Luận văn tốt nghiệp nghiên cứu phát hiện sự có mặt của khuẩn e coli cũng như một số chủng khuẩn thường gặp trong các mẫu nước thải

TRƯỜNG ĐẠI HỌC ĐIỆN LỰC KHOA QUẢN LÝ MÔI TRƯỜNG - - BÁO CÁO THỰC TẬP TỐT NGHIỆP “ Nghiên cứu, phát có mặt khuẩn E.coli số chủng khuẩn thường gặp mẫu nước thải ” Giáo viên hướng dẫn : TS TRỊNH NGỌC TUẤN Hướng dẫn thực tập : TS HỒ TÚ CƯỜNG LÂM THƯƠNG THƯƠNG Sinh viên thực : NGUYỄN THỊ NGỌC ÁNH Mã sinh viên : 1481950006 Lớp : D9-QLMT Hà Nội – 9/2018 LỜI CẢM ƠN   Lời em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới Ban lãnh đạo Viện Cơng Nghệ Mơi Trường, TS Hồng Thị Yến, TS Bùi Văn Ngọc – Trưởng phịng Thí nghiệm Trọng điểm Cơng nghệ gen cho phép tạo điều kiện cho em hoàn thành đợt thực tập Tiếp theo cho em gửi lời chân thành cảm ơn tới chị Lâm Thương Thương, anh Tơ Hồng Cường tồn thể anh chị phịng Thí nghiệm Trọng điểm Cơng Nghệ Gen tận tình giúp đỡ, bảo, truyền đạt cho em kiến thức kinh nghiệm quý báu suốt thời gian thực tập vừa qua Em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới Ban chủ nhiệm Khoa công nghệ sinh học – Học viện Nơng nghiệp Hà Nội, TS Nguyễn Hữu Đức – Phó trưởng khoa, Trưởng Bộ môn Công nghệ sinh học động vật tạo điều kiện giới thiệu em sang Viện Công Nghệ Môi Trường – môi trường học tập nghiên cứu tốt để em hoàn thành đợt thực tập Cuối cho em gửi lời cảm ơn tới tất người thân gia đình, bạn nhóm thực tập bạn bè ln dành tình cảm, ủng hộ, động viên tạo điều kiện tốt để em học tập hồn thành tốt cơng việc thời gian thực tập Em xin chân thành cảm ơn ! Hà Nội, ngày 27 tháng năm 2018 Ký tên PHẦN I: GIỚI THIỆU Viện Công nghệ sinh học (Institute of Biotechnology, IBT), trực thuộc Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam (Vietnam Academy of Science and Technology, VAST), viện nghiên cứu đầu ngành công nghệ sinh học Việt Nam Viện có đội ngũ đơng đảo nhà khoa học đào tạo chuyên sâu nước lĩnh vực khác công nghệ sinh học đại.  Nhiệm vụ Viện nghiên cứu vấn đề khoa học công nghệ thuộc lĩnh vực: công nghệ gen, công nghệ tế bào động vật, công nghệ tế bào thực vật, công nghệ vi sinh, công nghệ protein enzyme, công nghệ sinh học môi trường, công nghệ sinh học biển, công nghệ vật liệu sinh học, công nghệ sinh học nano, công nghệ sinh – y học, tin sinh học lĩnh vực khác có liên quan Viện đơn vị triển khai, ứng dụng chuyển giao kết nghiên cứu khoa học công nghệ mới; tổ chức sản xuất, kinh doanh, tư vấn, dịch vụ công nghệ sinh học lĩnh vực liên quan vào thực tiễn sản xuất đời sống, góp phần xây dựng phát triển ngành công nghiệp sinh học Viện sở đào tạo nhân lực khoa học cơng nghệ có trình độ cao, tổ chức đào tạo sau đại học tham gia đào tạo đại học sinh học công nghệ sinh học Viện cung cấp thông tin, tư vấn, bồi dưỡng nâng cao trình độ cán lĩnh vực sinh học công nghệ sinh học Viện tiến hành nhiệm vụ hợp tác quốc tế sinh học công nghệ sinh học lĩnh vực liên quan: trao đổi cán bộ; cử cán đào tạo ngắn hạn dài hạn (thực tập sinh, thạc sỹ, tiến sỹ sau tiến sỹ);  tham gia chương trình/dự án hợp tác khoa học công nghệ với nước; tham gia tổ chức hội nghị, hội thảo quốc tế I LỊCH SỬ THÀNH LẬP Lịch sử thành lập Viện Cơng nghệ sinh học chia làm giai đoạn sau: PHÒNG SINH VẬT, VIỆN NGHIÊN CỨU KHOA HỌC TỰ NHIÊN, ỦY BAN KHOA HỌC VÀ KỸ THUẬT NHÀ NƯỚC (1967-1975) Phòng Sinh vật trực thuộc Viện Nghiên cứu Khoa học Tự nhiên, Ủy ban Khoa học Kỹ thuật Nhà nước, thành lập năm 