Nghiên cứu phát triển công nghệ vector adenovirus để sản xuất vắc xin cho động vật trên mô hình gen kháng VP2 (virus protein 2) phòng bệnh gumboro

1 B KHOA HC VÀ CÔNG NGH CHƯƠNG TRÌNH KH&CN TRỌNG ĐIỂM CẤP NHÀ NƯỚC KC04/06-10 BÁO CÁO TỔNG HỢP KẾT QUẢ KHOA HỌC CÔNG NGHỆ ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ VECTOR ADENOVIRUS ĐỂ SẢN XUẤT VẮC-XIN CHO ĐỘNG VẬT TRÊN MÔ HÌNH GEN KHÁNG NGUYÊN VP2 (VIRUS PROTEIN 2) PHÒNG BỆNH GUMBORO MÃ SỐ: KC04.24/06-10 Cơ quan chủ trì đề tài: Viện Công nghệ sinh học Chủ nhiệm đề tài: PGS.TS. Lê Thanh Hòa 8571 Hà Nội - 2010 ii MỤC LỤC Tr MỤC LỤC i DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT VÀ GIẢI NGHĨA v DANH MỤC CÁC HÌNH CÓ TRONG BÁO CÁO vii DANH MỤC CÁC BẢNG CÓ TRONG BÁO CÁO x Phần thứ nhất ĐẶT VẤN ĐỀ VÀ TÓM TẮT QUÁ TRÌNH THỰC HIỆN 1 Phần thứ hai TỔNG QUAN TÀI LIỆU VỀ CÔNG NGHỆ ADENOVIRUS TÁI TỔ HỢPVÀ SỰ CẦN THIẾT NGHIÊN CỨU CỦA ĐỀ TÀI 7 2.1. Đánh giá về công nghệ adenovirus tái tổ hợp 7 2.1.1. Adenovirus và nghiên cu phát trin làm vector tái t hp hin nay 7 2.1.2. Tình hình nghiên cu công ngh adenovirus tái t hp hin nay 13 2.1.3. ánh giá công ngh thit k adenovirus làm khung vector cho phát trin vacxin tái t hp 15 2.2. Nguyên liệu cơ bản cho công nghệ thiết kế để tạo adenovirus tái tổ hợp làm vacxin 17 2.2.1. Plasmid cha DNA h gen ca adenovirus vector 17 2.2.2. Plasmid con thoi (shuttle plasmid) hay plasmid trung gian 18 2.2.3. H thng t bào vi khun E. coli  ng nhim 19 2.2.4. H thng t bào ng vt tr giúp kin to adenovirus tái t hp 20 2.3. Mô tả công nghệ adenovirus tái tổ hợp mà đề tài nghiên cứu 21 2.3.1. t vn  21 2.3.2. i vi h thng Had5 22 2.3.3. i vi h thng Fad9 25 2.4. Tình hình nghiên cứu vacxin phòng bệnh Gumboro và ý nghĩa của phát triển vacxin thế hệ mới trên nền adenovirus làm vector 25 2.4.1. Gii thiu virus gây bnh Gumboro 25 2.4.2. Vacxin truyn thng phòng bnh Gumboro 28 2.4.3. Vacxin th h mi phòng bnh Gumboro 30 2.4.4. Gen kháng nguyên VP2 ng dng trong chin lc to vacxin th h mi phòng bnh Gumboro 30 2.4.5. Ý ngha ca phát trin vacxin Gumboro th h mi trên nn adenovirus làm vector 32 Phần thứ ba NGUYÊN LIỆU VÀ CÁC PHƯƠNG PHÁP ỨNG DỤNG THỰC HIỆN ĐỀ TÀI 34 3.1. NGUYÊN LIU 34 3.1.1. Nguyên liu gen VP2 34 3.1.2. H thng plasmid adenovirus FAd9 và plasmid trung gian 34 3.1.3. H thng plasmid adenovirus HAd5 và plasmid con thoi 36 3.1.4. H thng t bào vi khun E. coli BJ5183 c bit  gây ng nhim 40 iii 3.1.5. H thng t bào vi khun E. coli thông dng khác  tách dòng 40 3.1.6. Các loi hóa cht, sinh phm, trang thit b và ph tr khác 40 3.1.7. Ging virus tái t hp nguyên gc FAd9-VP2-L và FAd9-VP2- R 41 3.1.8. Virus vacxin sn xut trên môi trng t bào gan phôi gà 42 3.1.9. Các loi hóa cht, sinh phm, dng c nuôi cy t bào thông dng 42 3.2. PHNG PHÁP NGHIÊN CU 43 3.2.1. Phng pháp tip