(Luận văn thạc sĩ) theo dõi khả năng kháng thuốc diệt cỏ của dòng đậu tương chuyển gen đvn9 qua các thế hệ t1, t2 và t3

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM ĐÀO QUANG THƯỚNG Tên đề tài: THEO DÕI KHẢ NĂNG KHÁNG THUỐC DIỆT CỎ CỦA DÒNG ĐẬU TƯƠNG ĐVN9 CHUYỂN GEN QUA CÁC THẾ HỆ T1, T2 VÀ T3 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Hệ đào tạo Chuyên ngành Khoa Khóa học : : : : Chính quy Cơng nghệ Sinh học Công nghệ Sinh học Công nghệ Thực phẩm 2010- 2014 Thái Nguyên, 2014 n ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM ĐÀO QUANG THƯỚNG Tên đề tài: THEO DÕI KHẢ NĂNG KHÁNG THUỐC DIỆT CỎ CỦA DÒNG ĐẬU TƯƠNG ĐVN9 CHUYỂN GEN QUA CÁC THẾ HỆ T1, T2 VÀ T3 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Hệ đào tạo : Chính quy Chuyên ngành : Công nghệ Sinh học Khoa : Công nghệ Sinh học Cơng nghệ Thực phẩm Khóa học : 2010- 2014 Người hướng dẫn : TS Nguyễn Văn Duy Khoa CNSH – CNTP, Trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên Thái Nguyên, 2014 n LỜI CẢM ƠN Trong suốt trình thực tập tốt nghiệp phịng thí nghiệm khoa Cơng nghệ Sinh học Công nghệ Thực phẩm vừa qua, nhận nhiều giúp đỡ từ ban chủ nhiệm khoa, giảng viên hướng dẫn, cán kỹ thuật phịng thí nghiệm, thầy cơ, gia đình bạn bè Trước hết, tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới thầy giáo TS Nguyễn Văn Duy tận tình giúp đỡ, hướng dẫn tơi suốt thời gian thực đề tài hoàn thành khóa luận Tơi xin chân thành cảm ơn KS Lã Văn Hiền tận tình hướng dẫn tạo điều kiện tốt cho thực đề tài suốt thời gian thực tập phịng thí nghiệm hồn thành khóa luận Tơi xin chân thành cảm ơn thầy cô Khoa Công nghệ Sinh học Công nghệ Thực phẩm, Trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên nhiệt tình giúp đỡ trình học tập, thực đề tài hồn thành khóa luận Cuối cùng, tơi xin chân thành cảm ơn tồn thể gia đình, bạn bè hết lịng giúp đỡ, động viên tạo điều kiện vật chất tinh thần cho tơi q trình học tập nghiên cứu Do thời gian thực đề tài có giới hạn nên khơng thể tránh khỏi sai sót Em mong nhận góp ý, nhận xét thầy cô bạn để đề tài em hoàn thiện Em xin chân thành cảm ơn! Thái Nguyên, ngày 03 tháng 06 năm 2014 Sinh viên thực Đào Quang Thướng n DANH MỤC BẢNG BIỂU Trang Bảng 2.1 Tình hình sản xuất đậu tương giới năm gần Bảng 2.2 Tình hình sản xuất đậu tương nước đứng đầu giới Bảng 2.3 Các nước nhập đậu tương hàng đầu châu Á Bảng 2.4 Tình hình sản xuất đậu tương Việt Nam năm gần Bảng 3.1 Mật độ gieo trồng 19 Bảng 4.1 Kết đánh giá khả kháng thuốc diệt cỏ dòng đậu tương chuyển gen hệ T1 sau ngày 24 Bảng 4.2 Kết đánh giá khả kháng thuốc diệt cỏ dòng đậu tương chuyển gen hệ T2 sau ngày 26 Bảng 4.3 Kết đánh giá khả kháng thuốc diệt cỏ dòng đậu tương chuyển gen hệ T3 28 Bảng 4.4 Kết phân tích PCR hệ T1 32 Bảng 4.5 Kết phân tích PCR hệ T2 34 Bảng 4.6 Kết phân tích PCR hệ T3 35 n DANH MỤC HÌNH ẢNH Trang Hình 4.1 Một số hình ảnh đánh giá kháng thuốc diệt cỏ dòng đậu tương chuyển gen hệ T1 25 Hình 4.2 Một số hình ảnh đánh giá kháng thuốc diệt cỏ dòng đậu tương chuyển gen hệ T2 27 Hình 4.3 Một số hình ảnh đánh giá kháng thuốc diệt cỏ dòng đậu tương chuyển gen hệ T3 29 Hình 4.4 Phương pháp đánh giá kháng thuốc trừ cỏ Zhang-yue Song cs 29 Hình 4.5 Sản phẩm DNA tổng số dòng đậu tương hệ T1 30 Hình 