1967, GS.TSKH ĐẶNG THU làm Trưởng phòng Năm 1975, Viện Khoa học Việt Nam thức thành lập, Phòng Sinh vật phát triển thành phòng trực thuộc Viện Khoa học Việt Nam, bao gồm hướng sinh học đại cương sinh học thực nghiệm (Phòng Động vật học, Phòng Thực vật học, Phịng Sinh lý - Hóa sinh người động vật, Phịng Sinh lý - Hóa sinh thực vật, Phịng Vi sinh vật) VIỆN SINH VẬT HỌC VÀ CÁC TRUNG TÂM HÌNH THÀNH TỪ VIỆN SINH VẬT HỌC, VIỆN KHOA HỌC VIỆT NAM (1975-1993) Tháng năm 1975, Viện Sinh vật học thuộc Viện Khoa học Việt Nam thành lập sở hợp phòng nghiên cứu sinh vật học nói GS.TSKH NGUYỄN HỮU THƯỚC GS.TSKH ĐẶNG HUY HUỲNH cử làm Lãnh đạo với cương vị Viện phó Năm 1983, GS.TSKH LÊ XUÂN TÚ bổ nhiệm làm Viện trưởng Năm 1983, phòng nghiên cứu theo hướng sinh học đại cương phát triển hình thành, Trung tâm Sinh thái Tài nguyên sinh vật thuộc Viện Khoa học Việt Nam GS.TSKH ĐẶNG NGỌC THANH làm Giám đốc GS.TSKH ĐẶNG HUY HUỲNH làm Phó Giám đốc Năm 1982, Trung tâm Sinh lý - Hoá sinh người động vật thuộc Viện Khoa học Việt Nam thành lập, Giám đốc GS.TSKH NGUYỄN TÀI LƯƠNG Năm 1989, thành lập Trung tâm Nghiên cứu vi sinh vật, Viện Khoa học Việt Nam, Giám đốc PGS.TS LÝ KIM BẢNG Năm 1990, thành lập Trung tâm Hoá sinh ứng dụng, Viện Khoa học Việt Nam, Giám đốc GS.TSKH ĐÁI DUY BAN VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC Thực Nghị định 24/CP Chính phủ việc thành lập Trung tâm Khoa học Tự nhiên Công nghệ Quốc gia, ngày 19/06/1993, Viện Công nghệ sinh học thuộc Trung tâm Khoa học Tự nhiên Công nghệ Quốc gia thành lập, sở hợp Viện Sinh vật học, Trung tâm Sinh lý - Hóa sinh người động vật, Trung tâm Hóa sinh ứng dụng Trung tâm Nghiên cứu vi sinh vật II LĨNH VỰC NGHIÊN CỨU Chức Nghiên cứu cơ phát triển công nghệ, dịch vụ khoa học cơng nghệ, đào tạo nguồn nhân lực có trình độ cao lĩnh vực cơng nghệ sinh học theo quy định pháp luật Nhiệm vụ a Nghiên cứu cơ bản phát triển công nghệ thuộc lĩnh vực:  Công nghệ OMICS;  Công nghệ gen;  Công nghệ protein enzym;  Công nghệ tế bào (động vật, thực vật);  Công nghệ vi sinh;  Công nghệ sinh - y học;  Công nghệ sinh học nano;  Công nghệ sinh học môi trường;  Công nghệ sinh học biển;  Công nghệ vật liệu sinh học;  Tin - Sinh học b Nghiên cứu điều tra cơ bản thuộc lĩnh vực sinh học lĩnh vực khoa học khác có liên quan; c Triển khai, ứng dụng chuyển giao kết nghiên cứu khoa học cơng nghệ thuộc lĩnh vực khoa học khác có liên quan; d Đào tạo nguồn nhân lực khoa học cơng nghệ có trình độ cao lĩnh vực cơng nghệ sinh học các lĩnhvực khoa học khác có liên quan; e Dịch vụ khoa học, công nghệ lĩnh vực công nghệ sinh học lĩnh vực khoa học khác có liên quan; f Hợp tác quốc tế lĩnh vực công nghệ sinh học các lĩnh vực khoa học khác có liên quan;và các lĩnh vực khoa học khác có liên quan; g Quản lý tổ chức, máy; quản lý sử dụng cán bộ, công chức, viên chức  của đơn vị theo quy định Nhà nước và Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam; h Quản lý tài chính, tài sản của đơn vị theo quy định Nhà nước; i Thực nhiệm vụ khác Chủ tịch Viện giao (Theo Quyết định số 208/QĐ-VHL ngày 25 tháng 02 năm 2013 Chủ tịch Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam việc Ban hành Quy chế Tổ chức hoạt động Viện công nghệ sinh học) III QUY MÔ HOẠT ĐỘNG Cơ cấu tổ chức Các đơn vị chuyên môn a) b) c) d) e) f) Phịng Thí nghiệm trọng điểm cơng nghệ gen Phịng Cơng nghệ tế bào thực vật Phịng Các chất chức sinh học Phịng