THÔNG TIN TÀI LIỆU
ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN NGUYỄN XUÂN VIỆT NGHIÊN CỨU ĐIỀU KIỆN NI CẤY, CHUYỂN HĨA SINH HỌC VÀ THU NHẬN - DECALACTONE TỪ DẦU THẦU DẦU BẰNG NẤM MEN Yarrowia LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội - 2014 z lipolytica ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN NGUYỄN XUÂN VIỆT NGHIÊN CỨU ĐIỀU KIỆN NI CẤY, CHUYỂN HĨA SINH HỌC VÀ THU NHẬN - DECALACTONE TỪ DẦU THẦU DẦU BẰNG NẤM MEN Yarrowia lipolytica Chuyên ngành: Vi sinh vật học Mã số: 60 42 01 07 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS NGUYỄN THỊ HOÀI TRÂM PGS.TS NGÔ TỰ THÀNH Hà Nội - 2014 z Luận văn thạc sĩ khoa học Nguyễn Xuân Việt LỜI CẢM ƠN Tôi xin chân thành cảm ơn PGS TS Nguyễn Thị Hồi Trâm PGS.TS Ngơ Tự Thành người trực tiếp hướng dẫn khoa học tận tình giúp đỡ tơi suốt q trình tơi nghiên cứu, hồn thành đề tài Tơi xin chân thành cảm ơn anh chị cán Bộ môn Công nghệ Enzim Protein, Viện Công nghiệp Thực phẩm-Bộ Công thương nhiệt tình giúp đỡ, bảo chia sẻ với thời gian thực tập Nhân dịp này, xin bày tỏ lòng biết ơn tới Ban Giám hiệu Trường Đại học Khoa học Tự nhiên - ĐHQGHN, Ban Chủ nhiệm khoa Sinh học, thầy giáo, cô giáo Bộ môn Vi sinh vật học động viên, dẫn, đóng góp ý kiến tạo điều kiện thuận lợi để tơi hồn thành luận văn Cuối cùng, tơi xin cảm ơn gia đình, người thân bạn bè động viên, giúp đỡ suốt q trình tơi thực đề tài Hà Nội tháng 6-2014 Học viên: Nguyễn Xuân Việt Chuyên ngành Vi sinh vật học Khóa 2011-2013 z Luận văn thạc sĩ khoa học Nguyễn Xuân Việt MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN MỤC LỤC DANH MỤC HÌNH VẼ DANH MỤC BẢNG DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT MỞ ĐẦU CHƢƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Nấm men Yarrowia lipolytica .4 1.2 Chất thơm từ lipit .7 1.2.1 Vài nét chất thơm dùng công nghiệp thực phẩm 1.2.2 Chất thơm -decalactone 1.2.3 Các đƣờng tạo thành chất thơm γ-decalactone vi sinh vật .10 1.3 Chuyển hóa sinh học axit ricinoleic thành chất thơm γ- decalactone chủng nấm men chuyển hóa chất béo .12 1.3.1 Nguồn chất .12 1.3.2 Các chủng nấm men có khả chuyển hóa axit ricinoleic thành chất thơm γ- decalactone 14 1.4 Ứng dụng nấm men chuyển hóa chất béo .14 1.5 Các yếu tố ảnh hƣởng đến chuyển hóa sinh học axit ricinoleic thành chất thơm γ- decalactone nấm men 17 1.6 Tình hình nghiên cứu sản xuất - decalactone nƣớc 18 CHƢƠNG 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 21 2.1 Nguyên liệu, hóa chất, thiết bị, dụng cụ mơi trƣờng nghiên cứu 21 2.1.1 Vi sinh vật 21 2.1.2 Hóa chất 21 2.1.3 Thiết bị 21 2.1.4 Môi trƣờng 23 