truyn virus Gumboro 43 3.2.2. Phng pháp tách chit và tinh sch RNA h gen ca virus Gumboro 43 3.2.3. Phng pháp RT-PCR và tách dòng  lu gen kháng nguyên VP2 ca Gumboro 43 3.2.4. Phng pháp gii trình t xác nh chui gen hoc kim tra kt qu 44 3.2.5. Phng pháp thit k mi chuyên bit c hiu VP2  thu nhn “hộp gen kháng nguyên VP2“ 45 3.2.6. Phng pháp tách dòng trong E. coli và tách chit DNA plasmid tái t hp 46 3.2.7. Phng pháp thit k và gài “hộp gen kháng nguyên VP2” vào plasmid con thoi 46 3.2.8. Phng pháp lu gi DNA plasmid ca h thng HAd5 trong E. Coli 47 3.2.9. Phng pháp gây ng nhim tái t hp trong vi khun BJ5183 48 3.2.10. Phng pháp chun b DNA ca plasmid adenovirus tái t hp  lây nhim 48 3.2.11. Phng pháp lây nhim (transfection)  to adenovirus tái t hp trong t bào c thù 49 3.2.12. Phng pháp kim tra hot lc và chn lc adenovirus tái t hp 50 3.2.13. Phng pháp nuôi cy t bào gan phôi gà mt lp 54 3.2.14. Phng pháp kim tra sinh hc phân t vi ging và vacxin FAd9-VP2 (L/R) bng phn ng PCR 56 3.2.15. Phng pháp kim tra an toàn, vô trùng, vi ging và vacxin FAd9-VP2 (L/R) và phân b virus  các c quan 57 3.2.16. Phng pháp kim nghim min dch vi kháng th Gumboro bng phn ng trung hòa trên t bào gan phôi gà 58 3.2.17. Phng pháp kim tra min dch ca vacxin bng ELISA 60 Phần thứ tư KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU CÔNG NGHỆ ADENOVIRUS TÁI TỔ HỢP ĐỐI VỚI HỆ THỐNG FAD9 GIA CÂM 63 4.1. TÓM LC KT QU NGHIÊN CU CÔNG NGH ADENOVIRUS FAD9 GIA CM 63 4.2. KT QU THU NHN VÀ CHUN B NGUN GEN VP2 65 4.2.1. Kt qu tip truyn ging virus Gumboro  cung cp ngun gen VP2 65 4.2.2. Kt qu phân lp và tách dòng lu gi gen VP2 66 iv 4.3. THIT K VÀ GÀI “HP GEN KHÁNG NGUYÊN VP2” (CMV- KOZAK-VP2-PolyA) VÀO PLASMID TRUNG GIAN pL2.4 68 4.3.1. Thit k và thu nhn “hp gen kháng nguyên VP2“ (CMV- KOZAK-VP2-PolyA) 68 4.3.2. Gài “hp gen kháng nguyên VP2“ (CMV-KOZAK-VP2- PolyA) vào plasmid trung gian pL2.4 70 4.3.3. Chuyn np và chn lc plasmid trung gian pL2.4-VP2 73 4.4. KT QU TO PLASMID ADENOVIRUS TÁI T HP MANG GEN VP2 (pPacFAdV9-VP2) 74 4.4.1. Thit k plasmid vector FAd9 làm khung 74 4.4.2. Thu nhn lu gi DNA ca plasmid FAd9 (pFTR2-EGFP) và kim tra cht lng 75 4.4.3. Gây ng nhim to adenovirus FAd9 tái t hp mang gen VP2 77 4.5. KIM TRA KIM NGHIM GING VIRUS FAD9-VP2-L/R 78 4.5.1. Yêu cu kim tra kim nghim 78 4.5.2. ánh giá hot lc ca virus thông qua hy hoi t bào 79 4.5.3. Kt qu xác nh PFU ca ging FAd9-VP2 (FAd9-VP2-L và FAd9-VP2-R) 80 4.5.4. Kim nghim min dch vi kháng th Gumboro bng phn ng trung hòa 82 4.5.5. Kt qu kim tra ging FAd9-VP2-L và FAd9-VP2-R bng sinh hc phân t 86 4.5.6. Kt qu kim tra bng phn ng HA phát hin virus Newcastle 87 4.6. NGHIÊN CU CÔNG NGH T BÀO GAN PHÔI GÀ SN XUT VÀ KIM TRA GING VÀ VACXIN FAd9-VP2-L VÀ FAd9-VP2-R 88 4.6.1. Kt qu thc hin công ngh t bào  sn xut virus