4.6 Sản phẩm DNA tổng số dòng đậu tương hệ T2 30 Hình 4.7 Sản phẩm DNA tổng số dịng đậu tương hệ T2 31 Hình 4.8 Kết điện di kiểm tra sản phẩm PCR gen bar hệ T1 32 Hình 4.9 Kết điện di sản phẩm PCR gen bar hệ T2 33 Hình 4.10 Kết điện di sản phẩm PCR gen bar hệ T3 34 n DANH MỤC CÁC TỪ, CỤM TỪ VIẾT TẮT Bar : Baialaphos resistance BNN&PTNT : Bộ Nông nghiệp Phát triển Nông thôn Bt : Bacillus thuringiensis var Kurstaki Cs : Cộng CT : Công thức CTAB : Cetyl-trimethyl ammonium bromide Đ/c : Đối chứng EDTA : Ethyenediamine tetraacetate Nxb : Nhà xuất FAO : Food and Agriculture oganization of the United Nations Gus : B-1,4- Glucoronidase GNA : Galanthus Nivalis Agglutinin PCR : Polymerase chain reaction PPT : phosphinothricin T0 : Thế hệ chuyển gen thu sau tái sinh (Ví dụ:D35) T1 : Thế hệ thứ T0 (Ví dụ: D35.1; D35.2; D35.3.v.v ) T2 : Thế hệ thứ hai T0 (Ví dụ: D35.1.1; D35.2.1;.v.v ) T3 : Thế hệ thứ ba T0 (Ví dụ: D35.1.1.2; D35.2.1.1;.v.v ) TB : Trung bình USD : United states dollar n MỤC LỤC Trang PHẦN 1: MỞ ĐẦU 1.1 Tính cấp thiết đề tài PHẦN 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 11 2.1 Giới thiệu chung đậu tương 11 2.1.1 Nguồn gốc 11 2.1.2 Phân loại 11 2.1.3 Giá trị đậu tương 11 2.2 Tình hình sản xuất đậu tương giới Việt Nam 12 2.2.1 Tình hình sản xuất đậu tương giới 12 2.2.2 Tình hình sản xuất đậu tương Việt Nam 14 2.3 Ảnh hưởng cỏ dại trồng 15 2.3.1 Đặc tính cỏ dại 15 2.3.2 Tác hại cỏ dại trồng 17 2.4 Biện pháp phòng trừ cỏ dại 18 2.4.1 Biện pháp học 18 2.4.2 Biện pháp hóa học 20 2.4.3 Biện pháp sinh học 21 2.5 Tình hình sản xuất đậu tương biến đổi gen giới Việt Nam 22 2.5.1 Tình hình đậu tương biến đổi gen giới 22 2.5.2 Tình hình đậu tương biến đổi gen Việt Nam 22 2.6 Một số nghiên cứu đặc tính kháng thuốc diệt cỏ cho trồng 23 2.6.1 Giới thiệu gen kháng thuốc diệt cỏ 23 2.6.2 Cơ chế hoạt động gen kháng thuốc diệt cỏ 23 2.6.3 Tình hình nghiên cứu chuyển gen kháng thuốc diệt cỏ vào trồng 24 PHẦN 3: VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25 3.1 Vật liệu nghiên cứu 25 3.1.1 Vật liệu thực vật 25 3.1.2 Hóa chất dụng cụ thí nghiệm 25 3.1.2.1 Hóa chất 25 3.1.2.2 Thiết bị thí nghiệm 25 3.2 Phạm vi, địa điểm thời gian nghiên cứu 26 n 3.2.1 Phạm vi nghiên cứu 26 3.2.2 Địa điểm thời gian nghiên cứu 26 3.3 Nội dung nghiên cứu 26 3.4 Phương pháp nghiên cứu 26 3.4.1 Phương pháp đánh giá khả kháng thuốc trừ cỏ kháng sâu dòng đậu tương chuyển gen ĐVN9 hệ T1, T2, T3 26 3.4.2 Phương pháp phát gen Bar phương pháp sinh học phân tử 29 3.4.2.1 Phương pháp tách chiết DNA tổng số 29 3.4.2.2 Phương pháp phân tích PCR xác định có mặt gen kháng thuốc diệt cỏ Bar với cặp mồi đặc hiệu 30 3.4.2.3 Phương pháp điện di sản phẩm DNA tổng số PCR sản phẩm 31 PHẦN 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 32 4.1 Đánh giá khả kháng thuốc diệt cỏ đồng ruộng 32 4.1 Kết đánh giá khả kháng thuốc diệt cỏ dòng đậu tương chuyển gen hệ T1 32 4.1.2 Kết đánh giá khả kháng thuốc diệt cỏ dòng đậu tương chuyển gen hệ T2 33 4.1.3 Kết đánh giá khả kháng thuốc diệt cỏ dòng đậu tương chuyển gen hệ T3 36 4.2 Kết tách chiết DNA tổng số từ mẫu đậu tương 38 4.2.1 Kết tách chiết DNA tổng số từ mẫu đậu tương hệ T1 38 4.2.2 Kết tách chiết DNA tổng số từ mẫu đậu tương hệ T2 38 4.2.3 Kết