Cơng nghệ ADN ứng dụng Phịng Cơng nghệ gen động vật Phịng Cơng nghệ phôi g) h) i) j) k) l) m) n) o) p) q) r) s) t) u) v) w) x) y) Phịng Cơng nghệ sinh học enzyme Phịng Cơng nghệ sinh học mơi trường Phịng Cơng nghệ sinh học tái tạo mơi trường Phịng Cơng nghệ tảo Phịng Cơng nghệ tế bào động vật Phịng Cơng nghệ vật liệu sinh học Phòng Di truyền tế bào thực vật Phòng Di truyền vi sinh vật Phịng Hố sinh protein  Phịng Kỹ thuật di truyền Phòng Miễn dịch học Phòng Sinh hố thực vật Phịng Sinh học tế bào sinh sản Phòng Vi sinh vật dầu mỏ Phòng Vi sinh vật đất Phòng Vi sinh vật phân tử Trại thực nghiệm sinh học (Cổ Nhuế, Từ Liêm, Hà Nội) Trạm thực nghiệm sinh học (Tam Đảo, Vĩnh Phúc) Phịng Cơng nghệ lên men Lực lượng cán Tổng số cán viên chức: 302 người Số biên chế: 180 - Số hợp đồng: 122 Giáo sư: 02 Phó Giáo sư: 19 Tiến sỹ khoa học:  Tiến sỹ: 80 Thạc sỹ: 81 Cử nhân/kỹ sư: 70 Khác:20 Thành tựu bật - Chủng E.coli O17 biểu kháng nguyên Gm, SefA Salmonella enterica serovar Enteritidis bề mặt tế bào cơng trình tạo chủng vaccine E.coli sống nhược độc đa giá phòng E.coli, S.Enteritidis cho gia cầm Nếu kết đánh giá khả bảo hộ vaccine thành cơng loại vaccine có giá thành rẻ, tiện lợi sử dụng để gây miễn dịch cho gia cầm theo đường ăn uống phòng lúc hai loại bệnh E.coli S Enteritidis gây - Quy trình sản xuất chế phẩm BCF từ chủng vi sinh vật phân lập từ đất Việt Nam: Chế phẩm BCF tạo quy trình áp dụng thành tựu giới vào hoàn cảnh cụ thể Việt Nam, khẳng định thêm giá trị khoa học công nghệ mà giới áp dụng vào lĩnh vực sản xuất chế phẩm có nguồn gốc sinh học bảo vệ thực vật Do môi trường để sản xuất loại chế phẩm BCF chứa nguồn nguyên liệu dễ kiếm phế phẩm nông nghiệp bột đậu tương giảm giá thành sản xuất - Diesel sinh học sản xuất từ sinh khối vi tảo biển Việt Nam: Đã tạo lít diesel sinh học từ sinh khối vi tảo biển Việt Nam đạt 10/15 tiêu chuẩn chất lượng diesel sinh học gốc B100 theo tiêu chuẩn Việt Nam công bố Đây sản phẩm diesel sản xuất từ sinh khối tảo Việt Nam Việc làm chủ công nghệ ni trồng đủ sinh khối tảo, chuyển hóa thành cơng sinh khối tảo thành diesel sinh học có chất lượng tốt chứng minh tiềm thách thức cho việc đầu tư sản xuất diesel sinh học từ tảo quy mô lớn theo định hướng để thương mại hóa sản phẩm Để giảm giá thành cạnh tranh sản phẩm diesel sinh học từ tảo với sản phẩm diesel truyền thống, quy trình cơng nghệ sản xuất loạt sản phẩm có giá trị khác kèm với diesel sinh học glycerol, acid béo không no đa nối đôi có giá trị Y dược, thực phẩm chức hồn thiện thành cơng quy mơ phịng thí nghiệm Về mặt khoa học, chủng giống vi tảo biển Việt Nam có đặc tính trội công nhận chủng giới, có tiềm cho sản xuất diesel sinh học quy mơ lớn - Các dịng bơng chuyển gen kháng virus xanh lùn: Ứng dụng công nghệ đại chọn tạo giống trồng hướng hiệu quả, ln khuyến khích phát triển Bằng cơng nghệ RNAi tạo chuyển gen kháng virus xanh lùn có ý nghĩa lớn khoa học thực tiễn Kết làm sở để phát triển chọn lọc dòng ổn định hệ sau phát triển thành giống kháng virus xanh lùn - Bộ kit “BIOAFP-ELISA”: Sử dụng để định tính định lượng AFP mẫu huyết người nhằm hỗ trợ phát sớm bệnh ung thư tế bào gan người Bộ kit BIOAFPELISA phát nồng độ AFP tối thiểu mức ng/ml có độ đặc hiệu cao Khả định tính đinh lượng BIOAFP-ELISA kiểm chứng thực tế 30 mẫu huyết bệnh nhân mắc ung thư gan người khoẻ mạnh bệnh viện K Trung Ương cung cấp - Bộ sinh phẩm để đồng thời