PHÁT TRIỂN PHƢƠNG PHÁP QUECHERS CẢI TIẾN ĐỂ XÁC ĐỊNH DƢ LƢỢNG 9 THUỐC TRỪ SÂU THƢỜNG PHUN TRÊN RAU BẰNG KỸ THUẬT HPLC/DAD Nguyễn Thị Ngọc Vân*, Nguyễn Huỳnh Kim Ngân, Nguyễn Huỳnh Phương Uyên, Nguyễn[.]
PHÁT TRIỂN PHƢƠNG PHÁP QUECHERS CẢI TIẾN ĐỂ XÁC ĐỊNH DƢ LƢỢNG THUỐC TRỪ SÂU THƢỜNG PHUN TRÊN RAU BẰNG KỸ THUẬT HPLC/DAD Nguyễn Thị Ngọc Vân*, Nguyễn Huỳnh Kim Ngân, Nguyễn Huỳnh Phương Uyên, Nguyễn Thanh Huy, Phạm Thị Tố Liên, Nguyễn Thị Thu Trâm, Lê Thị Nhân Duyên Trường Đại học Y Dược Cần Thơ *Email: ntnvan@ctump.edu.vn TÓM TẮT Đặt vấn đề: Sự lạm dụng thuốc trừ sâu rau dẫn đến dư lượng thuốc trừ sâu cao vượt mức cho phép làm ảnh hưởng đến sức khỏe người Mục tiêu: xây dựng quy trình định lượng thuốc trừ sâu thuộc nhóm tiêu biểu carbamate, lân hữu cúc tổng hợp, xử lý mẫu QuEChERS cải tiến Đối tượng phương pháp: loại rau sử dụng làm mẫu giả lập, phương pháp QuEChERS cải tiến để xử lý làm mẫu, mẫu phân tích HPLC-DAD cột pha đảo Kết quả: điều kiện sắc ký: cột C18 (150 x 4,6 mm; µm); pha động: acetonitril nước với chương trình gradient, quy trình thẩm định với độ thu hồi phương pháp từ 89,54 – 108,4% với RSD thấp 11%, giá trị LOD 0,167ppm Kết luận: phương pháp xử lý mẫu QuEChERS cải tiến, quy trình xây dưng thẩm định đạt yêu cầu, phương pháp ứng dụng để xác định mẫu rau nhiễm dư lượng thuốc TTS thị trường Từ khóa: dư lượng thuốc trừ sâu, QuEChERS cải tiến, rau ABSTRACT DEVELOPMENT MODIFIED QUECHERS TO DETERMINE POPOLAR PESTICIDES IN VEGETABLE BY HPLC-DAD Nguyen Thi Ngoc Van*, Nguyen Huynh Kim Ngan, Nguyen Huynh Phuong Uyen Nguyen Thanh Huy, Pham Thi To Lien, Nguyen Thi Thu Tram, Le Thi Nhan Duyen Can Tho University of Medicine and Pharmacy Background: The use of pesticides unreasonable cause pesticide residues in vegetables above the maximum residue limits can negatively affect human health Objectives: A HPLC-DAD was developed for determination of pesticides using modified QuEChERS Materials and Method: kinds of leafy vegetables, Pesticides residue were extracted from samples using modified QuEChERS Result:The chromatography was performed as: column - C18 (150 x 4,6 mm; µm); Mobile phase consists of acetonitrile and water in gradient mode; diode array detector The recoveries range between 89.54 – 108.4% with RSD less than 11% and the limit of detection was 0.167ppm Conclusion: The validation results show that method is suitable for the analysis of residue pesticide in leafy vegetables Từ khóa: residuce pesticides, modified QuEChERS, leafy vegetables I ĐẶT VẤN ĐỀ Khí hậu Việt Nam khí hậu nhiệt đới gió mùa nóng ẩm quanh năm điều kiện thuận lợi cho cho phát triển trồng Tuy nhiên, môi trường tốt cho phát sinh phát triển sâu bệnh, cỏ dại gây hại cho trồng, đặc biệt