Đang tải... (xem toàn văn)
pp Lv hanh 04 12 ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM HOÀNG THỊ HỒNG HẠNH NGHIÊN CỨU BIỂU HIỆN GEN MÃ HÓA KHÁNG NGUYÊN BỀ MẶT CỦA TRYPANOSOMA EVANSI VÀ ỨNG DỤNG KHÁNG NGUYÊN TÁI TỔ HỢP ĐỂ SẢN X[.]
ĐẠI HỌC THÁI NGUN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NƠNG LÂM HỒNG THỊ HỒNG HẠNH NGHIÊN CỨU BIỂU HIỆN GEN MÃ HÓA KHÁNG NGUYÊN BỀ MẶT CỦA TRYPANOSOMA EVANSI VÀ ỨNG DỤNG KHÁNG NGUYÊN TÁI TỔ HỢP ĐỂ SẢN XUẤT KÍT CHẨN ĐOÁN BỆNH TIÊN MAO TRÙNG Ở GIA SÚC Chuyên ngành: Thú y Mã số: 60.64.01.01 LUẬN VĂN THẠC SĨ THÚ Y Người hướng dẫn khoa học: TS Phan Thị Hồng Phúc TS Phạm Thị Tâm Thái Nguyên, năm 2013 n i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan kết nghiên cứu trình bày luận văn Các số liệu, kết nghiên cứu luận văn chưa cơng bố cơng trình khác Tác giả luận văn Hoàng Thị Hồng Hạnh n ii LỜI CẢM ƠN Nhân dịp hoàn thành luận văn Thạc sĩ khoa học nông nghiệp chuyên ngành Thú y xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến GS TS Nguyễn Thị Kim Lan, TS Phan Thị Hồng Phúc Khoa Chăn nuôi Thú y Trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên, TS Phạm Thị Tâm Khoa Công nghệ sinh học Viện Đại học Mở Hà Nội, trực tiếp hướng dẫn, tận tình bảo tạo điều kiện tốt cho tơi suốt q trình học tập nghiên cứu khoa học Tôi xin trân trọng cảm ơn: - Các thầy cô giáo Khoa Chăn nuôi Thú y, giúp tơi hồn thành khóa học nâng cao chất lượng luận văn - Khoa Đào tạo sau đại học tạo điều kiện cho suốt q trình học tập trường Cuối tơi xin bày tỏ lòng biết ơn đến người thân, gia đình động viên, giúp đỡ tơi hồn thành luận văn Xin trân trọng cảm ơn! Thái Nguyên, tháng 10 năm 2013 Tác giả luận văn Hoàng Thị Hồng Hạnh n iii CHỮ VIẾT TẮT VÀ KÝ HIỆU CATT Card Agglutination Test for Trypanosomiasis ADN Deoxyribo Nucleic Acid dNTP Deoxynucleotid triphotphat EDTA Ethylen Diamin Tetra Acetic IFAT Indirect Fluorescent Antibody Test IPTG Isopropyl β – D – thiogalactoside PBS Phosphat Buffered Saline PCR Polymerase Chain Reaction ARN Ribonucleic acid SDS Sodium Dodecyl Sulfat SDS – PAGE Sodium Dodecyl Sulfat Poly Acrylamide TEA Tris – axit acetic – EDTA T evansi Trypanosoma evansi VAT Variant Antigen Tupe VSG Variant Surface Glucoprotein v/p Vòng/phút n iv MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ 1 Tính cấp thiết của đề tài Mục tiêu đề tài Ý nghĩa khoa học ý nghĩa thực tiễn đề tài 3.1 Ý nghĩa khoa học 3.2 Ý nghĩa thực tiễn Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 TIÊN MAO TRÙNG VÀ BỆNH TIÊN MAO TRÙNG Ở GIA SÚC 1.1.1 Đặc điểm hình thái, cấu trúc phân loại tiên mao trùng 1.1.2 Dịch tễ học bệnh tiên mao trùng .8 1.1.3 Đặc điểm bệnh lý lâm sàng bệnh 11 1.1.4 Chẩn đoán bệnh tiên mao trùng 14 1.1.5 Phương pháp phát ADN tiên mao trùng phản ứng PCR (Polymerase Chain Reaction) .20 1.1.6 Phòng trị bệnh tiên mao trùng cho trâu, bò, ngựa 21 1.2 VECTOR TÁCH DÒNG .24 1.2.1 Khái niệm .24 1.2.2 Các loại vector tách dòng .25 1.2.3 Plasmid pCR 2.1 .26 1.3 VECTOR BIỂU HIỆN .28 1.3.1 Khái niệm .28 1.3.2 Các hệ thống biểu gen 29 Chương 2: VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 