chẩn đoán định type virus lở mồm long móng lưu hành Việt Nam: Bộ kit ước tính có giá thành 1/3 kit nhập ngoại có thao tác đơn giản, dễ sử dụng bảo quản Viện Công nghệ sinh học kết hợp với sở, phịng thí nghiệm chẩn đoán bệnh, trung tâm chẩn đoán thú y quốc gia để thử nghiệm triển khai kit vào thực tiễn Phần II: QUY ĐỊNH PHỊNG THÍ NGHIỆM I QUY ĐỊNH PHỊNG THÍ NGHIỆM Một số ký hiệu đáng ý phịng thí nghiệm a An tồn số thiết bị, phịng thí nghiệm nguy STT Cấp độ an tồn Dạng phịng thí nghiệm Thực hành thí nghiệm Thiết bị an tồn Cơ - An toàn sinh học cấp Day học, nghiên cứu GMT Cơ - An toàn sinh học cấp Dịch vụ sức khỏe bản, dịch vụ nghiên cứu chuẩn đốn GMT đồ bảo hộ có cảnh báo nguy hiểm sinh học Bàn làm việc có tủ an tồn sinh học Dịch vụ/nghiên cứu chuẩn đốn đặc biệt Giống cấp với quần áo bảo hộ đặc biệt, vào có kiểm sốt, dịng khí có định hướng Tủ an tồn sinh học và/hoặc thiết bị khác cho tất hoạt động Giống cấp thêm vào lối vào có khóa khơng khí, lối có vịi phun nước, hủy rác đặc biệt Tủ an toàn sinh học cấp III đồ đặc dụng với tủ an toàn sinh học cấp II, khơng khí lọc Cách ly - An toàn sinh học cấp Cách ly hoàn toàn An tồn sinh học cấp Các đơn vị phịng bệnh nguy hiểm Khơng, bàn thí nghiệm hở b Một số quy định chung an tồn phịng thí nghiệm: - Mang trang, găng tay thao tác với vi sinh vật hóa chất - Trên bàn thí nghiệm để vật dụng thí nghiệm, sổ ghi chép, giấy ghi chép Các vật dụng cá nhân để nơi quy định - Trước sau làm thí nghiệm phải sát trùng mặt bàn thí nghiệm hóa chất sát trùng quy định - Cần ghi tên người làm thí nghiệm, ngày tháng lên tất hộp Petri, ống nghiệm làm,… - Cẩn thận thao tác với đèn cồn, đèn Bunsen, khơng để vật phẩm chứa vi sinh vật dính lên da, quần áo,… - Không tự ý sử dụng trang thiết bị phịng thí nghiệm chưa hướng dẫn cụ thể - Tất vật phẩm làm thí nghiệm phải khử trùng máy khử trùng trước vứt bỏ sử dụng lại - Khi làm thí nghiệm xong phải vệ sinh dụng cụ, thiết bị làm thí nghiệm để nơi quy định - Rửa tay trước dời phịng thí nghiệm - Tất trường hợp tai nạn phải báo cáo cho cán hướng dẫn để xử lý kịp thời Phân loại nhóm vi sinh vật lây nhiễm  Nhóm nguy cấp (khơng gây nguy hại gây nguy hại cho cá nhân cộng đồng): vi sinh vật khơng có khả gây bệnh cho người động vật  Nhóm nguy cấp (gây nguy hại cho cá nhân mức trung bình, gây nguy hại cho cộng đồng mức độ thấp): vi sinh vật gây bệnh cho người động vật khả gây bệnh nặng cho người lao động, cộng đồng, vật nuôi môi trường Tiếp xúc với vi sinh vật gây bệnh loại có khả mắc lây nhiễm nghiêm trọng có phương pháp điều trị hữu hiệu biện pháp phòng ngừa việc truyền nhiễm bệnh bị hạn chế  Nhóm nguy cấp (gây nguy hại cao cho cá nhân, mức nguy huy cho cộng đồng thấp): Vi sinh vật gây bệnh thường gây bệnh nguy hiểm cho người động vật không thường xuyên tạo lây nhiễm từ cá thể lây nhiễm sang cá thể khác Phương pháp điều trị biện pháp phịng chống sẵn có  Nhóm nguy cấp (gây nguy hại cho cá thể cộng đồng cao): vi sinh vật gây bệnh nghiêm trọng cho người động vật, bệnh dễ truyền nhiễm từ cá thể sang cá thể khác trực tiếp gián tiếp Biện pháp điều trị phịng ngừa khơng thường xun sẵn có Liên quan nhóm nguy cấp độ an tồn sinh học, phịng thí nghiệm, thực hành thí nghiệm thiết bị phịng thí nghiệm Nhóm nguy Cấp độ an tồn sinh học Dạng phịng thí nghiệm Thực hành phịng thí nghiệm Thiết bị an tồn Cơ - An toàn sinh học cấp Day học, nghiên cứu GMT Khơng Bàn thí nghiệm hở Cơ – An