làm vacxin 88 4.6.2. Kt qu kim tra kh nng nuôi cy virus ging FAd9-VP2 trên t bào gan phôi gà 90 4.6.3. Kt qu sn xut ~5.000 liu adenovirus tái t hp trên t bào gan phôi gà 93 4.6.4. Kt qu kim tra an toàn vô trùng, hiu lc và phân b virus trong các c quan  gà c a vacxin 98 4.7. KIM TRA MIN DCH CA VACXIN FAD9-VP2-L VÀ FAD9- VP2-R BNG ELISA 102 4.7.1. B trí thí nghim 102 4.7.2. Kt qu th nghim adenovirus vacxin vào c th gà bng ng tiêu hóa (ung), hô hp (nh mi) và tiêm (di da) 104 4.7.3. Tng hp ánh giá kt qu kim tra ELISA ca hai loi vacxin FAd9-VP2-R (vacxin R) và FAd9-VP2-L (vacxin L) th nghim 109 Phần thứ năm KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU CÔNG NGHỆ ADENOVIRUS TÁI TỔ HỢP ĐỐI VỚI HỆ THỐNG HAD5 NGƯỜI 111 5.1. B TRÍ CÁC NI DUNG THC HIN NGHIÊN CU VI H THNG ADENOVIRUS HAD5 NGI 111 5.2. KT QU SN XUT LU GI DNA PLASMID CHA H 113 v GEN ADENOVIRUS (HAD5) VÀ PLASMID CON THOI 5.3 THIT K VÀ GÀI “HP GEN KHÁNG NGUYÊN VP2” (KOZAK-VP2) VÀO PLASMID CON THOI PSHUTTLE-CMV 115 5.3.1. Thiêt k và thu nhn “hộp gen VP2“ (KOZAK-VP2) 115 5.3.2. Gài „hp gen kháng nguyên VP2“ vào plasmid pShuttle-CMV 119 5.3.3. Kim tra DNA plasmid tái t hp pShuttle-CMV-VP2 121 5.4 KT QU TO PLASMID ADENOVIRUS TÁI T HP MANG GEN VP2 (pAd-Shuttle-VP2) 124 5.4.1. t vn  v công on gây ng nhim 124 5.4.2. Kt qu thc hin “ng nhim trc tip“ trong E. coli BJ5183 127 5.4.3. Kt qu xây dng phng pháp “ng nhim k tip” vào t bào BJ5183 ã cha sn pAdEasy1 130 5.4.4. Kt qu thc hin “ng nhim k tip“ DNA pShuttle-CMV- VP2 vào t bào kh bin BJ5183 mang sn vector pAdEasy1 133 5.4.5. Kim tra plasmid ng nhim tái t hp pAd-Shuttle-VP2 bng các phng pháp ct enzyme gii hn (EcoRI; PmeI và EcoRI; PacI) 138 5.4.6. Kt qu kim tra pAd-Shuttle-VP2 bng phng pháp sinh hc phân t và gii trình t 142 5.4.7. Kt lun chung v kt qu to plasmid adenovirus HAd5-VP2 145 Phần thứ sáu KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 146 Kết luận 146 Đánh giá chung về đề tài 147 Đề nghị 148 TÀI LIỆU THAM KHẢO 150 vi DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT VÀ GIẢI NGHĨA Ký hiệu Tiếng Anh Thuật từ/Cách dùng hoặc nghĩa tiếng Việt AGP Agar Gel Precipitation Phn ng kt ta khuch tán trong thch ATCC American Type Culture Collection T chc t bào quc t (tm dch s dng) bp base pair Cp baz CAR coxsackie/adenovirus receptor Th th ca adenovirus cùng vi coxsackie virus CED Chicken embryo dermal cells T bào biu bì phôi gà CEF Chicken Embryo Fibroblast Cells T bào x phôi gà CEK Chicken Embryo Kidney Cells T bào thn phôi gà CEL Chicken Embryo Liver Cells T bào gan phôi gà cDNA complementary DNA DNA b sung CMV Cytomegalovirus Virus cytomegalo CPE Cytopathic Effect Bnh tích t bào Da/kDa Dalton /Kilodalton n v tính trng lng phân t protein DMEM Dulbecco's Modified Eagle's Medium Môi trng nuôi cy t bào DNA