Báo cáo thí nghiệm kỹ thuật nuôi cấy mô và tế bào thực vật BÀI 1. PHÒNG THÍ NGHIỆM NUÔI CẤY MÔ – TẾ BÀO THỰC VẬT BÀI 2. NUÔI CẤY MÔ SẸO HOA CÚC BÀI 3. NUÔI CẤY HẠT PHẤN HOA LILY BÀI 4. NUÔI CẤY TẾ BÀO LỚP MỎNG LAN DENDROBIUM. BÀI 5. NUÔI CẤY ĐỈNH SINH TRƯỞNG CÂY DỨA
TỔNG LIÊN ĐOÀN LAO ĐỘNG VIỆT NAM TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÔN ĐỨC THẮNG KHOA KHOA HỌC ỨNG DỤNG BÁO CÁO THÍ NGHIỆM KỸ THUẬT NI CẤY MƠ VÀ TẾ BÀO THỰC VẬT MÃ MƠN: 607040 Giảng viên hướng dẫn: ĐỒN THIÊN THANH Sinh viên thực hiện: NHÓM S4 – N2 Phạm Thị Hoài Thương – 61900567 Huỳnh Thị Mỹ Tiên - 61900577 Trần Thanh Trà My - 61900455 Trương Hoàng Minh Thư – 61703209 THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH, NĂM 2022 ii MỤC LỤC MỤC LỤC……………………………………………………………………… ii DANH MỤC BẢNG…………………………………….……………………….iii DANH MỤC HÌNH ẢNH……………………………………………………….iv BÀI PHỊNG THÍ NGHIỆM NI CẤY MƠ – TẾ BÀO THỰC VẬT I TÍNH TOÁN 1.1 Pha môi trường MS 1.2 Pha vitamin 1.3 Pha chất điều hịa sinh trường bổ sung vào mơi trường MS 1.4 Pha môi trường MS từ dung dịch stock Skoog I, II, III; vitamin; chất điều hòa sinh trưởng II TIẾN HÀNH THÍ NGHIỆM III KẾT QUẢ .14 BÀI NUÔI CẤY MÔ SẸO HOA CÚC 15 I QUY TRÌNH NI CẤY MƠ SẸO HOA CÚC 15 1.1 Quy trình nuôi cấy mô sẹo hoa cúc 15 1.1.1 Sơ đồ quy trình nuôi cấy mô sẹo hoa cúc .15 II KẾT QUẢ - BIỆN LUẬN 20 2.1 Từ ngày 16/11/2022 đến ngày 23/11/2022 20 2.2 Từ ngày 23/11/2022 đến ngày 30/12/2022 20 BÀI NUÔI CẤY HẠT PHẤN HOA LILY 22 I LÝ THUYẾT .22 1.1 Sơ đồ quy trình ni cấy hạt phấn hoa Lily 23 1.2 Các bước thực .23 II KẾT QUẢ - BIỆN LUẬN 27 iii BÀI NUÔI CẤY TẾ BÀO LỚP MỎNG LAN DENDROBIUM .29 I LÝ THUYẾT .29 II QUY TRÌNH NI CẤY TẾ BÀO LỚP MỎNG LAN DENDROBIUM .30 2.1 Sơ đồ quy trình ni cấy tế bào lớp mỏng lan dendrobium 30 2.2 Các bước thực 30 III KẾT QUẢ .34 BÀI NUÔI CẤY ĐỈNH SINH TRƯỞNG CÂY DỨA 36 I GIỚI THIỆU 36 II CÁCH TIẾN HÀNH 37 2.1 Quy trình ni cấy đỉnh sinh trưởng dứa 37 2.2 Các bước thực 37 III KẾT QUẢ .40 iv DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Thành phần môi trường Skoog I Bảng 1.2 Thành phần môi trường Skoog II Bảng 1.3 Thành phần môi trường Skoog III Bảng 1.4 Thành phần vitamins Morel (Morel's Vitamin) sử dụng môi trường MS Bảng 1.5 Chất điều hòa sinh trường bổ sung vào môi trường MS .5 Bảng 1.6 