Chuyên ngành Vi sinh vật học Khóa 2011-2013 z Luận văn thạc sĩ khoa học Nguyễn Xuân Việt 2.2 Phƣơng pháp 23 2.2.1 Nhân giống lên men máy lắc .23 2.2.2 Lên men theo mẻ nồi 5L 24 2.2.3 Lên men theo mẻ - có tiếp dần chất, nồi 5L .24 2.2.4 Lên men theo mẻ nồi 50L 25 2.2.5 Lên men theo mẻ có - tiếp dần chất, nồi 50L 25 2.2.6 Đếm số lƣợng tế bào buồng đếm hồng cầu 25 2.2.7 Lactone hóa dịch sau lên men 26 2.2.8 Chƣng cất dịch lên men đƣợc lactone hóa 26 2.2.9 Tách chiết -decalactone dung môi .26 2.2.10 Loại bỏ dung môi khỏi dịch chiết 26 2.2.11 Làm dịch chiết cô đặc 27 2.2.11.1 Làm dịch chiết cô rửa kiềm 27 2.2.11.2 Làm dịch chiết cô đặc Na2SO4 khan .27 2.2.12 Đánh giá cảm quan 27 2.2.13 Phân tích định lƣợng -decalactone sắc ký khí 27 CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 30 3.1 Lựa chọn điều kiện lên men máy lắc 30 3.1.1 Lựa chọn tốc độ lắc 30 3.1.2 Lựa chọn pH môi trƣờng lên men 30 3.1.3 Lựa chọn thời gian nhân giống 31 3.1.4 Lựa chọn tỷ lệ cấy giống 32 3.1.5 Lựa chọn thời gian lên men 33 3.1.6 Ứng dụng phƣơng pháp lên men tiếp dần chất (fed-culture) 33 3.2 Nghiên cứu phƣơng thức lên men quy mô 5L 50L 35 3.2.1 Lên men quy mô 5L 35 3.2.2 Lên men quy mô pilot nồi dung tích 50 lít 40 3.2.3 So sánh tóm tắt phƣơng thức lên men quy mô 5L 50L 43 3.3 Lựa chọn điều kiện chiết rút thu nhận γ-decalactone từ dịch lên men 44 Chuyên ngành Vi sinh vật học Khóa 2011-2013 z Luận văn thạc sĩ khoa học Nguyễn Xuân Việt 3.3.1 Lựa chọn điều kiện chiết rút γ-decalactone 44 3.3.2 Lựa chọn điều kiện thu nhận làm γ-decalactone từ dịch lên men49 KẾT LUẬN 55 TÀI LIỆU THAM KHẢO 57 Chuyên ngành Vi sinh vật học Khóa 2011-2013 z Luận văn thạc sĩ khoa học Nguyễn Xuân Việt DANH MỤC HÌNH VẼ Hình 1.1 Tế bào Yarrowia lipolytica sinh trưởng môi trường chứa methy ricinoleate Hình 1.2: Sơ đồ chế chuyển hóa axit ricinoleic thành chất thơm -decalactone 11 Hình 1.3: Một số hình ảnh thầu dầu (Ricinus communis) 12 Hình 1.4 Cơng thức cấu tạo axit ricinoleic (12 hydroxy-9-octadecenoic acid) 13 Hình 3.1 Động học trình lên men theo phương thức batch culture, không khống chế pH DO nồi lên men dung tích 5L 36 Hình 3.2 Động học trình lên men theo phương thức batch culture, khơng khống chế pH có khống chế DO (A), có khống chế pH DO (B) quy mô 5L .38 Hình 3.3 Động học trình lên men theo phương thức Fed-batch culture, có khống chế pH DO, quy mô 5L 39 Hình 3.4 Động học trình lên men quy mô 50L, theo phương thức Batch culture (A) Fed-batch culture (B) 42 Hình 3.5 Sắc ký đồ γ-decalactone thu nhận từ dịch lên men chủng Y lipolytica VTP (A), sau làm phương pháp “Chiết rút-làm sạch” (B), phương