Deoxyribonucleic acid Axit Deoxyribonucleic EGFP Enhanced Green Fluorescent Protein Protein phát hunh quang xanh lá cây ELISA Enzym Linked Immunosorbent Assay Phn ng hp ph min dch liên kt vi enzyme FAd9 Fowl adenovirus type 9 Adenovirus type 9 loài chim FBS fetal bovine serum Huyt thanh bê HAd5 Human adenovirus type 5 Adenovirus type 5 ngi HEK293 Human embryonic kidney cell T bào thn bào thai ngi IBD Infectious Bursal Disease Bnh viêm túi Fabricius truyn nhim IBDV Infectious Bursal Disease Virus Virus gây viêm túi Fabricius truyn nhim kb Kilobase 1000 cp baz (1 kb = 1000 bp) LB Luria-Bertani medium Môi trng LB L-ITR Light inverted tandem repeat Cu trúc lp ngn phía bên trái LMH Leghorn male hepatoma (avian hepatocellular carcinoma cell line) Dòng t bào u gan gà phát trin t gan gà trng Lgo (Kawaguchi et al., 1987) MTA Material Transfer Agreement Th a thun chuyn giao vt t sinh hc OIE Office International des Epizooties (since 25 Jan, 1924); World Organisation for Animal Health (from May, 2003) T chc Thú y quc t (hình thành 25/01/1924) ; t ngày nay vn gi tên lch s ó. ORF Open Reading Frame Khung c m PCR Polymerase chain reaction Phn ng nhân gen/DNA PFU plaque forming unit n v khun lc hình thành do áp dng vii phng pháp ‘úp mặt thạch” R-ITR Right inverted tandem repeat Cu trúc lp ngn phía bên phi RNA Ribonucleic Acid Axit ribonucleic RT-PCR Reverse transcription-PCR Phn ng PCR ngc SPF Special Pathogen Free Siêu sch mm bnh TCID50 tissue culture infectious dose Liu gây nhim 50% t bào TR2 Tandem repeats Cu trúc lp s 2 ( h gen FAd9) VN Virus Neutralization Phn ng trung hòa virus VP Viral protein Protein virus vvIBDV Very virulent Infectious Bursal Disease Virus Virus gây viêm túi Fabricius truyn nhim th c lc cao VP Viral protein Protein ca virus viii DANH MỤC CÁC HÌNH CÓ TRONG BÁO CÁO Hình Nội dung Tr Hình 1.1. S  tóm tt các giai on chính thc hin  tài nghiên cu công ngh adenovirus vector tái t hp mô hình gen kháng nguyên VP2 trên h thng adenovirus FAd9 gia cm và trên h thng adenovirus HAd5 ngi 4 Hình 2.1. Hình thái và cu to ca adenovirus. A. nh kính hin vi in t mô t các ht adenovirus có dng hình khi sp xp vi nhau to thành tp hp. B. Mô hình cu trúc không gian ca h t virion adenovirus 10 Hình 2.2. Mô hình cu to ht virion adenovirus (ct phng) vi DNA h gen và 13 loi protein c bit hin nay 10 Hình 2.3. Xâm nhim ca adenovirus vào t bào thông qua th th CAR và α- integrin (mi tên ch dn), dn vào endosome và chuyn vn n nhân  thc hin chu trình tái to virus 11 Hình 2.4. Công ngh to vector adenovirus tái t hp cha gen kháng nguyên VP2, s dng h thng AdEasy™ Adenoviral Vector System (Stratagene Inc.) 23 Hình 2.5. S  minh ha các phân on A và B ca h gen virus Gumboro 26 Hình 3.1. H thng gen ca FAdV-9 (FAd9) c thit k to thành plasmid pPacFAdV-9, nhim