rau Theo chương trình giám sát quốc gia tồn dư thuốc bảo vệ thực vật rau từ 2008 đến năm 2012 cho thấy: nhóm rau ăn có nguy nhiễm sâu bệnh cao rau ăn quả, đó, loại rau có nguy cao gồm rau ngót, rau muống, cải xanh, đậu đỗ…[1] Với tâm lý muốn phòng ngừa dịch hại, diệt sâu nhanh, gia tăng suất trồng nên người nông dân thường tăng liều lượng, phối trộn nhiều loại thuốc không tuân thủ thời gian cách ly [2], dẫn đến nguy gây ngộ độc cấp thuốc trừ sâu gây ô nhiễm môi trường nước, đất Qua khảo sát Cục bảo vệ thực vật số địa phương cho thấy 30% lượng thuốc pha chế không liều lượng gần 3% sử dụng thuốc TTS không nằm danh mục cho phép [3] Do đó, cần có biện pháp quản lý nhà nước việc tra, kiểm tra tuyên truyền nhằm nâng cao ý thức người dân việc sử dụng thuốc trừ sâu Nhằm phục vụ cho công tác kiểm tra chất lượng nông sản chợ đầu mối, chợ bán lẻ nơng sản, cần có quy trình định lượng thuốc trừ sâu thường sử dụng Phương pháp thường áp dụng phương pháp QuEChERS xử lý mẫu tiến hành phân tích hệ thống máy LC/MS/MS GC/MS/MS [4-7] Tuy nhiên, hai thiết bị đắt tiền, không phổ biến trung tâm quản lý chất lượng tỉnh Do đó, nhóm nghiên cứu tiến hành xây dựng quy trình định lượng thuốc trừ sâu thuộc nhóm tiêu biểu carbamate, lân hữu cúc tổng hợp, xử lý mẫu QuEChERS cải tiến phân tích hệ thống sắc ký lỏng hiệu cao, đầu dò DAD nhằm mục đích ứng dụng quy trình định lượng rộng rãi tỉnh II NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Nguyên liệu Các dung môi methanol, acetonitril, nước cất đạt chuẩn HPLC (Merk- Đức); hóa chất acid acetic, MgSO4, NaCl khan, natri acetate, than hoạt - GCB, chất hấp phụ PSA (primary secondary amines), chất hấp phụ C18 Chất chuẩn gồm thuốc TTS: thiamethoxam (TMX), imidacloprid (IMD), acetamprid (ACT), chloarantraniliprole (CLR), fenobucarb (FEB), fenamiphos (FENA), chlorpyriphos methyl (CPR-M), chlorpyriphos ethyl (CPR-ET), alpha cypermethrin (ACP) hãng Dr Ehrenstofer 2.2 Thiết bị Máy sắc ký lỏng HPLC, đầu dò DAD, hãng Agilent (Mỹ) 2.3 Đối tƣợng Mẫu trắng: hỗn hợp loại rau ăn (cải xanh, cải ngọt, xà lách xoong) tạo cách xay đồng lượng, khơng sử dụng hóa chất TTS Mẫu giả lập chuẩn bị cách thêm chất phân tích với nồng độ xác định vào mẫu trắng 2.4 Phƣơng pháp nghiên cứu Nhằm thuận lợi cho việc xử lý mẫu, chia nhóm thuốc trừ sâu thành nhóm theo độ tan độ phân cực Nhóm TTS phân cực (PC) bao gồm thiamethoxam, acetamiprid, imidachloprid, chlorantraniliprole, fenobucarb; nhóm TTS phân cực (KPC) bao gồm fenamiphos, chlorpyriphos methyl, clorpyriphos ethyl, alpha cypermethrin Xây dựng quy trình chiết làm mẫu Chuẩn bị mẫu: rau sau loại bỏ rễ đất bám, xay đồng mẫu, cân 10g ± 0.05g mẫu vào ống ly tâm 50ml cân kỹ thuật, bảo quản mẫu túi PE, -18 độ C Khảo sát