pháp “Chưng cất-chiết rút-làm sạch” (C), γ-decalactone cô đặc (D) 53 Chuyên ngành Vi sinh vật học Khóa 2011-2013 z Luận văn thạc sĩ khoa học Nguyễn Xuân Việt DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Thành phần axít hữu dầu thầu dầu .13 Bảng 1.2 Một số vi sinh vật có khả chuyển hóa dầu thầu dầu thành chất thơm - decalactone 14 Bảng 2.1 Các hoá chất sử dụng 21 Bảng 2.2 Thiết bị nghiên cứu 22 Bảng 3.1 Ảnh hưởng tốc độ lắc đến hiệu suất lên men 30 Bảng 3.2 Ảnh hưởng pH môi trường đến hiệu suất lên men 31 Bảng 3.3 Sự biến đổi mật độ tế bào theo thời gian nhân giống .32 Bảng 3.4 Ảnh hưởng tỷ lệ cấy giống đến hiệu suất lên men máy lắc 32 Bảng 3.5 Ảnh hưởng thời gian lên men đến hiệu suất tổng hợp γ-decalactone chủng Y lipolytica VTP5 .33 Bảng 3.6 Ảnh hưởng hàm lượng dầu thầu dầu sử dụng ban đầu đến hiệu suất tổng hợp γ-decalactone chủng Y lipolytica VTP5 .34 Bảng 3.7 Tổng hợp kết lựa chọn điều kiện lên men sinh γ-decalactone nhờ Y lipolytica VTP5 quy mô máy lắc 34 Bảng 3.8 So sánh kết lên men theo phương thức, thiết bị dung tích 5L 39 Bảng 3.9 So sánh lượng γ-decalactone cực đại thời gian đạt được, quy mô 5L 50L 43 Bảng 3.10 Lựa chọn dung môi tách chiết -decalactone từ dịch lên men……… 45 Bảng 3.11 Lựa chọn điều kiện lactone hóa để thu nhận γ-decalactone từ dịch lên men 46 Bảng 3.12 Ảnh hưởng tốc độ khuấy thời gian chiết rút đến hiệu suất thu nhận γ-decalactone từ dịch lên men 47 Bảng 3.13 Ảnh hưởng tỷ lệ dung môi sử dụng đến hiệu suất chiết rút γdecalactone từ dịch lên men 48 Bảng 3.14 Ảnh hưởng số lần chiết rút đến hiệu suất chiết rút γ-decalactone từ dịch lên men 48 Bảng 3.15 Hiệu suất thu nhận γ-decalactone từ dịch lên men theo phương pháp “chiết rút - làm sạch” 50 Bảng 3.16 Hiệu suất thu nhận γ-decalactone từ dịch lên men theo phương pháp “chưng cất - chiết rút- làm sạch” .50 Chuyên ngành Vi sinh vật học Khóa 2011-2013 z Luận văn thạc sĩ khoa học Nguyễn Xuân Việt DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Aox Acyl-coA oxydase ATP Adenosin triphosphat CoA Coenzyme A Cs Cộng FDA Food and drug administration GC Gas chromatography (Sắc ký khí) Mb Megabase POX Peroxisomal acyl-CoA oxidase v/p Vòng/phút Y- VTP5 Yarrowia lipolytica-VTP5 YM Yeast Maltose Y- MTLY36-2P Yarrowia lipolytica- MTLY36-2P DO Dessolved Oxygen (Hàm lượng ơxy hịa tan) YMA Yeast Maltose Agar S cerevisiae Saccharomyces cerevisiae DE Diethyl ether U Unit L Lít Chun ngành Vi sinh vật học Khóa 2011-2013 z Luận văn thạc sĩ khoa học Nguyễn Xuân Việt MỞ ĐẦU Con người biết đến chất thơm sử dụng chúng từ hàng nghìn năm Nó làm tăng chất lượng nhiều sản phẩm, đặc