t bào Hepatoma (CH-SAH)  to nên virus FAdV-9 (virus t nhiên, hoang dã, wildtype) 35 Hình 3.2 H thng gen ca FAdV-9 (FAd9) c thit k to thành plasmid pPacFAdV-9, cài “hộp gen EGFP” vào v trí TR2  to thành plasmid pFTR2-EGFP làm “vector m” (open vector). Kim tra bng cách lây nhim vào t bào Hepatoma  to virus FAdV-9 ch th hunh quang, rt d phát hin 36 Hình 3.3. S  cu trúc ca plasmid khung pAdEasy-1 mua ca hãng Stratagene (Stratagene Inc.) 37 Hình 3.4. S  cu trúc ca plasmid con thoi pShuttle-CMV và vùng a ni MCS tip nhn DNA ngoi lai (Stratagene) 38 Hình 3.5. T bào HEK293. (A): Nuôi cy thành mt lp sau 72 h (t >90% ph áy); (B): nhum hunh quang (Ngun: http://hek293.com/ ); (C): Nuôi cy mc thành mt lp sau 48 h, do chúng tôi ( tài KC04.24/06-10), thc hin 39 Hình 4.1. S  minh ha 8 giai on thc hin  tài (I - VIII), ca ni dung nghiên cu công ngh adenovirus FAd9 gia cm 64 Hình 4.2 Bnh tích in hình ca túi Fabricius (sng to) và c (xut huyt)  gà tip truyn 66 Hình 4.3. Kt qu in di sn phm RT-PCR nhân gen kháng nguyên VP2 ca mt ch ng i din (A) và kim tra kt qu ct DNA plasmid tái t hp bng enzyme EcoRI (B) 67 Hình 4.4. Trình bày chui nucleotide và amino acid suy din ca gen VP2 thu nhn t chng GKN-T1ST 67 Hình 4.5. S  minh ha quá trình lp ghép gen VP2 và các thành phn ph tr khác (hp gen CMV-Kozak-VP2-PolyA) vào plasmid trung gian pL2.4 ca h thng FAd9 adenovirus gia cm 71 Hình 4.6. S  b trí v trí cài “hộp gen kháng nguyên VP2” vào vùng cu trúc lp TR2, mà trc ó TR2 ã c thit k thay th bng EGFP (Enhanced Green Fluorecence Protein) bt màu hunh quang 72 Hình 4.7. Kt qu sàng lc các DNA VP2 cài vào plasmid pL2.4 (A) và kim ix tra các clone tái t hp bng phn ng PCR vi cp mi CMV-up Primer và PolyA-dn Primer (B) 73 Hình 4.8. H gen ca FAdV-9 (FAd9) c thit k to thành plasmid pPacFAdV-9, cài “hộp gen VP2” vào v trí TR2 to thành plasmid pFTR2-VP2 (quay trái) hoc pFTR2-VP2inv (quay phi), lây nhim t bào Hepatoma to giống nguyên gốc FAd9-VP2-L và FAd9- VP2-R (thc hin ti Canada); chuyn giao ging nguyên gc cho Vin Công ngh sinh hc, lây nhim t bào gan phôi gà (CEL) tip truyn giống g ốc và tạo giống cấp 1  sn xut vacxin FAd9-VP2-L và FAd9-VP2-R (thc hin ti Vit Nam) 76 Hình 4.9. T bào mt lp (monolayer): A. Không gây nhim (i chng); B. Gây nhim virus FAd9-VP2 (nng  10 -3 ) có CPE sau 72 gi 79 Hình 4.10 T bào Hepatoma nhim  nng  virus gây nhim là 10 -6 ca FAd9- VP2-L có s lng plaque nhiu (xem ti, không nhum bng  trung tính) 80 Hình 4.11. S  b trí thí nghim trung hòa  các chai t bào nuôi cy gan phôi gà mt lp 83 Hình 4.12. Hình nh t bào gan phôi gà mt lp quan sát  thí nghim trung hòa virus FAd9-VP2-L vi kháng th kháng VP2 ca virus Gumboro 84 Hình 4.13: Kt qu in di gen VP2 s dng cp mi E1F-E1R (~ 1,35kb) 86 Hình 4.14: Kt qu ki m tra hiu giá HA 88 Hình 4.15 ánh giá kt qu