Thành phần môi trường MS với nồng độ 1X 1400 ml Bảng 2.1 Các bước thực thí nghiệm 16 Bảng 3.1 Ưu điểm nhược điểm phương pháp nuôi cấy hạt phấn 22 Bảng 3.2 Các bước thực thí nghiệm 23 Bảng 4.1 Các bước thực thí nghiệm 30 Bảng 5.1 Các bước thực thí nghiệm 37 v DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 1.1 Các hóa chất dùng để pha vitamin Hình 1.2 Mesoinositol 10 Hình 1.3 Pirydoxine (B6) 10 Hình 1.4 Nicotinic acid (P.P) 11 Hình 1.5 Thiamin HCl (B1) 11 Hình 1.6 Pantotate Calci .12 Hình 1.7 Chất điều hòa sinh trưởng BAP 12 Hình 1.8 Chất điều hịa sinh trưởng NAA 13 Hình 1.9 Chỉnh pH 5,7 - 5,8 13 Hình 2.1 Sơ đồ quy trình ni cấy mơ sẹo hóa cúc 15 Hình 2.2 Hoa cúc 16 Hình 2.3 Các mẫu sau rửa với nước 16 Hình 2.4 Các mẫu ngâm cồn 70% 16 Hình 2.5 Bộ dụng cụ cấy hấp khử trùng .17 Hình 2.6 Khử trùng bề mặt tủ cấy bật đèn UV 18 Hình 2.7 Mẫu nuôi cấy kiểm tra vào ngày 7/12/22 .21 Hình 3.1 Sơ đồ quy trình nuôi cấy hạt phấn hoa Lily 23 Hình 3.2 Nụ hoa Lily .23 Hình 3.3 Khử trùng mẫu ethanol 70% 24 Hình 3.4 Khử trùng mẫu NaOCl 20% .24 Hình 3.5 Khử trùng bề mặt tủ cấy bật tia UV .25 Hình 3.6 Bộ dụng cụ hấp khử trùng 25 Hình 3.7 Thao tác nuôi cấy tủ vô trùng 26 Hình 3.8 Hạt phấn sau cấy 27 Hình 3.9 Hạt phấn kiểm tra vào ngày 7/12/22 28 Hình 4.1 Sơ đồ quy trình ni cấy tế bào lớp mỏng lan dendrobium 30 Hình 4.2 Lan in vitro 30 Hình 4.3 Khử trùng bề mặt đèn UV 31 vi Hình 4.4 Chuẩn bị tủ cấy dụng cụ cấy 31 Hình 4.5 Cắt mẫu 32 Hình 4.6 Cấy mẫu vào mơi trường 32 Hình 4.7 Mẫu lan vừa cấy vào mơi trường 34 Hình 4.8 Mẫu lan nuôi tối sau tuần 34 Hình 5.1 Cấu tạo mô phân sinh đỉnh 36 Hình 5.2 Sơ đồ quy cấy đỉnh sinh trưởng trình ni dứa .37 Hình 5.3 Mẫu dứa 37 Hình 5.4 Tách bớt 38 Hình 5.5 Quan sát kính hiển vi 38 Hình 5.6 Đặt mẫu lên đĩa petri 39 Hình 5.7 Dùng dao tách đỉnh sinh trưởng 39 Hình 5.8 Quan sát đỉnh sinh trưởng 39 Hình 5.9 Đỉnh sinh trưởng dứa 40 BÀI PHỊNG THÍ NGHIỆM NUÔI CẤY MÔ – TẾ BÀO THỰC VẬT I TÍNH TỐN 1.1 Pha mơi trường MS Bảng 1.1 Thành phần môi trường Skoog I Thành phần Hàm lượng 1X Hàm lượng 10X NH4NO3 1650 mg/L 16500 mg/L KNO3 1900 mg/L 19000 mg/L KH2PO4 170 mg/L 1700 mg/L MgSO4.7H2O 370 mg/L 3700 mg/L CaCl2.2H2O 440 mg/L 4400 mg/L Cách tính tốn: Khối lượng NH4NO3 mơi trường Skoog I 10X – L: 𝑚𝑁𝐻4𝑁𝑂3 = 1650 × 10 × = 16500 (𝑚𝑔) Khối lượng KNO3 môi trường Skoog I 10X – L: 𝑚𝐾𝑁𝑂3 = 1900 × 10 × = 19000 (𝑚𝑔) Khối lượng KH2PO4 môi trường Skoog I 10X – L: 𝑚𝐾𝐻2𝑃𝑂4 = 170 × 10 × = 1700 (𝑚𝑔) Khối lượng MgSO4.7H2O môi trường Skoog I 10X – L: 𝑚𝑀𝑔𝑆𝑂4 7𝐻2 𝑂 = 370 × 10 × = 3700 (𝑚𝑔) Khối lượng CaCl2.2H2O môi trường Skoog I 10X – L: 𝑚𝐶𝑎𝐶𝑙2 2𝐻2𝑂 = 440 × 10 × = 4400 (𝑚𝑔) Bảng 1.2 Thành phần môi trường Skoog II Hàm lượng Hàm lượng 1X Thành phần 200X – 200 mL FeSO4.7H2O 27,8 mg/L 1112 g Na2EDTA 37,3 mg/L 1429 g Cách tính tốn: Khối lượng FeSO4.7H2O môi trường Skoog II 200X – 200 mL: 𝑚𝐹𝑒𝑆𝑂4 7𝐻2 𝑂 = 27,8 × 200 × 0,2 = 1112 (𝑚𝑔) Khối lượng Na2EDTA môi trường Skoog II 200X – 200 mL: 𝑚𝑁𝑎2𝐸𝐷𝑇𝐴 = 37,3 × 200 × 0,2 = 1429 (𝑚𝑔) Bảng 1.3 Thành phần môi trường Skoog III Thành phần Hàm lượng Hàm lượng 1000X – 100 mL 200X – 200 mL Hàm lượng 1X KI 0,83 mg/L 83 mg 33.2 mg Na2MoO4.2H2O 0,25 mg/L 25 mg 10 mg CuSO4.5H2O 0,025 mg/L 2,5 mg mg CoC12.6H2O 0,025 mg/L 2,5 mg mg MnSO4.4H2O 22,3 mg/L 2230 mg 892 mg H3BO3 6,2 mg/L 620 mg 248 mg ZnSO4.7H2O 8,6 mg/L 860 mg 334 mg Cách tính toán: Nồng độ Skoog III 1000X – 100 mL: Khối lượng KI môi trường Skoog III 1000X – 100 mL: 𝑚𝐾𝐼 = 0,83 × 1000 × 0,1 = 83 (𝑚𝑔) Khối lượng Na2MoO4.2H2O môi trường Skoog III 1000X – 100 mL: 𝑚𝑁𝑎2𝑀𝑜𝑂4 2𝐻2 𝑂 = 0,25 × 1000 × 0,1 = 25 (𝑚𝑔) Khối lượng CuSO4.5H2O môi trường Skoog III 1000X – 100 mL: 𝑚𝐶𝑢𝑆𝑂4 2𝐻2 𝑂 = 0,025 × 1000 × 0,1 = 2,5 (𝑚𝑔) Khối lượng CoC12.6H2O môi trường Skoog III 1000X – 100 mL: 𝑚𝐶𝑜𝐶12 6𝐻2 𝑂 = 0,025 × 1000 × 0,1 = 2,5 (𝑚𝑔) Khối lượng MnSO4.4H2O môi trường Skoog III 1000X – 100 mL: 𝑚𝑀𝑛𝑆𝑂4 4𝐻2 𝑂 = 22,3 × 1000 × 0,1 = 2230 (𝑚𝑔) Khối lượng H3BO3 môi trường Skoog III 1000X – 100 mL: 𝑚𝐻3𝐵𝑂3 = 6,2 × 1000 × 0,1 = 620 (𝑚𝑔) Khối lượng ZnSO4.7H2O môi trường Skoog III 1000X – 100 mL: 𝑚𝑍𝑛𝑆𝑂4 7𝐻2 𝑂 = 8,6 × 1000 × 0,1 = 860 (𝑚𝑔) Nồng độ Skoog III 200X – 200 mL: Khối lượng KI môi trường Skoog III 200X – 200 mL: 𝑚𝐾𝐼 = 0,83 × 200 × 0,2 = 33,2 (𝑚𝑔) Khối lượng Na2MoO4.2H2O môi trường Skoog III 200X – 200 mL: 𝑚𝑁𝑎2𝑀𝑜𝑂4 2𝐻2 𝑂 = 0,25 × 200 × 0,2 = 10 (𝑚𝑔) Khối lượng CuSO4.5H2O môi trường Skoog III 200X – 200 mL: 𝑚𝐶𝑢𝑆𝑂4 2𝐻2 𝑂 = 0,025 × 200 × 0,2 = (𝑚𝑔) Khối lượng CoC12.6H2O môi trường Skoog III 200X – 200 mL: 𝑚𝐶𝑜𝐶12 6𝐻2 𝑂 = 0,025 × 200 × 0,2 = (𝑚𝑔) Khối lượng MnSO4.4H2O môi trường Skoog III 200X – 200 mL: 𝑚𝑀𝑛𝑆𝑂4 4𝐻2 𝑂 = 22,3 × 200 × 0,2 = 892 (𝑚𝑔) Khối lượng H3BO3 môi trường Skoog III 200X – 200 mL: 𝑚𝐻3𝐵𝑂3 = 6,2 × 200 × 0,2 = 248 (𝑚𝑔) Khối lượng ZnSO4.7H2O môi trường Skoog III 200X – 200 mL: 𝑚𝑍𝑛𝑆𝑂4 7𝐻2 𝑂 = 8,6 × 200 × 0,2 = 334 (𝑚𝑔) Lưu ý: Đối với SKOOG III tính khối lượng q nhỏ nên cần pha dung dịch stock lớn (1000X – 100mL) dùng pipet hút theo nồng độ cần yêu cầu (200X – 200 mL) 1.2 Pha vitamin Bảng 1.4 Thành phần vitamins Morel (Morel's Vitamin) sử dụng môi trường MS Pirydoxine Nicotinic Thiamin Pantotate acid (P.P) HCl (B1) Calci 100 mg/L mg/L mg/L mg/L 10000 mg 100 mg 100 mg 100 mg Biotin (H) Mesoinositol mg/L 0,01mg/L 100 mg mg (B6) 26 cấy Nuôi cấy mẫu ‒ Tất thao tác phải thực lửa đèn cồn ‒ Dùng kẹp dao mổ cắt nụ hoa tách nhị hoa khỏi nụ ‒ Loại bỏ day tóc từ bao phẩn ‒ Chuyển bao phấn lên môi trường dinh dưỡng MS Quan sát phát triển ‒ Ủ mẫu - tuần mẫu 25°C bóng tối ‒ Sau chuyển đơn bội môi trường 24 - 28°C, 12 - 18h chiếu sáng - 12h tối Hình 3.7 Thao tác nuôi cấy tủ vô trùng 27 II KẾT QUẢ - BIỆN LUẬN Hình 3.8 Hạt phấn sau cấy - Sau tuần chưa có dấu hiệu xuất callus tất không nhiễm nấm mốc Tuy nhiên, số môi trường chuyển sang màu nâu cánh gián, hóa chất sử dụng để pha môi trường bị hỏng - Tỷ lệ mẫu nhiễm: 2/12 - Ta tiếp tục nuôi cấy tối nhiệt độ 25 ℃ 28 Hình 3.9 Hạt phấn kiểm tra vào ngày 7/12/22 - Mẫu khơng có dấu hiệu lên callus kiểm tra vào ngày 7/12/22, môi trường nuôi cấy chuyển sang màu sẫm Có thể chất lượng mơi trường ni cấy ảnh hưởng đến việc tạo callus mẫu phấn hoa lyly 29 BÀI NUÔI CẤY TẾ BÀO LỚP MỎNG LAN DENDROBIUM I LÝ THUYẾT Ưu điểm hệ thống lớp mỏng tế bào • Mẫu cấy tiếp xúc trực tiếp với mơi trường diện tích tiếp xúc mẫu với môi trường lớn nên mẫu dễ dàng hấp thu chất dinh dưỡng từ môi trường • Dễ định vị cho vùng phản ứng có loại lớp mỏng tế bào • Lượng hormone nội sinh mẫu thấp chất điều hòa sinh trưởng thực vật dễ tác động lên mẫu • Hệ thống TCL có hình thành nhiều loại cấu trúc, có cấu trúc • Mẫu ni cấy đồng nhanh chóng đáp ứng phản ứng Từ đó, rút ngắn thời gian nghiên cứu chương trình biệt hóa riêng biệt tùy vào mục tiêu mục đích nghiên cứu • Phơi quan sơ khởi hình thành tần số cao (là số lượng tế bào cảm ứng phát sinh hình thái cao) • Nâng cao suất chuyển gen thực vật, tiềm tái sinh cao mở rộng cho lồi khó tái sinh góp phần cải thiện