biệt thực phẩm Khi đời sống ngày phát triển, xã hội văn minh chất thơm sản xuất sử dụng ngày đa dạng phong phú số lượng lẫn chất lượng Hiện nay, ngành công nghiệp chế biến thực phẩm có nhu cầu lớn chất phụ gia tạo hương Hương tạo nên giá trị cảm quan hương vi đặc trưng cho thực phẩm Trong trình chế biến thực phẩm, cấu tử hương nguyên liệu ban đầu dần đi, điều bắt buộc nhà cơng nghệ phải nghĩ tới phương án thêm chất phụ gia tạo hương Mặt khác, sản phẩm thực phẩm pha chế (nước ngọt, rượu mùi, sữa chua ) cần có mặt chất tạo hương Ngồi cơng nghiệp thực phẩm ra, ngành khác có nhu cầu sử dụng chất phụ gia tạo hương, là: công nghiệp mỹ phẩm, chất phụ gia để sản xuất nước hoa, phấn son, kem xoa; công nghiệp dược cần thêm chất tạo hương vào thuốc, đặc biệt loại thuốc cho trẻ em để làm át hương vị khó chịu thuốc làm cho thuốc dễ uống hơn; việc sản xuất hàng tiêu dùng kem đánh răng, xà phòng thơm, nước gội đầu, vv cần bổ xung chất phụ gia tạo hương Trong số cấu tử tạo hương este, andehyde, lactone, alcohol lactone hợp chất phổ biến cấu tử hương thơm số loại hoa quả, thảo mộc đào, mận, dừa, dâu tây Trong lactone γ-decalactone (C10H18O2) có giá trị nhất, nghiên cứu nhiều Chất tồn tự nhiên mức độ vi lượng, song thành phần chủ đạo tạo nên hương thơm cho nhiều loại γ- decalacton tổng hợp đường sinh tổng hợp từ dầu thực vật nhờ q trình chuyển hố vi sinh vật Trong loại dầu thực vật, dầu thầu dầu (castor oil), loại nguyên liệu phù hợp cho trình tổng hợp γ-decalactone Quá trình thuỷ phân dầu thầu dầu tạo axit ricinoleic, “cơ chất” để số nấm men chuyển hóa thành chất thơm, nhờ q trình β-oxi hóa Chun ngành Vi sinh vật học z Khóa 2011-2013 Luận văn thạc sĩ khoa học Nguyễn Xuân Việt 3.3.1.3 Lựa chọn tốc độ khuấy thời gian chiết rút γ-decalactone Bảng 3.12 cho thấy kết thí nghiệm sau: - Tốc độ khuấy thích hợp để chiết rút -decalactone từ dịch lên men dung môi diethyl ether 100 vòng/phút Nếu tăng tốc độ khuấy đến 150 – 200 vịng/phút lượng -decalactone tách chiết giảm dần Do chúng tơi dùng tốc độ khuấy 100 vịng/phút để nghiên cứu lựa chọn thời gian chiết rút thích hợp - Thời gian chiết rút từ 10 đến 25 phút không ảnh hưởng nhiều đến hiệu suất chiết rút -decalactone trường hợp tốc độ khuấy Tuy nhiên, diethyl ether có nhiệt độ bay thấp (35oC) nên kéo dài thời gian chiết rút dung môi bị hao hụt, ảnh hưởng đến hiệu suất thu nhận -decalactone dung mơi Vì theo chúng tôi, thời gian chiết rút tốt từ 10 đến 15 phút Bảng 3.12 Ảnh hưởng tốc độ khuấy thời gian chiết rút đến hiệu suất thu nhận γ-decalactone từ dịch lên men Chỉ tiêu Tốc độ khuấy (Thời gian chiết rút phút) Thông