nuôi cy t bào gan phôi gà sau 24 h và 48 h; t bào mc thành mt lp u mn trong môi trng DMEM/FBS 90 Hình 4.16. ánh giá CPE kt qu nuôi cy ging FAd9-VP2-L (FADVAC-L) và FAd9-VP2-R (FADVAC-R) trên t bào gan phôi gà sau 72 h  chn ging 93 Hình 4.17. ánh giá CPE  xác nh thi im thu hoch virus FAd9-VP2-L (FADVAC-L) trên t bào gan phôi gà sau 48 h, 72 h, 96 h và 144 h; có b trí i chng 93 Hình 4.18. T bào gan phôi gà (CEL) lúc 48 h mt lp (u, mn, trong môi tr ng DMEM/FBS)  chun b cy ging virus vacxin FAd9-VP2- L/R; t bào i chng theo dõi lúc 72h và t bào i chng lúc 144h  so sánh vi t bào cy ging sn xut vacxin 94 Hình 4.19. Kim tra thng xuyên hàng ngày các chai t bào gan phôi gà trc khi cy ging virus và các chai nuôi cy virus và i chng 95 Hình 4.20. S hy hoi t bào (CPE) ca 3 chai (1, 2, 3) nuôi cy ging virus vacxin FAd9-VP2-L trên t bào gan phôi gà ti thi im 72h sau gây nhim,  thu hoch vacxin 96 Hình 4.21. Kt qu in di kim tra vùng “siêu biến đổi” ca gen VP2 (474 bp) thu nhn t các mu 101 Hình 4.22. Kt qu gii trình t kim tra chui gen vùng “siêu biến đổi” (474 bp) ca gen VP2 thu nhn t mu lách c tách dòng trong plasmid pCR2.1 101 Hình 5.1. S  minh ha 4 giai on ã thc hin ca  tài (I - IV), thuc các ni dung nghiên cu công ngh adenovirus HAd5 ng i 112 Hình 5.2 Kim tra trên thch agarose 1%, DNA ca plasmid vector con thoi pShuttle-CMV sau khi ct m vòng bng EcoRI ca các clone 1, 2, 3, u có kích thc 7,5 kb 115 Hình 5.3. in di sn phm PCR thu nhn “hộp gen kháng nguyên VP2” ( dài khong 1,38 kb) bng cp mi GKPKZR-GV2R 117 x Hình 5.4. in di kim tra DNA vector tái t hp pShuttle-CMV-VP2 ct bng EcoRI. C+: DNA ca pShuttle-CMV ( dài 7,5 kb) làm i chng 120 Hình 5.5. in di kim tra sn phm vector pShuttle-CMV-VP2 ca 3 chng GKN-T1ST, GKN-G202 và GQG-52-70 122 Hình 5.6. Trình t nucleotide ti u 5’ và 3’ ca chromatogram gii trình t mt clone i din ca plasmid con thoi pShuttle-CMV-VP2 123 Hình 5.7. Minh ha quá trình gây ng nhim trong E. coli 5183 gia DNA ca plasmid con thoi pShuttle-CMV-VP2 (ct bng PmeI) (1) vi DNA c a plasmid adenovirus vector pAdEasy-1 (2),  to nên plasmid adenovirus tái t hp pAd-Shuttle-VP2 (3), cha các thành phn: vùng mm ori ca plasmid con thoi và gen kháng kháng sinh kanamycin (mi tên); hp gen kháng nguyên VP2; và khung adenovirus HAd5. Vùng mm ori và gen kháng kháng sinh ampicillin ca plasmid pAdEasy-1 b loi b trong quá trình ng nhim 126 Hình 5.8. Kim tra on DNA ca pShuttle-CMV-VP2 sau khi ct m vòng bng enzyme PmeI 128 Hình 5.9. in di kim tra kh nng hiu qu ng nhim to vector adenovirus tái t hp 130 Hình 5.10. in di kim tra sn phm DNA ca các clone BJ5183 chuyn np DNA plasmid pAdEasy-1 132 Hình 5.11. in di kim tra DNA tách t t bào kh bin BJ5183 mang vector pAdEasy1 sau khi gây ”ng nhim k tip” vi DNA pShuttle- CMV-VP2 và xác nh clone dng tính 136 