toàn sinh học cấp Dịch vụ sức khỏe bản, dịch vụ/ nghiên cứu chuẩn đoán GMT đồ bảo hộ có cảnh báo nguy hiểm sinh học Bàn làm việc có tủ an tồn sinh học Cách ly – An toàn sinh học cấp Dịch vụ/nghiên cứu chẩn đoán đặc biệt Cách ly hoàn toàn – An toàn sinh học cấp Các đơn vị phòng bệnh nguy hiểm Giống cấp Tủ an toàn sinh với quần áo bảo học và/hoặc hộ đặc biệt, thiết bị khác cho vào có kiểm tất hoạt sốt, dịng khí có động định hướng Giống cấp có Tủ an tồn sinh thêm lối vào có học cấp III khóa khơng khí, đồ đặc lối có vịi dụng với tủ an phun nước, hủy toàn sinh học rác đặc biệt cấp II, khơng khí lọc Ký hiệu cảnh báo nguy hiểm sinh học 10 VI TIẾN HÀNH NGÀY THỨ NHẤT: CHUẨN BỊ MƠI TRƯỜNG (4/9/2018) Dụng cụ, hóa chất, thiết bị đo: a) Bột khơ đóng hộp Endo b) Một bình tia nước cất c) Một bình tam giác thủy tinh có đậy nút bơng khử trùng d) Cốc đong e) Cân phân tích f) Nồi hấp sấy khô g) Tủ sấy Chuẩn bị môi trường - Môi trường nuôi cấy E.coli môi trường Endo-Agar 39% bao gồm thành phần: Tryptone Lactose, Dipotassium Hydrogen Phosphtev, Soidium Sulphite, Pararosanilin, Agar - Lấy 11,7g Endo ( rắn) pha với 300ml ( đủ để đổ vào 18 đĩa petri) - Dung dịch Nacl 8,5% pha 2000ml đủ để pha mẫu xử lý dụng cụ Các bước chuẩn bị: Bước 1: Sử dụng cân phân tích cân 39 gram bột Endo cho vào bình tam giác thủy tinh (đã khử trùng) pha với nước cất với công thức: - Thạch Endo: 39 gram Nước cất: 350 ml Bước 2: Lắc nhẹ môi trường sau pha chế, dùng nút đậy chặt tránh vi khuẩn, bụi ,… bay vào sau bọc thêm lớp giấy ngồi miệng bình Ghi tên mơi trường để nhận biết.Nước cất: 350 ml Bước 3: Đun sơi hịa tan thành phần, điều chỉnh pH-7,4 0,2 Sử dụng nồi hấp tiệt trùng sấy khô ALP KT-40LDP hấp 120⁰ /15 phút, để nguội 45-50⁰ Bước 4: Sau sử dụng box cấy để thực đổ môi trường vào đĩa petri, đĩa khoảng 10ml Cách sử dụng box cấy an toàn sinh học cấp Esco IEC51010-1: Tất thao tác phân tích mẫu thực box cấy có cấp độ an tồn sinh học cấp Trước làm việc, bật quạt thơng gió, lau bề mặt box nuôi cấy vi sinh vật cồn 70º (hoặc 90 º), sau bật đèn đèn cồn Vệ sinh tay cồn trước tiến hành chuẩn bị mơi trường phân tích mẫu box cấy Sau kết thúc thí nghiệm cần lau chùi sẽ, dọn dẹp rác bật tia UV 30 phút Bước 5: Đợi khoảng 15 phút để thạch đơng gói đĩa petri đựng mơi trường giấy cho vào tủ ấm nuôi với nhiệt độ 40-45⁰ vòng 24 20 NGÀY THỨ 2: PHƯƠNG PHÁP LẤY MẪU, VẬN CHUYỂN VÀ BẢO QUẢN MẪU NƯỚC THẢI (5/9/2018) Tiến hành lấy mẫu a Dụng cụ lấy mẫu: - - Chai nhựa sạch, dung tích 250ml; 500ml; 1000ml Tất chai lọ dùng để lấy giữ mẫu cần phải rửa thật nước xà phòng, chất kiềm axit hỗn hợp kali bicromat axit sunfuric, sau rửa kỹ nước sạch, tráng nước cất, trước lấy mẫu phải tráng lần nước thải lấy mẫu lấy mẫu Máy hút mẫu chân khơng, giá có chân đế nặng có kẹp giữ chai, dây hạ xuống nước, găng tay gáo múc nước trường hợp phải lấy mẫu thủ công Túi đá  Mẫu nước thải lấy dòng thải Viện Hàn Lâm Khoa Học Cơng Nghệ Việt Nam Hình Dụng cụ lấy mẫu 21 Hình Địa điểm lấy mẫu tiến hành lấy mẫu Thời gian lấy: 8h45 ngày 5/9/2018 Tọa độ: 21o2’58”N – 105o47’59”E Thao tác lấy mẫu: Lấy mẫu đơn giản (Khi chất lượng nước không thay đổi lấy mẫu lần, điểm) Quy trình thực hiện: Lấy mẫu nước cách bờ 15-20 cm lấy mẫu cách mặt nước sâu khoảng 15-20 cm b Bảo quản vận chuyển mẫu: - Thời gian vận chuyển nơi lấy mẫu đến phịng thí nghiệm ngắn tốt Bảo quản mẫu túi đá (nhiệt độ thấp) chỗ tối - Khi vận chuyển mẫu phải