tách chiết DNA tổng số từ mẫu đậu tương hệ T3 39 4.3 Kết PCR kiểm tra có mặt gen bar qua hệ T1, T2 T3 39 4.3.1 Kết PCR kiểm tra có mặt gen bar qua hệ T1 39 4.3.2 Kết PCR kiểm tra có mặt gen bar qua hệ T2 41 4.3.3 Kết PCR kiểm tra có mặt gen bar qua hệ T3 42 PHẦN 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 45 5.1 Kết luận 45 5.2 Đề nghị 45 TÀI LIỆU THAM KHẢO 46 n PHẦN 1: MỞ ĐẦU 1.1 Tính cấp thiết đề tài Đậu tương (Glycine max (L.) Merr.) trồng cạn ngắn ngày phổ biến giới Việt Nam Đậu tương có giá trị dinh dưỡng kinh tế cao Hàm lượng protein trung bình khoảng 35,5- 40%, lipit từ 15- 20%, hydratcacbon từ 1516% nhiều loại vitamin muối khoáng cần thiết Do đậu tương dùng làm thực phẩm cho người, thức ăn chăn nuôi, nguyên liệu công nghiệp, mặt hàng xuất Việc phát triển đậu tương biện pháp nhanh chóng khắc phục tình trạng thiếu hụt protein nước nghèo [4] Riêng Việt Nam nước nông nghiệp nhiệt đới trồng đậu tương với ba mục đích giải vấn đề thiếu protein cho người gia súc, xuất cải tạo đất [11] Hiện nay, nước ta phải nhập đậu tương nhu cầu nước tăng cao Sản lượng sản xuất thấp chưa đủ để cung ứng Một lý dẫn đến sản lượng thấp cỏ dại sâu hại Sâu hại nhân tố thứ ảnh hưởng đến suất, chất lượng đậu tương Đậu tương thường bị loại sâu hại như: sâu lá, sâu đục quả, sâu đục thân, sâu khoang Ngoài ra, Cây đậu tương bị gây hại virus, tuyến trùng côn trùng Những tác nhân gây bệnh sâu hại gây thiệt hại hạt, rễ, thân, lá, cành, thường mô cụ thể [19] Cỏ dại nhân tố thứ hai có tác động trực tiếp đến sinh trưởng phát triển đậu tương Nó cạnh tranh ánh sáng, dinh dưỡng, nước trung gian truyền bệnh cho đậu tương Do vậy, biện pháp phòng trừ cỏ dại sâu hại quan tâm Biện pháp phịng trừ hóa học biện pháp sử dụng thường gây ảnh hưởng xấu đến người mơi trường sinh thái Chi phí cho phịng trừ cỏ dại, sâu hại thiệt hại lớn sản xuất đậu tương [4] Các biện pháp sinh học đại hướng đến cải thiện đặc tính trồng Trong nghiên cứu tăng cường khả kháng thuốc diệt cỏ, kháng sâu biện pháp công nghệ sinh học quan tâm xuất phát từ yêu cầu thực tiễn sản xuất đậu tương giới nước ta Khoa Công nghệ sinh học Công nghệ thực phẩm, trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên thành công việc tạo dòng đậu tương chuyển gen n 10 kháng thuốc diệt cỏ kháng sâu từ giống đậu tương Việt Nam năm 2010 Tuy nhiên biểu gen chuyển chưa nghiên cứu qua hệ Từ thực tế tơi tiến hành thực nghiên cứu đề tài: “Theo dõi khả kháng thuốc diệt cỏ dòng đậu tương chuyển gen ĐVN9 qua hệ T1, T2 T3” n 35 Tương tự cách thực mẫu T1 Tiến hành đánh giá khả kháng thuốc diệt cỏ dòng đậu tương chuyển gen đồng ruộng giai đoạn Kết theo dõi biểu gen kháng thuốc diệt cỏ thông qua biểu bị cháy bị chết sau phun 3- ngày thuốc diệt cỏ Basta 0,3% cho dòng đậu tương chuyển gen hệ T2, kết trình bày qua bảng 4.2 Kết đánh giá khả kháng thuốc diệt cỏ dòng đậu tương chuyển gen hệ T2 thể bảng 4.2 Từ kết theo dõi bảng 4.2 cho thấy tỷ lệ kháng thuốc diệt cỏ Basta 0,3% dòng đậu tương chuyển gen hệ T2 dao động từ 50,0 – 75,0% Dòng kháng cao D12.2, D12.1 D21.3 với tỷ lệ kháng 75,0% So sánh tỷ lệ kháng thuốc diệt cỏ với dịng hệ T1 có chênh lệch đáng kể Nhìn chung, tỷ lệ kháng thuốc diệt cỏ dòng T2 giảm so với tỷ lệ kháng thuốc trừ cỏ dòng T1 Cụ thể tỷ lệ kháng trung bình dòng T2 63,1% cao so với giống đối chứng ĐVN9 không chuyển gen (0,0%) thấp so với tỷ lệ kháng trung bình dịng T1 (80,6%) Trong dịng có tỷ lệ kháng thấp D14.1, D14.5 D21.2 với tỷ lệ kháng 50,0% Hình 4.2 Một số hình ảnh đánh giá kháng thuốc diệt cỏ dòng đậu tương chuyển gen hệ T2 Thí nghiệm kiểm tra kháng thuốc diệt cỏ Basta 0,3% (a, b, c - chuyển gen; d - đối chứng) Hình a: chuyển gen có biểu vàng Hình b, c: chuyển gen có biểu kháng, màu xanh bình thường Hình d: đối chứng có dấu hiệu vàng cháy n 36 4.1.3 Kết đánh giá khả kháng thuốc diệt cỏ dòng đậu tương chuyển gen hệ T3 Bảng 4.3 Kết đánh giá khả kháng thuốc diệt cỏ dòng đậu tương chuyển gen hệ T3 TT Tên dòng Số đánh giá Tỉ lệ Số kháng Số không kháng thuốc kháng thuốc thuốc diệt diệt cỏ diệt cỏ Basta cỏ Basta Basta (%) ĐVN9(Đ/C) 138 138 0,0 D9.1.3 12 6 50,0 D14.2.7 11 54,5 D9.3.4 15 60,0 D14.5.1 16 43,7 D21.1.3 13 46,1 D21.2.4 10 60,0 D12.2.8 10 5 50,0 D14.4.2 14 7 50,0 10 D12.5.6 16 56,2 11 D13.5.3 15 53,3 12 D13.3.6 11 54,5 Tổng 142 76 66 53,5% Ghi chú: tổng số theo dõi, tỷ lệ kháng trung bình tính dòng chuyển gen Tiến hành đánh giá khả kháng thuốc diệt cỏ dòng đậu tương chuyển gen đồng ruộng giai đoạn Kết theo dõi biểu gen kháng thuốc diệt cỏ thông qua biểu bị cháy bị chết sau phun 3- ngày thuốc diệt cỏ Basta 0,3% cho dòng đậu tương chuyển gen hệ T3, kết trình bày qua bảng 4.3 Từ kết theo dõi bảng 4.3 cho thấy, tỷ lệ kháng thuốc diệt cỏ dòng đậu tương chuyển gen hệ T3 biến động khoảng từ 43,7 – 60,0% n 37 Trong đó, dịng có tỷ lệ kháng cao D9.3.4 D21.2.4 (60%), tỷ lệ kháng thấp D14.5.1 (43,7%) Nhìn chung, tỷ lệ giảm so với tỷ lệ kháng dòng T1 T2 Tỷ lệ kháng thuốc diệt cỏ trung bình dịng T3 53,5%, cao so với dịng đối chứng ĐVN9 khơng chuyển gen (0,0%), thấp tỷ lệ kháng trung bình dịng T2 (63,1%) T1 (80,6%) Hình 4.3 Một số hình ảnh đánh giá kháng thuốc diệt cỏ dịng đậu tương chuyển gen hệ T3 Thí nghiệm kiểm tra kháng thuốc diệt cỏ Basta 0,3% (a, b, c - chuyển gen; d - đối chứng) Hình a, c: chuyển gen có biểu kháng thuốc diệt cỏ, xanh tốt Hình b: chuyển gen có biểu bị vàng Hình d: đối chứng không chuyển gen bị vàng, cháy Dùng phản ứng chuỗi polymerase (PCR), phản ứng nhuộm β glucuronidase (GUS) để phát đoạn chèn biểu gen chuyển, dùng phương pháp đơn giản bôi lên với dung dịch Basta 135mg /L xác định hiệu biến nạp gen (Zhang-yue Song cs, 2013) [20] Hình 4.4 Phương pháp đánh giá kháng thuốc trừ cỏ Zhang-yue Song cs Thí nghiệm kiểm tra khả kháng thuốc diệt cỏ Basta 135mg/L (b,c – kháng; a,d – không kháng) n 38 4.2 Kết tách chiết DNA tổng số từ mẫu đậu tương Sau trồng đậu tương chuyển gen hệ T1, T2 T3 tiến hành thu đậu tương ngẫu nhiên cá thể dòng, dịng thời kì 50 ngày sau gieo trồng Tiến hành tách chiết theo phương pháp CTAB Saghai Maroof (1984) [30] 4.2.1 Kết tách chiết DNA tổng số từ mẫu đậu tương hệ T1 Tiến hành tách chiết DNA từ mẫu đậu tương chuyển gen hệ T1 Kết thu DNA tổng số thể qua hình 4.5 Hình 4.5 Sản phẩm DNA tổng số dịng đậu tương hệ T1 Đường chạy từ đến tương ứng với dòng chuyển gen là: D9.3, D14.4, D21.1, D13.5, D12.5, D21.6 Kết hình cho thấy, đường chạy xuất băng DNA rõ nét, nằm gần giếng điện di Chứng tỏ việc tách chiết DNA dòng đậu tương thành công DNA đủ điều kiện để dùng cho