số Lƣợng γ-decalactone (g/L) 50 vòng/phút 1,545 ± 0,36 100 vòng/phút 1,774 ± 0,022 150 vòng/phút 1,530 ± 0,014 200 vòng/phút 1,305 ± 0,018 phút 1,774± 0,037 10 phút 2,243 ± 0,034 15 phút 2,258 ± 0,027 20 phút 2,099 ± 0,039 25 phút 2,022 ± 0,045 Thời gian chiết rút (Khuấy 100 vịng/phút) 3.3.1.4 Lựa chọn tỷ lệ dung mơi chiết rút Kết trình bày bảng 3.13 cho thấy tỷ lệ dung mơi/dịch lên men (v/v) thích hợp để chiết rút γ-decalactone 0,5/1 Khi tăng tỷ lệ dung môi, tổng lượng γ-decalactone chiết rút từ dịch lên men có tăng lên, lượng dung mơi tiêu tốn tăng theo Nếu coi hiệu suất chiết rút theo tỷ lệ dung môi tương đương với thể tích dịch lên men (tỷ lệ 1/1) 100% chiết rút nửa thể tích dung mơi (tỷ lệ 0,5/1), hiệu suất thu nhận γ-decalactone 97,2% Chuyên ngành Vi sinh vật học 47 z Khóa 2011-2013 Luận văn thạc sĩ khoa học Nguyễn Xuân Việt Bảng 3.13 Ảnh hưởng tỷ lệ dung môi sử dụng đến hiệu suất chiết rút γdecalactone từ dịch lên men Tỷ lệ dung Lƣợng dung môi Lƣợng γ- Tổng lƣợng γ- Hiệu môi/dịch lên men chiết rút thu đƣợc decalactone decalactone suất thu (v/v) (mL) (mg/mL) (mg) nhận(%) 0,3/1 27 5,392 145,6 ± 0,022 92,0 0,5/1 45 3,417 153,8 ± 0,027 97,2 0,7/1 65 2,386 155,1 ± 0,034 98,0 1/1 94 1,684 158,3 ± 0,021 100 3.3.1.5 Lựa chọn số lần chiết rút γ-decalactone dịch lên men chiết rút lần diethyl ether với tỷ lệ dung môi/dịch lên men tương ứng 0,5/1, 0,3/1 0,3/1, phần dung mơi sau lần chiết rút phân tích GC để xác định lượng γ-decalactone Kết trình bày bảng 3.14 cho thấy cần chiết rút lần thu nhận 96,5% γ-decalactone dịch lên men, lại 3,5% chiết rút nốt lần thứ Như vậy, sử dụng dung môi diethyl ether, với tốc độ khuấy 100 v/p, thời gian chiết rút 10 phút, cần chiết rút lần để thu nhận γ-decalactone từ dịch lên men Bảng 3.14 Ảnh hưởng số lần chiết rút đến hiệu suất chiết rút γ-decalactone từ dịch lên men Số lần chiết rút Lƣợng γ-decalactone (g/L) Hiệu suất thu nhận (%) Lần 1: tỷ lệ diethyl ether/dịch lên men = 3,417 ± 0,019 96,5 Lần (tỷ lệ 0,3/1) 0,124 ± 0,011 3,5 Lần (tỷ lệ 0,3/1) 0 0,5/1 (v/v) Tổng Chuyên ngành Vi sinh vật học 3,541 ± 0,019 48 z Khóa 2011-2013 Luận văn thạc sĩ khoa học Nguyễn Xuân Việt 3.3.2 Lựa chọn điều kiện thu nhận làm γ-decalactone từ dịch lên men Thu nhận sản phẩm bước quan trọng khó khăn nhiều q trình sản xuất sản phẩm công nghệ sinh học, đặc biệt chất tạo hương thơm, tính chất dễ bay hòa tan chúng Các phương pháp sử dụng công nghệ để chiết rút thu nhận chất thơm từ môi trường lỏng bao gồm: dùng dung môi hữu cơ, chưng cất, phân tách loại màng chuyên dụng, hấp phụ cacbon hoạt tính [28][37][38] sử dụng loại nhựa hữu lỗ xốp