giống thực vật • Tạo thực vật hồn chỉnh, bị biến đổi • Khơng xảy tương tác quan quan với toàn thể thực vật 30 II QUY TRÌNH NI CẤY TẾ BÀO LỚP MỎNG LAN DENDROBIUM 2.1 Sơ đồ quy trình ni cấy tế bào lớp mỏng lan dendrobium Cắt theo chiều ngang (tTCL) Cấy vào môi trường PLB nhân chồi Chồi in vitro tách bỏ Cắt theo chiều dọc (lTCL) Hình 4.1 Sơ đồ quy trình ni cấy tế bào lớp mỏng lan dendrobium 2.2 Các bước thực Bảng 4.1 Các bước thực thí nghiệm Các bước thực Chuẩn bị mẫu giống lan Dendrobium in vitro Giải thích Hình ảnh minh họa Giống lan Dendrobium in vitro chuẩn bị sẵn, in vitro nên không cần khử trùng mà thực cấy trực tiếp tủ cấy vơ trùng Hình 4.2 Lan in vitro Chuẩn bị trước cấy: - Khử trùng bề mặt tủ Chuẩn bị tủ cấy dụng cụ cấy cấy cồn, sau bật tia UV 45 phút Sau tắt đen UV phải bật quạt thơng gió 31 để từ 10 – 15 phút Lưu ý: Khi bật đèn UV phải lấy trùm lại khơng có người xung quanh - Chuẩn bị khay, kẹp, cán dao, khăn khử trùng vật Hình 4.3 Khử trùng bề mặt đèn UV dụng cần thiết Xịt cồn vào tay vật dụng để khử trùng bề mặt trước cho vào tủ cấy - Gắn lưỡi dao vào cán nhúng vào cồn 90 °, làm tương tự với kẹp Dùng kẹp cho cồn vào khay, hơ kẹp lửa đèn cồn, kẹp bị bắt lửa hơ lửa qua khay dao để khử trùng dùng cụ cấy Hình 4.4 Chuẩn bị tủ cấy dụng cụ cấy 32 Các bước cấy mẫu: - Dùng kẹp gấp mẫu chuẩn bị từ trước khay, mở miệng bình chứa mẫu cần hơ lửa miệng bình để tránh nhiễm - Cắt mẫu: Chồi in vitro tách bỏ cắt thành Hình 4.5 Cắt mẫu lát mỏng theo chiều ngang (tTCL) với Cấy mẫu độ dày khoảng 0,5 – 1,5 mm lát mỏng theo chiều dọc (lTCL) với kích thước khoảng 1,0 x 10 mm • Lát mỏng cấy lên mơi trường MS có bổ sung 0,5 mg/L BAP, 3% đường sucrose, 0,8% agar • Lát mỏng cấy lên mơi trường MS có bổ sung 3,0 mg/L kinetin + 0,3 mg/L NAA, 3% đường Hình 4.6 Cấy mẫu vào mơi trường 33 sucrose, 0,8% agar Quan sát mẫu sau tuần cấy Lưu ý: Khi cấy tránh để kẹp nóng gây tổn thương mẫu Tránh huơ tay qua lại lửa đèn cồn 34 III KẾT QUẢ Hình 4.7 Mẫu lan vừa cấy vào mơi trường Hình 4.8 Mẫu lan ni tối sau tuần 35 - Sau tuần chưa có dấu hiệu xuất callus tất không nhiễm nấm mốc - Tỷ lệ mẫu nhiễm: 1/12 - Ta tiếp tục nuôi cấy tối nhiệt độ 25 ℃ - Các yếu tố gây nhiễm mẫu là: + Thao tác cấy mẫu + Điều kiên vô trùng chưa đảm bảo 36 BÀI NUÔI CẤY ĐỈNH SINH TRƯỞNG CÂY