nghiên cứu 4.2.2 Kết tách chiết DNA tổng số từ mẫu đậu tương hệ T2 Mẫu DNA tách chiết từ mẫu đậu tương hệ T2 điện di kiểm tra gel agarose 0,8% Kết thể qua hình 4.6 Hình 4.6 Sản phẩm DNA tổng số dòng đậu tương hệ T2 n 39 Đường chạy từ đến 10 tương ứng với dòng chuyển gen là: D9.3.4, D9.4.3, D14.4.2, D14.2.7, D21.1.3, D21.2.4, D13.5.3, D13.3.6, D12.5.6, D12.2.8 Kết hình cho thấy, đường chạy xuất băng DNA rõ nét, nằm gần giếng điện di Chứng tỏ việc tách chiết DNA dịng đậu tương thành cơng DNA đủ điều kiện để dùng cho nghiên cứu 4.2.3 Kết tách chiết DNA tổng số từ mẫu đậu tương hệ T3 Mẫu DNA tách chiết từ mẫu đậu tương hệ T2 điện di kiểm tra gel agarose 0,8% Kết thể qua hình 4.7 Hình 4.7 Sản phẩm DNA tổng số dòng đậu tương hệ T2 Đường chạy từ đến 10 tương ứng với dòng chuyển gen là: D9.1.3.1, D9.3.4.6, D14.2.7.5, D14.5.1.3, D21.1.3.6, D21.2.4.8, D12.2.8.3, D12.5.6.9, D13.5.3.4, D13.3.6.5 Kết hình cho thấy, đường chạy xuất băng DNA rõ nét, nằm gần giếng điện di Chứng tỏ việc tách chiết DNA dòng đậu tương thành công DNA đủ điều kiện để dùng cho nghiên cứu 4.3 Kết PCR kiểm tra có mặt gen bar qua hệ T1, T2 T3 4.3.1 Kết PCR kiểm tra có mặt gen bar qua hệ T1 Lấy Mẫu DNA tách chiết từ đậu tương hệ T1, T2 T3 có đủ tiêu chuẩn để làm khuôn cho phản ứng PCR với cặp mồi bar F – bar R Sản phẩm PCR điện di kiểm tra gel agarose 0,8% Kết PCR kiểm tra có mặt gen bar hệ T1 thể hình 4.8 n 40 Hình 4.8 Kết điện di kiểm tra sản phẩm PCR gen bar hệ T1 Đường chạy từ đến tương ứng với dòng chuyển gen là: D9.3, D14.4, D21.1, D13.5, D12.5, D21.6 M: thang chuẩn DNA 1kb (fermentas) Đường chạy số 1: mẫu DNA dòng ĐVN9 không chuyển gen Đường chạy số 2: mẫu Plasmid tái tổ hợp mang gen bar Kết điện di kiểm tra sản phẩm PCR hình 4.8 cho thấy, đường chạy số 3, 4, 5, 6, 7, xuất băng DNA nhất, rõ nét có kích thước 408bp tương ứng với kích thước sản phẩm PCR từ mẫu Plasmid tái tổ hợp mang gen bar (đường chạy số 2) Phù hợp với kích thước sản phẩm khuếch đại vùng gen bar với cặp mồi Bar F – Bar R theo lý thuyết Kết chứng tỏ, dòng: D9.3, D14.4, D21.1, D13.5, D12.5, D21.6 có mặt gen bar hệ gen Dịng ĐVN9 không chuyển gen (đường chạy số 1) không xuất sản phẩm PCR chứng tỏ dịng khơng mang gen bar hệ gen Bảng 4.4 Kết phân tích PCR hệ T1 STT Tên dòng Kết PCR với gen bar ĐVN9(Đ/C) - Plasmid + D9.3 + D14.4 + D21.1 + D13.5 + D12.5 + D21.6 + n 41 4.3.2 Kết PCR kiểm tra có mặt gen bar qua hệ T2 Kết PCR kiểm tra có mặt gen bar hệ T2 thể hình 4.9 Hình 4.9 Kết điện di sản phẩm PCR gen bar hệ T2 Đường chạy từ đến 12 tương ứng với dòng chuyển gen là: D9.3.4, D9.4.3, D14.4.2, D14.2.7, D21.1.3, D21.2.4, D13.5.3, D13.3.6, D12.5.6, D12.2.8 M: thang chuẩn DNA 1kb (fermentas) Đường chạy số 1: mẫu DNA dòng ĐVN9 không chuyển gen Đường chạy số 2: mẫu Plasmid tái tổ hợp mang gen bar Kết điện di kiểm tra sản phẩm PCR hình 4.8 cho thấy, đường chạy số 3, 4, 5, 6, 7, 10, 11, 12 xuất băng DNA nhất, rõ nét có kích thước 408bp tương ứng với kích thước sản phẩm PCR từ mẫu Plasmid tái tổ hợp mang gen bar (đường chạy số 2) Phù hợp với kích thước sản phẩm khuếch đại vùng gen bar với cặp mồi Bar F – Bar R theo lý thuyết Kết chứng tỏ, dòng: D9.3.4, D9.4.3, D14.4.2, D14.2.7, D21.1.3, D13.3.6, D12.5.6, D12.2.8 có mặt gen bar hệ gen Dịng ĐVN9 khơng