Hình 5.12. in di kim tra chuyn np chn lc các khun lc cha plasmid tái t hp pAd-Shuttle-VP2 sàng lc phân lp vi các khun lc khác 137 Hình 5.13. K t qu in di kim tra DNA plasmid tái t hp pAd-Shuttle-VP2 ct bng enzyme EcoRI 139 Hình 5.14. Kt qu in di kim tra DNA plasmid tái t hp pAd-Shuttle-VP2 (clone 1/1; 4/2 và 5/1) ct bng hai enzyme EcoRI và PmeI 140 Hình 5.15. in di kim tra kt qu DNA ca pAd-Shuttle-VP2(1/1) và pAd- Shuttle-VP2(5/1) ct bng PacI 141 Hình 5.16. Kt qu in di sn phm PCR thc hin  kim tra adenovirus tái t h p pAd-Shuttle-VP2(1/1); pAd-Shuttle-VP2(4/2) và pAd-Shuttle- VP2(5/1), vi các cp mi c hiu SHUTF-ADER (~2,6 kb) và GKPKZF-GV2R (~1,35 kb) 143 Hình 5.17. Kt qu gii trình t kim tra sn phm PCR thu nhn vùng giao nhau gia pShuttle-CMV và pAdEasy1 ca pAd-Shuttle-VP2(1/1) cha hp gen VP2 144 [...]... hiện nay Đề tài KC04.24/06-10: Nghiên cứu phát triển công nghệ vector adenovirus để sản xuất vắc- xin cho động vật trên mô hình gen kháng nguyên VP2 (virus protein 2) phòng bệnh Gumboro , đã được Bộ Khoa học và Công nghệ phê duyệt, cho thực hiện trong giai đoạn 2009 - 2010, với một số chủ đích như sau: Mục tiêu tổng thể của đề tài: Nghiên cứu ứng dụng công nghệ vector adenovirus tái tổ hợp lần đầu tiên... VP2 (Kozak -VP2) Cài “Hộp gen kháng nguyên VP2 vào plasmid con thoi (pShuttle-CMV -VP2) Tạo plasmid adenovirus tái tổ hợp mang gen VP2 IV Tạo plasmid adenovirus tái tổ hợp mang gen VP2 (pPacFAdV9 -VP2) (pAd-Shuttle -VP2) Tạo adenovirus tái tổ hợp mang gen VP2 Tạo adenovirus tái tổ hợp mang gen VP2 V (FAd9 -VP2- L/R) Sản xuất adenovirus tái tổ hợp mang gen VP2 VI (FAd9 -VP2- L và R) Công nghệ tế bào CEL sản. .. thống adenovirus để làm vacxin cho động vật, trước hết là xây dựng mô hình gen kháng nguyên VP2 của virus Gumboro ở gia cầm, từ đó, có được sự tiếp cận công nghệ mới cho nghiên cứu sản xuất vacxin thế hệ mới và các chế phẩm hoạt tính sinh học thế hệ mới sau này Mục tiêu cụ thể của đề tài: - Có được qui trình công nghệ và hệ thống adenovirus làm vector vacxin - Có được giống vacxin sản xuất bằng công nghệ. .. CEL sản xuất và kiểm tra giống và vacxin (HAd5 -VP2) Sản xuất adenovirus tái tổ hợp mang gen VP2 (HAd5 -VP2) VII (FAd9 -VP2- L và R) Kiểm tra miễn dịch của vacxin FAd9 -VP2- L và R (Tiêu hóa; Hô hấp; Tiêm) VIII Hình 1.1 Sơ đồ tóm tắt các giai đoạn chính thực hiện đề tài nghiên cứu công nghệ adenovirus vector tái tổ hợp mô hình gen kháng nguyên VP2 trên hệ thống adenovirus FAd9 gia cầm và trên hệ thống adenovirus. .. VỀ CÔNG NGHỆ ADENOVIRUS TÁI TỔ HỢP VÀ SỰ CẦN THIẾT NGHIÊN CỨU CỦA ĐỀ TÀI KC04.24/06-10 2.1 Đánh giá về công nghệ adenovirus tái tổ hợp 2.1.1 Adenovirus và nghiên cứu phát triển làm vector tái tổ hợp hiện nay Rất nhiều loại vector virus đã được nghiên cứu thiết kế làm vector vacxin và khám phá khả năng biểu hiện protein kháng nguyên từ nguồn gen của vi sinh vật độc hại ngoại lai, vacxin do virus làm vector. .. thực hiện thành công đề tài KC04.24/06-10 với mô hình gen kháng nguyên VP2 của virus Gumboro ở gia cầm, công nghệ vector adenovirus sẽ được triển khai và đưa ra được một loại hình công nghệ mới làm cơ sở (làm tiền đề) cho những vacxin virus khác của gia súc, gia cầm và thuỷ sản, ứng dụng thích hợp cho mỗi loại bệnh truyền nhiễm cần phòng chống *** Có nhiều loại adenovirus người và động vật đã được thiết... (adenovirus vector) SẢN XUẤT VACCINE 5 Hình 2.4 Công nghệ tạo vector adenovirus tái tổ hợp chứa gen kháng nguyên VP2, sử dụng hệ thống AdEasy™ Adenoviral Vector System (Stratagene Inc.) Mô tả chi tiết các bước 1-5 được trình bày trong bài 24 Có thể mô tả vắn tắt lược trình thực hiện đối với gen VP2 của virus Gumboro, sử dụng hệ thống HAd5, như sau: Bước 1 Gen kháng nguyên VP2 (1356 bp) của virus Gumboro. .. Tạo adenovirus tái tổ hợp mang gen VP2: DNA của plasmid adenovirus tái tổ hợp chứa hộp gen VP2 nhất thiết phải được cắt bằng enzyme PacI, rồi tiếp tục thực hiện lây nhiễm (transfection) vào tế bào đặc thù cho mỗi hệ thống (Hepatoma cho hệ thống FAd9 để tạo adenovirus FAd9 -VP2; HEK293 cho hệ thống HAd5 để tạo adenovirus HAd5 -VP2) vi) Sản xuất adenovirus tái tổ hợp mang hộp gen VP2: Giống virus FAd9 -VP2. .. virus Gumboro) trên cả hai hệ thống là FAd9 và HAd5 để sử dụng làm vacxin, đã trải qua các giai đoạn sau (Hình 1.1): 3 I Phân lập và lưu giữ gen đích kháng nguyên VP2 của Gumboro Việt Nam Hệ thống adenovirus FAd9 gia cầm Hệ thống adenovirus HAd5 người Thiết kế “Hộp gen kháng nguyên VP2 II (CMV-Kozak -VP2- PolyA) Cài “Hộp gen kháng nguyên VP2 vào plasmid trung gian III (p∆L2.4 -VP2) Thiết kế “Hộp gen kháng. .. thực hiện vì là công việc phụ chưa cần tập trung giải quyết 4 i) Phân lập và lưu giữ gen đích kháng nguyên VP2: Cung cấp nguồn nguyên liệu gen VP2 để thiết kế “hộp gen kháng nguyên VP2 từ virus Gumboro của Việt Nam ii) Thiết kế “hộp gen kháng nguyên VP2 (VP2 antigenic expression cassette): “Hộp gen kháng nguyên VP2 được hiểu là đoạn DNA được thiết kế từ nguyên liệu gen kháng nguyên VP2 đã lưu giữ, . KC04.24/06-10: Nghiên cứu phát triển công nghệ vector adenovirus để sản xuất vắc-xin cho động vật trên mô hình gen kháng nguyên VP2 (virus protein 2) phòng bệnh Gumboro , ã c B Khoa hc và Công. hợpmanggenVP2 (HAd5 -VP2) Sảnxuấtadenovirus tái tổ hợpmanggenVP2 (FAd9 -VP2- L và R) Sảnxuất adenovirus tái tổ hợpmanggenVP2 (HAd5 -VP2) Công nghệ tế bào CEL sảnxuấtvàkiểmtra giống và vacxin (FAd9 -VP2- L. hợpmanggenVP2 (HAd5 -VP2) Sảnxuấtadenovirus tái tổ hợpmanggenVP2 (FAd9 -VP2- L và R) Sảnxuất adenovirus tái tổ hợpmanggenVP2 (HAd5 -VP2) Công nghệ tế bào CEL sảnxuấtvàkiểmtra giống và vacxin (FAd9 -VP2- L