bọc chai, chèn lót chai giấy mềm, đặt chai hộp gỗ or thùng xốp kín có nắp cho an tồn tránh đổ vỡ vận chuyển - Ngâm chai mẫu cồn 20 phút để bảo quản - Mẫu đem pha loãng dung dịch NaCl 8,5% (đã pha sẵn từ trước) theo tỉ lệ: 1ml (mẫu nước thải) 9ml NaCl 8,5% ta mẫu 10 -1 Sau tiếp tục pha lỗng 10 lần với ống nghiệm đánh dấu theo thứ tự : 10-2 , 10-3, 10-4 22 Tiến hành nuôi cấy Việc nuôi cấy mẫu làm box cấy để đảm bảo khơng có xâm nhập vi sinh vật khác từ mơi trường bên ngồi, làm lệch kết nghiên cứu - Dùng pipet hút 1µl dung dịch từ ống nghiệm pha cho vào đĩa petrit Ở ống nghiệm cho vào đĩa mơi trường tương ứng sau dùng phương pháp cấy trang để thực - Đồng thời lấy mẫu E.coli có sẵn trang vào đĩa Petrit tương ứng, dùng làm mẫu đối chứng - Bọc đĩa Petri giấy báo Sau ni tủ ấm nhiệt độ 40 độ C 24 tiếng lấy quan sát NGÀY THỨ BA: PHÁT HIỆN, ĐẾM ESCHERICHIA COLI (E.COLI) VÀ VI KHUẨN COLIFORM (6/9/2018) Giới thiệu Escherichia coli (E.coli) vi khuẩn coliform: Vi khuẩn colifom thuộc Gram âm, không tạo bào tử, oxydaza âm tính, dạng que, hiếu khí yếm khí phát triển môi trường muối mặt (hoặc tác nhân hoạt động bề mặt khác có đặt tính ức chế phát triển tương tự) thường có khả lên men lactoza tạo axit aldehyt 48 h ủ nhiệt độ (36 ± 2) C Vi khuẩn có enzym β-galactosidaza E.coli vi khuẩn colifom, có khả sinh indol từ trytophan (21 ± 3) h (44,0 ±0,5) C Vi khuẩn có enzym -galactosidaza, cho kết dương phép thử metyl đỏ phân hủy cacboxyl axit L-glutamic không sinh axetyl metyl cacbinol, dùng citrat làm nguồn cacbon decarboxyl phát triển môi trường KCN Thiết bị, dụng cụ hóa chất: a Thiết bị: - Thiết bị tiệt trùng nước (nồi hấp): Nồi hấp ALP KT-40LDP sử dụng để tiệt trùng môi trường số dụng cụ (phễu lọc) Môi dụng cụ thủy tinh tiệt trùng theo hướng dẫn ISO 8199 - Tủ ấm có điều chỉnh nhiệt độ (37 ± 0,5)⁰C (45,0 ± 0,5)⁰C - Tủ sấy 3000C GZX-9070 MBE: Sử dụng để sấy bình tam giác, đĩa petri, ống nghiệm số dụng cụ thủy tinh khác để phục vụ cho phân tích mẫu 23 - Máy đo pH Hanna, với độ xác ± 0,1 - Thiết bị lọc màng: Bơm hút chân không phù hợp với ISO 8199 - Box cấy an toàn sinh học cấp Esco IEC61010-1 + Các dụng cụ sử dụng phan tích mẫu đặc box khử trùng đèn cực tím trước phân tích + Tất thao tác phân tích mẫu thực box cấy có cấp độ an tồn sinh học cấp - Cân Sartorious (Max 220g, d = 0,0001g) - Pipet tự động b Dụng cụ: - Màng lọc, làm Cellulose Nitrate, đường kính khoảng 47 mm có đặc tính lọc tương đương với màng lọc có cỡ lỗ 0,45 µm có lưới - Kẹp mũi tròn, dùng để kẹp màng lọc - Phễu lọc Gelman Sciences có đường kính 47 mm c Hóa chất: - Chủng E.coli HD 502 chuẩn - Các thuốc nhuộm, môi trường nuôi cấy cân theo thành phần quy định định mức đến thể tích cần thiết nước cất nước loại ion không chứa chất ức chế phát triển vi khuẩn điều kiện thử phù hợp với TCVN 4851 (ISO 3696) - Muối sinh lý 8,5% - Môi trường Endo Agar Tiến hành thí nghiệm: Các bước tiến hành mơ tả qua sơ đồ biểu tượng cho phương pháp thí nghiệm là: 24 - Phương pháp màng lọc (Sơ đồ 1) 25 - Phương pháp pha loãng liên tục (Sơ đồ 2) 26 Cách pha loãng mẫu: - Đối với mẫu chất lỏng: dùng pipet hút ml mẫu cho vào ống nghiệm chứa ml dung dịch pha lỗng, ta nồng độ pha loãng 10-1 Tiếp tục từ ống nghiệm 10-1 hút tiếp 1ml cho vào ống nghiệm chứa ml dung dịch pha loãng độ pha loãng 10-2 Tiếp tục đến nồng độ cần thiết - Đối với mẫu rắn: cân xác 10 g mẫu, sau cho vào 90 ml dung dịch pha nồng độ pha loãng 10-1 Và tiếp tục pha loãng tương tự mẫu nước lỗng Kết - Các khuẩn khơng dính vào trịn gọi khuẩn lạc khuẩn - Các khuẩn lạc có màu hồng đỏ Coliform - Các khuẩn lạc có màu ánh kim E.coli => Sau quan sát so sánh với mẫu đối chứng, kết luận mẫu nước thải khơng có Ecoli Ta chuyển qua tính tốn số mật độ lạc khuẩn xuất (có) dịng thải dựa đĩa mẫu phân tích Hình 3-4: kết đạt sau thí nghiệm 27 5.Tính tốn Bảng đếm lạc khuẩn đĩa Nồng độ dung dịch 10-1 Đĩa 10-2 10-3 10-4 Đĩa 37 79 17 Đĩa Không đếm 42 Đĩa Không đếm 38 Dựa vào bảng đếm tính CFU theo cơng thức sau: Cs =   Trong đó: Cs giá trị ước lượng cfu thể tích chuẩn sử dụng Vs mẫu; z tổng số khuẩn lạc đếm đĩa màng từ độ pha loãng d1 ,d2 ,… ,di, từ thể tích riêng biệt phần mẫu thử (mẫu dung dịch pha loãng); Vs thể tích chuẩn chọn để biểu thị nồng độ vi sinh vật có mẫu; Vtot thể tích tổng tính mẫu ban đầu bao gồm đĩa đếm Vtot tổng thể tích riêng biệt phần mẫu thử (mẫu dung dịch pha lỗng) tính theo cơng thức (*): Vtot = (n1V1d1)+ (n2V2d2)+….+ (niVidi) (*) Trong - Vtot thể tích tổng tính mẫu ban đầu bao gồm đĩa đếm; - n1,n2,…,ni số lượng đĩa đếm độ pha loãng d1,d2,….,di ; - V1, V2, …, Vi thể tích mẫu thử sử dụng với độ pha loãng d1,d2,….,di ; 28 - d1,d2,….,di độ pha loãng sử dụng thể tích thử V1, V2, …, Vi (d = mẫu không pha loãng, d = 0,1 dung dịch pha loãng mười lần v.v ) Thu kết quả: Cs = 27x104 NGÀY THỨ 4: PHƯƠNG PHÁP NHUỘM GRAM (7/9/2018) Mục đích: Nhuộm Gram phương pháp thực nghiệm nhằm phân biệt loài vi khuẩn thành nhóm (Gram dương Gram âm) dựa đặc tính hố lý thành tế bào Ngun lý: Sau nhuộm với phức hợp tím tinh thể-iot, mẫu xử lý tiếp với hỗn hợp khử màu, làm nước lớp peptidoglycan thành tế bào Gram dương, từ làm giảm khoảng trống phân tử khiến thành tế bào bắt giữ phức hợp tím tinh thể-iot bên tế bào Đối với vi khuẩn Gram âm, hỗn hợp khử màu đóng vai trị chất hồ tan lipit làm tan màng ngồi thành tế bào Lớp peptidoglycan mỏng khơng thể giữ lại phức hợp tím tinh thểiot tế bào Gram âm bị khử màu Khử màu bước quan trọng cần kĩ định khả bắt màu Gram dương "tất khơng." Thiết bị, dụng cụ hóa chất: a Thiết bị: - Kính hiển vi b Dụng cụ: - Que cấy đầu tròn (tăm nhọn khử trùng) - Đèn cồn - Lam kính, la men - Chậu rửa - Bình xịt nước cất - Các dụng cụ cần thiết khác c Hóa chất (1) Vi khuẩn Gram âm: E.coli; Gram dương: Bacillus subtilis (2) Dung dịch tím gentians (3) Dung dịch Lugol (4) Dung dịch alcohol 900 (5) Dung dịch fucshin kiềm 29 Hình Các hóa chất dùng thí nghiệm nhuộm gram Tiến hành thí nghiệm: a.Tạo khuẩn tiêu Hình 6: Lam kính 30 Bước 1: Làm vết bôi cố định tiêu Đánh giấu tên vào lamen thủy tinh sau cho nước cất lên lamen, lấy sinh khối vi khuẩn dàn giọt nước cất, dùng tăm vơ trùng dàn vết bơi Sau hơ mặt lam kính lửa đèn cồn, tránh khơng để q nóng Bước 2: Nhuộm màu  Nhuộm tiêu dung dịch tím gentian phút, rửa nước  Nhuộm dung dịch lugol giữ phút, rửa nước, sau rửa cồn khoảng 10 giây (nhỏ từ từ giọt cồn tan hết màu), rửa nước  Nhuộm bổ sung dung dịch fushin khoảng 30 giây, rửa nước  Đợi đến tiêu khô, nhỏ khoảng – giọt nước cất lên láng qua hết tiêu sau đặt nhẹ lamen lên, tránh tạo bọt khí Bước 3: Soi kính hiển vi - Quan sát tiêu vật kính đầu 100x - Nếu vi khuẩn Gram dương bắt màu xanh tím gentian Nếu vi khuẩn Gram âm bắt màu hồng thuốc nhuộm fucshin Hình Vi khuẩn gram âm Hình Vi khuẩn gram dương Hình Vi khuẩn gram dương âm 31 C KẾT LUẬN Trong thời gian thực tập, em