chuyển gen (đường chạy số 1) dòng D21.2.4, D13.5.3 (đường chạy số 9) khơng xuất sản phẩm PCR chứng tỏ dịng không mang gen bar hệ gen Từ kết khẳng định dịng D9.3, D14.4, D21.1, D13.5, D12.5, D21.6 có kiểu gen đồng hợp dị hợp tử Kết trình bày qua bảng 4.5 n 42 Bảng 4.5 Kết phân tích PCR hệ T2 STT Tên dòng Kết PCR với gen bar ĐVN9(Đ/C) - Plasmid + D9.3.4 + D9.4.3 + D14.4.2 + D14.2.7 + D21.1.3 + D21.2.4 - (giả) D13.5.3 - 10 D13.3.6 + 11 D12.5.6 + 12 D12.2.8 + 4.3.3 Kết PCR kiểm tra có mặt gen bar qua hệ T3 DNA tách chiết dùng làm khuôn cho phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu sản phẩn PCR điện di kiểm tra gel agarose 0,8% Kết PCR kiểm tra có mặt gen bar hệ T2 thể hình 4.10 Hình 4.10 Kết điện di sản phẩm PCR gen bar hệ T3 Đường chạy từ đến 12 tương ứng với dòng chuyển gen là: D9.1.3.1, D9.3.4.6, D14.2.7.5, D14.5.1.3, D21.1.3.6, D21.2.4.8, D12.2.8.3, D12.5.6.9, D13.5.3.4, D13.3.6.5 M: thang chuẩn DNA 1kb (fermentas) Đường chạy số 1: mẫu DNA dịng ĐVN9 khơng chuyển gen Đường chạy số 2: mẫu Plasmid tái tổ hợp mang gen bar n 43 Kết điện di kiểm tra sản phẩm PCR hình 4.10 cho thấy, đường chạy số 3, 5, 6, 8, 10 12 xuất băng DNA nhất, rõ nét có kích thước 408bp tương ứng với kích thước sản phẩm PCR từ mẫu Plasmid tái tổ hợp mang gen bar (đường chạy số 2) Phù hợp với kích thước sản phẩm khuếch đại vùng gen bar với cặp mồi Bar F – Bar R theo lý thuyết Kết chứng tỏ, dòng: D9.1.3.1, D14.2.7.5, D14.5.1.3, D21.2.4.8, D12.5.6.9, D13.3.6.5 có mặt gen bar hệ gen Các dịng D9.3.4.6 (đường chạy số 4), D21.1.3.6 (đường chạy số 7), D12.2.8.3 (đường chạy số 9), D13.5.3.4 (đường chạy số 11) dịng ĐVN9 khơng chuyển gen (đường chạy số 1) khơng xuất sản phẩm PCR chứng tỏ dịng không mang gen bar hệ gen Tuy nhiên, dịng D21.2.4 âm tính, dịng D21.2.4.8 dương tính nên dịng D21.2.4 âm tính giả dịng D21.2.4.8 dương tính giả Kết trình bày qua bảng 4.6 Bảng 4.6 Kết phân tích PCR hệ T3 STT Tên dòng Kết PCR với gen bar ĐVN9(Đ/C) - Plasmid + D9.1.3.1 + D9.3.4.6 - D14.2.7.5 + D14.5.1.3 + D21.1.3.6 - D21.2.4.8 + (giả) D12.2.8.3 - 10 D12.5.6.9 + 11 D13.5.3.4 - 12 D13.3.6.5 + n 44 Qua bảng 4.4, 4.5 4.6 cho thấy, biểu gen bar đậu tương có phân ly qua hệ Điều gen chuyển chèn vào hệ gen vị trí khác nhiễm sắc thể Sự phân ly tính trạng hệ sau gen chuyển vào trạng thái dị hợp tử, trạng thái đồng hợp lặn không mang gen Mặt khác, gen chuyển bị bất hoạt khơng biểu tính trạng [25] Có thể đánh giá xác có mặt gen chuyển khả biểu chuyển gen phương pháp PCR Southern blot Số lượng biểu gen đưa vào hệ gen đậu tương phân tích, định lượng phản ứng PCR định lượng (qPCR) Southern blot với mẫu DNA tách chiết rễ [20] n 45 PHẦN 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.1 Kết luận Qua thời gian theo dõi, đánh giá hiệu chuyển gen bar vào giống đậu tương ĐVN9 khoa Công nghệ Sinh học Công nghệ Thực phẩm, trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên tạo năm 2010, đưa số kết luận sau: 1) Đã đánh giá hiệu chuyển gen kháng thuốc diệt cỏ số dòng đậu tương chuyển gen ĐVN9 đồng ruộng qua hệ T1, T2 T3 Kết cho thấy khả kháng thuốc diệt cỏ biểu di truyền không ổn định qua hệ 2) Đã tách chiết thành công DNA từ mẫu đậu tương hệ T1, T2 T3 3) Đã kiểm tra có mặt gen bar số dòng đậu tương chuyển gen qua hệ T1, T2 T3 thông qua kỹ thuật PCR Kết cho thấy di truyền gen bar có phân ly qua hệ 5.2 Đề nghị Từ kết nghiên cứu khả kháng thuốc diệt cỏ dòng đậu tương chuyển gen ĐVN9 hệ T1, T2, T3 chúng tơi có số đề nghị sau: Tiếp tục thí nghiệm đánh giá hiệu chuyển gen hệ ngồi đồng ruộng Tiếp tục phân tích PCR, đánh giá phương pháp lai Southern blot để theo dõi biểu di truyền gen bar dòng khác Tiến hành chuyển gen kháng thuốc diệt cỏ gen quan tâm khác vào giống đậu tương khác nước ta n 46 TÀI LIỆU THAM KHẢO I Tiếng việt Đỗ Thị Kiều An (2006), Cỏ dại biện pháp kiểm soát, Nxb Đại học Tây Nguyên 2 Lê Trần Bình (2008), Phát triển trồng chuyển gen Việt Nam, Nxb Khoa học tự nhiên Công nghệ Bộ NN&PTNT (2001), Quy phạm khảo nghiệm giống đậu tương, tuyển tập tiêu chuẩn NNVN, T1, Nxb Nông nghiệp, Hà Nội, tr 105-108 Ngơ Thế Dân, Trần Đình Long, Trần Văn Lai, Đỗ Thị Dung, Phạm Thị Dao (1999), Cây đậu tương, Nxb Nông Nghiệp Hà Nội Nguyễn Tiến Dũng (2010), “Nghiên cứu biến nạp gen vào đậu tương (Glycine max (L.) Merill) thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens”, Luận văn thạc sĩ sinh học, Thái nguyên Nguyễn Tiến Dũng, Nguyễn Thị Hoài Thương, Lã Văn Hiền, Bùi Tri Thức, Nguyễn Thị Mão, Park Young Hun, Young Soo Chung, Ngơ Xn Bình (2012), “Đánh giá hiệu chuyển gen kháng thuốc diệt cỏ đậu tương [Glycine max (L.) Merr.]”, Kỉ yếu hội thảo quốc gia bệnh hại thực vật Việt Nam năm 2012, tr.344350 Trần Văn Điền (2007), Giáo trình đậu tương, Nxb Nơng Nghiệp, Hà Nội Phạm Thành Hổ (2008), Nhập môn công nghệ sinh học, Nxb Giáo dục Lê Thị Ánh Hồng (2000) Cơ sở khoa học công nghệ chuyển gen thực vật, Nxb Nông Nghiệp Hà Nội 10 Nguyễn Thị Thúy Hường, Trần Thị Ngọc Diệp, Nguyễn Thu Hiền, Chu Hoàng Mậu, Lê Văn Sơn, Chu Hoàng Hà (2009), “Phát triển hệ thống tái sinh invitro đậu tương (Glycine max (L.) Merill) phục vụ cho chuyển gen”, Tạp chí khoa học cơng nghệ, tr.82-83 11 Chu Hoàng Mậu, Nguyễn Thị Thuý Hường, Nguyễn Vũ Thanh Thanh, Chu Hồng Hà (2011) Gen đặc tính chịu hạn đậu tương, Nxb Đại học Quốc gia Hà Nội n 47 12 Đinh Thị Ngọc, Chu Hoàng Mậu, Bùi Thị Tuyết, Phạm Thị Thanh Nhàn (2008), “Nghiên cứu khả chịu hạn tách dòng gen choperonin số giống đậu tương (Glycine max.Merill) địa phương vùng Tây Ngun”, Tạp chí Cơng nghệ sinh học 6(1):79-88 13 Chu Thị Thơm, Phạm Thị Lài, Nguyễn Văn Tó (2006), Kĩ Thuật phịng trừ cỏ dại, Nxb Lao Động, Hà Nội 14 Trần Thị Cúc Hòa (2008), “Hiệu tạo dòng đậu tương biến đổi gen từ giống MTĐ 176, HL 202, Maverick William 82 phương pháp nốt mầm qua trung gian Agrobacterium tumefaciens”, Tạp chí Nơng nghiệp & Phát triển nơng thơn (1):14 - 19 15 Tổng cục thống kê (2012), Niên giám thống kê (2012), Nxb thống kê, Hà Nội 16 Trung tâm thơng tin PTNNNT-Viện sách chiến lược PTNNNT-Bộ Nơng nghiệp & PTNT (2010), Bản tin tháng 3/2010 ngành hàng lương thực, Bộ NN&PPNT, Hà Nội 17 Nguyễn Phước Tuyên (2011), “Giống kháng thuốc trừ cỏ, hướng quản lí cỏ dại hiệu quả”, Phịng nghiên cứu khoa học thơng tin, sở Nông nghiệp phát triển nông thôn tỉnh Đồng Tháp 18 Phạm Văn Thiều (2002), Cây đậu tương kỹ thuật trồng chế biến sản phẩm, Nxb Nông nghiệp, Hà Nội II Tiếng Anh 19 Aleksandra (2011) “Genetically Modified Soybean for Insect-pests and Disease Control”, Intech 20 Cibelle Engels, Renata