qPCR) để phát virus viêm gan B? ?? với mục đích xây dựng kit với giá thành tốt chất lượng tương đương kit thương mại ngoại nhập 21 CHƯƠNG... dựng kit định lượng PCR HBV (qPCR) để phát virus viêm gan B? ?? với giá thành phù hợp đảm b? ??o tính xác xét nghiệm CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu Hepatitis B Virus 1.1.1 Cấu trúc HBV 1.1.1.1