31 2.1 Đối tượng 31 2.2 Vật liệu, trang thiết bị dụng cụ nghiên cứu 31 2.1.1 Chủng vi khuẩn plasmid 31 2.1.2 Các sinh phẩm, thang chuẩn 31 2.1.3 Hóa chất, máy móc thiết bị 31 n v 2.1.4 Môi trường đệm 33 2.1.5 Cặp mồi sử dụng .33 2.2 NỘI DUNG, ĐỊA ĐIỂM VÀ THỜI GIAN NGHIÊN CỨU .34 2.3 Phương pháp nghiên cứu 34 2.3.1 Sơ đồ nghiên cứu 34 2.3.2 Các phương pháp nghiên cứu 35 2.3.3 Phương pháp biểu 39 2.3.4 Phương pháp tinh protein tái tổ hợp cột lực Ni2+ 39 2.3.5 Phương pháp điện di protein (Yoshihito Kihiwaraki, 2002) 42 2.3.6 Phản ứng ELISA gián tiếp (Yoshihito Kihiwaraki, 2002) .42 2.3.7 Phản ứng Western blot (Yoshihito Kihiwaraki, 2002) 43 2.3.8 Xác định độ nhạy độ đặc hiệu phản ứng ELISA .44 2.3.9 Xác định độ lặp lại kết phản ứng ELISA 44 Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .46 3.1 Xác định điều kiện nuôi cấy chủng E coli BL21/pET-RoTAT 1.2 46 3.2 Biểu gen mã hóa kháng nguyên tái tổ hợp RoTAT 1.2 .48 3.3 Nghiên cứu xác định điều kiện biểu gen mã hóa kháng nguyên RoTAT 1.2 E.coli 50 3.3.1 Nghiên cứu xác định thời gian tăng sinh chủng biểu 50 3.3.2 Nghiên cứu xác định nhiệt độ tăng sinh chủng biểu .51 3.3.3 Nghiên cứu xác định mối tương quan mật độ vi khuẩn mức độ biểu gen mã hóa kháng nguyên RoTAT 1.2 .51 3.3.4 Nghiên cứu xác định độ pH phù hợp để sinh tổng hợp protein tái tổ hợp RoTAT 1.2 53 3.3.5 Nghiên cứu xác định nồng độ kháng sinh phù hợp cho tổng hợp kháng nguyên tái tổ hợp RoTAT 1.2 54 3.3.6 Nghiên cứu ảnh hưởng IPTG đến tổng hợp kháng nguyên tái tổ hợp RoTAT 1.2 .55 3.4 Biểu tinh kháng nguyên tái tổ hợp RoTAT 1.2 .56 n vi 3.5 Nghiên cứu sử dụng kháng nguyên tái tổ hợp RoTAT 1.2 xây dựng quy trình phản ứng ELISA phát bệnh tiên mao trùng 58 3.5.1 Kết xác định hàm lượng kháng ngun độ pha lỗng kháng thể thích hợp cho phản ứng ELISA 59 3.5.2 Khảo sát tác nhân block giếng .60 3.5.3 Kết xác định thời gian ủ đĩa ELISA với kháng thể đặc hiệu T.evansi anti-bovine IgG:HRPO 61 3.6 Kết xác định độ nhạy, độ đặc hiệu phản ứng ELISA 62 3.7 Xác định mức độ lặp lại kết phản ứng 63 3.7.1 Đánh giá khả phát bệnh phản ứng ELISA mẫu máu trâu bò nghi nhiễm tiên mao trùng 64 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .66 Kết luận 66 Đề nghị 67 TÀI LIỆU THAM KHẢO 68 n vii DANH MỤC BẢNG BIỂU Bảng 2.1 Các hóa chất 32 Bảng 2.2 Các máy thiết bị 33 Bảng 2.3 Công thức pha gel tách (12%) 40 Bảng 2.4 Công thức pha gel co (5%) 40 Bảng 3.1 Xác định hiệu giá huyết nồng độ kháng nguyên tối ưu cho phản ứng ELISA (S/N) 59 Bảng 3.2 Giá trị OD phản ứng ELISA với tác nhân block 60 Bảng 3.3 Kết phản ứng ELISA để xác định độ nhạy đặc hiệu 63 Bảng 3.4 Kết xác định mức độ lặp lại kết phản ứng ELISA 63 Bảng 3.5 Kết xác định trâu, bò nhiễm bệnh tiên mao trùng phương pháp ELISA PCR 64 n viii DANH MỤC HÌNH Hình 2.1 Kích thước thang chuẩn .31 Hình 3.1 Trình tự gen trình tự axit amin suy diễn RoTAT 1.2 46 Hình 3.2 Kết biến nạp plasmid tái tổ hợp vào E coli BL21 .47 Hình 3.3 Kết điện di protein tổng số gel SDS-PAGE 48 Hình 3.4 Kết Western blot kiểm tra tính đặc hiệu protein tái tổ hợp RoTAT 1.2 với kháng thể đặc hiệu Trypanosoma evansi 49 Hình 3.5 Mức độ biểu kháng nguyên RoTAT 1.2 theo thời gian cảm ứng 50 Hình 3.6 Mức độ biểu kháng nguyên RoTAT 1.2 nhiệt độ nuôi cấy 51 Hình 3.7 Mức độ biểu kháng nguyên RoTAT 1.2 giá trị OD khác .52 Hình 3.8 Mức độ biểu kháng nguyên RoTAT 1.2 giá trị pH khác 53 Hình 3.9 Mức độ biểu kháng nguyên RoTAT 1.2 nồng độ kháng sinh ampicillin bổ sung vào môi trường 54 Hình 3.10 Mức độ biểu kháng nguyên RoTAT 1.2 nồng độ IPTG cảm ứng 55 Hình 3.11 Protein thu từ dịch ni cấy chủng E.coli BL21- pET32/ RoTAT1.2 56 Hình 3.12 Điện di protein RoTAT 1.2 tinh gel SDS-PAGE 57 Hình 3.13 Phản ứng western blot kiểm tra tính đặc hiệu protein RoTAT 1.2 58 Hình 3.14 Ảnh hưởng thời gian ủ huyết đến kết phản ứng ELISA 61 Hình 3.15 Ảnh hưởng thời gian ủ anti-bovine IgG:HRPO đến kết phản ứng ELISA 62 n ĐẶT VẤN ĐỀ Tính cấp thiết của đề tài Bệnh tiên mao trùng bệnh ký sinh trùng đường máu phổ biến gây tác hại lớn cho trâu, bị nhiều lồi động vật khác Trypanosoma evansi (T evansi) gây Theo Phan Địch Lân cs (2004) [9], Phan Văn Chinh (2006) [3], bệnh tiên mao trùng xuất nhiều vùng nước, với tỷ lệ mắc cao: trâu 13 – 30%, bò – 14%, tỷ lệ gia súc chết/gia súc mắc lên tới 6,3 – 20% Bệnh gây thiệt hại lớn cho ngành chăn nuôi ảnh hưởng đến sản lượng thịt, sữa sức kéo Trong phương pháp chẩn đoán bệnh tiên mao trùng nước ta như: phương pháp chẩn đoán truyền thống, phương pháp chẩn đoán huyết học, phương pháp chẩn đoán sinh học phân tử phương pháp chẩn đốn huyết học đánh giá có độ nhạy độ đặc hiệu cao, cho kết nhanh có khả chẩn đoán với số lượng mẫu lớn thời gian ngắn Tuy nhiên, nước ta phải sử dụng Kít nhập ngoại nên giá thành cao, chưa có khả sử dụng rộng rãi để chẩn đoán bệnh tiên mao trùng Ở Việt Nam, vấn đề sản xuất Kít huyết học chẩn đốn bệnh tiên mao trùng cịn vấn đề Các cơng trình nghiên cứu tập chung vào xác định đặc điểm dịch tễ, hiệu chẩn đoán số phương pháp phát tiên mao trùng phương pháp phát kháng thể, chưa có cơng trình nghiên cứu chế tạo Kít chẩn đốn bệnh Để sản xuất Kít chẩn đốn, cần phải có lượng lớn kháng ngun RoTAT 1.2, nguồn kháng nguyên sản xuất phương pháp: tự nhiên tái tổ hợp Kháng nguyên tự nhiên tách từ ký sinh trùng sau tăng sinh động vật thí nghiệm Ưu điểm phương pháp đồng thời tạo lượng lớn kháng nguyên Tuy nhiên, kháng nguyên không tinh khiết, thành phần đa dạng, có khả gây phản ứng dương tính giả với kháng thể khác Trong kháng nguyên tái tổ hợp khắc phục hạn chế n ... sản xuất Kít chẩn đốn bệnh tiên mao trùng nước, chúng tơi tiến hành nghiên cứu đề tài: ? ?Nghiên cứu biểu gen mã hóa kháng nguyên bề mặt Trypanosoma evansi ứng dụng kháng nguyên tái tổ hợp để sản. .. học biểu gen mã hóa kháng nguyên bề mặt Trypanosoma evansi ứng dụng để sản xuất Kít chẩn đốn bệnh tiên mao trùng n 3.2 Ý nghĩa thực tiễn Đề tài chế tạo kháng ngun tái tổ hợp để sản xuất Kít chẩn. .. đốn bệnh tiên mao trùng cho gia súc Việt Nam, nhằm phục vụ cho việc chẩn đoán nhanh hiệu bệnh tiên mao trùng cho gia súc n Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 TIÊN MAO TRÙNG VÀ BỆNH TIÊN MAO TRÙNG Ở GIA