Fuganti – Pagliarini, Silvana Regina RockenbachMarin, Francismar Corrêa Marcelino – Guimarães, Maria Cristina Neves Oliveira, Norihito Kanamori, JunyaMizoi, Kazuo Nakashima, Kazuko Yamaguchi Shinozaki and Alexandre Lima Nepomuceno (2013) “Introduction of the rd29A:AtDREB2A CA gene into soybean (Glycine max L Merril) and its molecular characterization in leaves and roots during dehydration” 21 FAOSTAT (2012), Agricultural data, available from: http://faostat.fao.org 02 september 2010.Clive James (2009), “Global Status of Commercialized n 48 Biotech/GM Crops, 2009”, ISAAA Brief No 41, International Service for the Acquisition of Agri-Biotech Applications, Ithaca, NY, USA 22 James C (2008) “Global status of commercialized biotech/ GM Crop’’, ISAAA Brief No, 37, International Service for the Acquisition of Agri- Biotech application, Ithaca, NY, USA 23 Jerry M.Green (2009) “Evolution of glyphosate-resistant crop technology”, Weed Science 57:108–117 24 Ottawa, Ontario, (1996), The Biology of Glycine max (L.) Merr (Soybean), Canadian food inspection Agency 25 Stanton B Gelvin (2003), “Agrobacterium-Mediated Plant Transformation: the Biology behind the “Gene-Jockeying”, Tool, Microbiology and Molecular Biology Reviews, V.67, p16-37 26 Tadayoshi Masuda and Peter D.Goldsmith (2009), ’’World Soybean Production: Area Harvested, Yield, and Long-Term Projections’’, International Food and Agribusiness Management Review ,Volume 12, pp 143-162 27 Charles J.Thompson, N.Rao Moval, Richard Tizard, Reto Crameri, Julian E.Davies, Marc Lauwereys and Johan Botterman (1987), “Characterization of the herbicide-resistance gene bar from Streptomyces hygroscopicus”, The EMBO Journal vol.6, no.9, pp.2519 28 Zhang-yue Song, Jing-luan Tian, Wei-zhe Fu, Lin Li, Ling-hong Lu, Lian Zhou, Zhi-hui Shan, Gui-xiang Tang and Hui-xia Shou (2013) “Screening Chinese soybean genotypes for Agrobacterium-mediated genetic transformation suitability” 29 Margine M.Paz, Juan Carlos Martinez, Andrea B.Kalvig, Tina M.Fonger, Kan Wang (2005) Improved cotyledonary node method using an alternative explant derived from mature seed for efficient Agrobacterium-Mediated soybean transformation, Plant CellRep,206-213 30 Saghai-Maroof, M.A.,K.M Soliman, R.A Jorgensen and R.W Allard., (1984) Ribosomal DNA spacer-length polymorphism in barley: Mendelian inheritance, chromosomal location, and population dynamics.Proc Natl Acad Sci USA 81, pp 8014-8019 n 49 31 Paz M., Martinez J C., Kalvig A., Fonger T and Wang K (2006), “Agrobacterium - mediated transformation of soybean and recovery of transgenic soybean plants” , Iowa State University 25: 206 - 213 n ... giá khả kháng thuốc diệt cỏ dòng đậu tương chuyển gen hệ T3 Bảng 4.3 Kết đánh giá khả kháng thuốc diệt cỏ dòng đậu tương chuyển gen hệ T3 TT Tên dòng Số đánh giá Tỉ lệ Số kháng Số không kháng thuốc. .. kháng thuốc diệt cỏ đồng ruộng 32 4.1 Kết đánh giá khả kháng thuốc diệt cỏ dòng đậu tương chuyển gen hệ T1 32 4.1.2 Kết đánh giá khả kháng thuốc diệt cỏ dòng đậu tương chuyển gen hệ. .. hệ T1, T2 T3 3.4 Phương pháp nghiên cứu 3.4.1 Phương pháp đánh giá khả kháng thuốc trừ cỏ kháng sâu dòng đậu tương chuyển gen ĐVN9 hệ T1, T2, T3 - Thí nghiệm 1: Theo dõi khả kháng thuốc trừ cỏ