dung mơi chiết: với nhóm TTS PC, khảo sát loại hỗn hợp dung mơi chiết có thành phần gồm acetonitrile nước với tỉ lệ acetonitrile thay đổi 50%, 80% 100%; nhóm TTS KPC khảo sát loại dung môi chiết acetonitrile acetonitrile 1% acid acetic Khảo sát muối tách nước: dựa quy trình xử lý mẫu Quechers tiêu chuẩn theo AOAC, tiến hành khảo sát muối tách nước, nhằm tối ưu hóa phân tách lớp acetonitrile chứa chất phân tích với lớp nước hịa tan tạp phân cực Cụ thể, với quy trình TTS PC khảo sát hỗn hợp muối gồm (6g Na2SO4 + 1.5g NaCl), (6g MgSO4 + 1.5g NaCl); với quy trình TTS KPC khảo sát hỗn hợp muối gồm (6g MgSO4 + 1.5g NaCl), (6g MgSO4, 1.5g CH3COONa) Làm dịch chiết: sử dụng chất hấp phụ bao gồm PSA, C18 GCB với khối lượng tỉ lệ thay đổi Đánh giá kết quả: dựa vào thơng số tỉ lệ diện tích đỉnh chất phân tích/diện tích đỉnh tạp Xây dựng quy trình sắc ký tách định lƣợng chất Khảo sát thông số thành phần tỉ lệ pha động, chương trình rửa giải isocratic gradient, tốc độ dịng, bước sóng định lượng Thẩm định quy trình Quy trình định lượng thẩm định theo hướng dẫn chung AOAC rau, bao gồm tính tương thích hệ thống, tính đặc hiệu, độ xác (độ lặp lại, độ xác trung gian), khoảng tuyến tính – miền giá trị, LOD, LOQ độ [8] ng dụng quy trình đ thẩm định, định lượng thuốc trừ sâu mẫu rau thu chợ bán lẻ, chợ đầu mối siêu thị, cửa hàng tiện lợi địa bàn thành phố Cần Thơ III KẾT QUẢ 3.1 Kết xây dựng quy trình chiết làm mẫu Quy trình xử lý mẫu tối ưu cho nhóm TTS PC KPC là: Hình Quy trình xử lý mẫu TTS PC (cột trái) TTS KPC (cột phải) 3.2 Kết xây dựng quy trình sắc ký tách định lƣợng chất Pha tĩnh: Cột Kromasil C18 (4.6 × 150 mm; µm); tốc độ dịng: ml/phút; thể tích tiêm mẫu 20 µl Pha động hỗn hợp acetonitrile nước với tỉ lệ thay đổi theo chương trình rửa giải gradient Thời gian phân tích 15 phút với quy trình TTS PC 11 phút với quy trình TTS KPC bước sóng định lượng bao gồm 210nm (chlorantraniliprole, fenobucarb, fenamiphos), 225nm (Chlorpyriphos methyl, chlorpyriphos ethyl, alpha cypermethrin), 245nm (thiamethoxam, acetamipride) 270nm (imidaclopride) Hình Điều kiện sắc ký tối ưu nhóm TTS PC Điều kiện sắc ký: pha động ACN nước, tốc độ dịng 1ml/phút, chương trình gradient 0-2 phút 30% ACN, 2-8 phút 90% ACN, 8-9 phút 90% ACN, 9-11 phút 100% ACN, 11-12 phút 30% ACN, 12-15 phút 30% ACN 3.3 Kết thẩm định quy trình phân tích Hình Điều kiện sắc ký tối ưu nhóm TTS KPC Điều kiện sắc ký: pha động ACN nước, tốc độ dịng 1ml/phút, chương trình gradient 0-1 phút 50% ACN, 1-2 phút 80% ACN, 2-6 phút 100% ACN, 6-7.5 phút 100% ACN, 7.5-8 phút 50% ACN, 8-11 phút 30% ACN Tính phù hợp hệ thống Tiêm lần lặp lại hỗn hợp chuẩn thuốc TTS có nồng độ 10 µg/ml Kết cho thấy RSD thời gian lưu diện tích đỉnh thấp (