tiến hành bước nuôi cấy cần thiết, áp dụng kỹ xử lý mẫu để nghiên cứu, phát có mặt khuẩn E.coli số chủng khuẩn thường gặp mẫu nước thải Ngoài ra, thời gian học tập thực hành phịng Vi Sinh Vật Mơi Trường, em thu nhiều kiến thức bổ ích lý thuyết thực tế nghiên cứu Em nắm nét đặc điểm sinh sống, phát triển cách nhận biết có mặt chủng khuẩn E.coli Bên cạnh đó, em học kỹ thuật phịng thí nghiệm, nắm số kỹ thuật pha môi trường nền, đổ đĩa thạch để phân lập chủng vi khuẩn, nuôi cấy, bảo quản, lọc mẫu nước thải, Chương trình thực bổ ích cần thiết cho sinh viên ngành cơng nghệ sinh học Tuy thời gian không dài em làm quen với máy móc, thiết bị đại, thầy cô anh chị trước truyền đạt lại cho nhiều kinh nghiệm quý báu học tập nghiên cứu khoa học Em làm quen với môi trường làm việc nghiêm túc khoa học – môi trường mà em gắn bó với nghề nghiệp tương lai Đây điều kiện tốt để khơi nguồn lòng nhiệt huyết yêu nghề hệ kỹ sư mơi trường tương lai Qua đó, em tự rút cho học “Kiên trì, tinh thần trách nhiệm, khơng ngừng học hỏi, tìm tịi sáng tạo đức tính cần thiết người làm nghiên cứu khoa học” Một lần em xin tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới ban lãnh đạo Viện Công Nghệ Môi Trường, TS.Bùi Văn Ngọc – Trưởng phịng Thí nghiệm Trọng Điểm Cơng Nghệ Gen, Ban chủ nhiệm Khoa công nghệ sinh học, TS Nguyễn Hữu Đức – Phó trưởng khoa Cơng nghệ sinh học, Trưởng môn Công nghệ sinh học động vật, Học viện Nơng nghiệp Việt Nam tồn thể thầy anh chị tận tình giúp đỡ chúng em hoàn thành tốt đợt thực tập Em xin chân thành cảm ơn ! 32 TÀI LIỆU THAM KHẢO  Tài liệu Tiếng Việt Hoàng Thị Yến, ”Nghiên cứu vi khuẩn tía quang hợp khơng lưu huỳnh phân lập Việt Nam làm thức ăn tươi sống cho giống động vật hai mảnh vỏ”, Luận án Tiến sĩ Sinh học, Viện Công nghệ Sinh học, Hà Nội, tr: 12- 66, 2010 Đặng Đình Kim, Giáo trình kỹ thuật nhân giống ni sinh khối sinh vật phù du NXB Nông Nghiệp, 2012 Trần Thị Thanh Hiền, Giáo trình dinh dưỡng thức ăn thủy sản, NXB Đại học Cần ThơKhoa Thủy sản, tr: 54-57, 2004 Đỗ Thị Tố Uyên, Trần Văn Nhị, ”Nghiên cứu tổng hợp ngoại tiết 5-aminolevulinic acid chủng vi khuẩn quang hợp tía phân lập Việt Nam”, Tạp chí Cơng nghệ sinh học 4(1), tr: 73-80, 2006 Nguyễn Xuân Thành, Giáo trình thực tập vi sinh, NXB Đại học Nông nghiệp Hà Nội, 26, 2007  Tài liệu nước Lucking D., Pike L., and Sojka G., “Glycerol utilization by a mutant of Rhodopseudomonas capsulata”, J Bacteriol 125, pp 750-752, 1976 Lavens P, Sorgeloos P., “Mannual of the production and use of live food for aquaculture”, Ghent, Belgium, Rom FAO 361, pp 295, 1996 Lavens P, Sorgeloos P (1996), Mannual of the production and use of live food for aquaculture Ghent, Belgium, Rom FAO 361, pp 295  Tài liệu mạng Internet ibt.ac.vn/index.php/phong-thi-nghiem-trong-diem-cn-gen 33 34 ... tựu bật - Chủng E. coli O17 biểu kháng nguyên Gm, SefA Salmonella enterica serovar Enteritidis bề mặt tế bào cơng trình tạo chủng vaccine E. coli sống như? ??c độc đa giá phòng E. coli, S.Enteritidis... thường xuyên có thay đổi phẩm chất vật lý mùi vị, màu sắc  Nếu E. coli xuất nước có nghĩa có ô nhiễm mầm bệnh khác có mặt  Nếu E. coli khơng có tổng Coliform lớn có thể: - Xuất lớp vi khuẩn phát. .. khuẩn lạc có màu hồng đỏ Coliform - Các khuẩn lạc có màu ánh kim E. coli => Sau quan sát so sánh với mẫu đối chứng, kết luận mẫu nước thải khơng có Ecoli Ta chuyển qua tính tốn số mật độ lạc khuẩn