DỨA I GIỚI THIỆU Trong nuôi cấy in vitro, phương thức đơn giản thường hay sử dụng để tái sinh chồi in vitro nuôi cấy đỉnh sinh trưởng Nuôi cấy đỉnh sinh trưởng sử dụng phần mô phân sinh với 3-4 tiền phát khởi lá, tức đỉnh sinh trưởng có kích thước từ 0,1 – 0,15mm tính từ chóp sinh trưởng với mục đích tạo in vitro virus Quá trình sinh trưởng quan diễn theo giai đoạn: - Giai đoạn thứ nhất: thường gọi giai đoạn phôi sinh Trong điểm sinh trưởng (trong mô phân sinh đỉnh) xảy hình thành mầm quan phân chia thành mô riêng biệt - Giai đoạn thứ hai: giai đoạn dài sinh trưởng nhanh chóng, mầm quan đạt đến kích thước tối đa trở nên có hình dạng định - Giai đoạn thứ ba: giai đoạn kết thúc phân hóa tế bào, bắt đầu hoá gỗ thành tế bào, xuất chỗ dầy lên có cấu tạo kết khơng cịn khả tiếp tục sinh trưởng Hình 5.1 Cấu tạo mơ phân sinh đỉnh 37 II CÁCH TIẾN HÀNH 2.1 Quy trình nuôi cấy đỉnh sinh trưởng dứa Khử trùng mẫu Tách đỉnh sinh trưởng Quan sát đỉnh sinh trưởng Hình 5.2 Sơ đồ quy cấy đỉnh sinh trưởng trình nuôi dứa 2.2 Các bước thực Bảng 5.1 Các bước thực thí nghiệm Các bước thực Giải thích Hình ảnh minh họa − Chọn dứa trưởng thành có phẩm chất tốt (khơng bị sâu bệnh, khơng bị dập nát), cắt lấy Chuẩn bị mẫu khử trùng mẫu búp dứa phía − Dùng dao cắt bỏ bớt lá, rửa vòi nước chảy cho bụi bẩn, cho vào cốc thuỷ tinh − Rửa mẫu nước xà phịng lỗng, sau rửa xà phòng nước máy nhiều lần vòi nước chảy mạnh Hình 5.3 Mẫu dứa 38 Hình 5.4 Tách bớt − Đỉnh sinh trưởng tách kính lúp/kính hiển vi soi có độ phóng đại từ 10 đến 40 lần làm vô trùng cách lau cồn thật thân kính bàn để mẫu tách − Dùng dao mổ thật sắc có đầu vát sắc để thao tác tách đỉnh sinh trưởng Tách đỉnh sinh trưởng − Gắp mẫu lên bàn đặt mẫu có sẵn đĩa petri vơ trùng, dùng mũi dao tách bỏ hết ngoài, để lại hai nguyên thủy Tách từ vào trong, trách để lưỡi dao làm tổn thương phần chồi đỉnh − Sau tách bỏ hết ngoài, dùng mũi dao mổ nhọn cắt lấy phần đỉnh sinh trưởng có hai phác thể có kích thước 0,6 – 1,0 mm Giữ nguyên đỉnh sinh Hình 5.5 Quan sát kính hiển vi 39 trưởng mũi dao để chuyển vào mơi trường ni cấy Hình 5.6 Đặt mẫu lên đĩa petri Hình 5.7 Dùng dao tách đỉnh sinh trưởng Quan sát đỉnh sinh Quan sát kết kính hiển vi trưởng Hình 5.8 Quan sát đỉnh sinh trưởng 40 III KẾT QUẢ Hình 5.9 Đỉnh sinh trưởng dứa