để chiết rút chất hương thơm, tính chất kị nước tự nhiên diện tích bề mặt lớn chúng [8] Do điều kiện thực tế nơi thực tập, sau nghiên cứu lựa chọn điều kiện lactone hóa chiết rút γ-decalactone từ dịch lên men, tiến hành khảo sát điều kiện thu nhận làm γ-decalactone theo hai phương pháp: (i) “chiết rút - làm sạch”, (ii) “ chưng cất - chiết rút - làm sạch” Sự khác phương pháp chỗ: theo phương pháp thứ hai, việc chưng cất loại bỏ số hợp phần khó/ không bay dịch sau lên men, mà phương pháp thứ Trong loại thực nghiệm này, mẫu nghiên cứu thực với lượng mẫu 1000 mL dịch lên men/lần 3.3.2.1 Thu nhận làm γ-decalactone theo phương pháp “chiết rút – làm sạch” Bảng 3.15 trình bày hiệu suất thu nhận γ-decalactone từ dịch lên men sau công đoạn chiết rút, làm thu nhận Kết thu cho thấy: - Hiệu suất thu nhận γ-decalactone theo phương pháp này, sau qua tất công đoạn, đạt 50,1% γ-decalactone thu theo cách có độ sắc ký 99,43% (hình 3.5 B) - Hiệu suất thu nhận γ-decalactone phần nước sau rửa kiềm lần lần thấp, (2,4 2,9% theo thứ tự) Vì vậy, thực chiết rút thu nhận γ-decalactone từ dịch lên men quy mô lớn, không cần bước thu nhận γdecalactone pha nước sau rửa kiềm Chuyên ngành Vi sinh vật học 49 z Khóa 2011-2013 Luận văn thạc sĩ khoa học Nguyễn Xuân Việt Bảng 3.15 Hiệu suất thu nhận γ-decalactone từ dịch lên men theo phương pháp “chiết rút - làm sạch” Tên mẫu Lƣợng Lƣợng γ- Tổng Lƣợng Hiệu dung môi decalactone γ-decalactone suất chiết thu (mg/mL) (mg) thu đƣợc (mL) nhận (%) 1000 mL dịch lên men, axit hóa đến pH = 2, chiết rút 445 4,526 2014,1 ± 0,41 100 410 3,645 1494,5 ± 0.35 74,2 210 0,230 48,3 ± 0.16 2,4 370 3,691 1365,7 ± 0,47 67,8 195 0,299 58,3 ± 0,22 2,9 6,0 206,080 1236,5 ± 0,38 50,1 diethyl ether (tỷ lệ dung môi/dịch lên men =0,5/1), thu pha dung môi Rửa kiềm lần (NaOH 0,1N, pH=12, tỷ lệ 1: 1) - Thu phần dung môi (a) - Phần nước chứa cặn,chỉnh pH đến 2, chiết rút DE (0,5/1), thu phần dung môi Rửa kiềm lần phần dung môi (a) (NaOH 0,1N, pH=12, tỷ lệ 1:1) - Thu phần dung môi (b) - Pha nước chứa cặn, chỉnh pH đến 2, chiết rút DE (0,5/1), thu phần dung môi Phần dung môi (b) cô chân không để đuổi DE 35oC Bổ sung ethanol (99,5%) cô chân không, để đuổi hết DE nhiệt độ 55oC Thu dịch γ-decalactone cô đặc Chuyên ngành Vi sinh vật học 50 z Khóa 2011-2013 Luận văn thạc sĩ khoa học Nguyễn Xuân Việt 3.3.2.2 Thu nhận γ-decalactone theo phương pháp “Chưng cất - chiết rút làm sạch” Theo phương thức này, dịch lên men, sau axit hóa đến pH = 2, chưng cất thiết bị chưng cất cồn, quy mơ phịng thí nghiệm, thiết bị chưng cất nước Clevenger Kết trình bày bảng 3.16 cho thấy hiệu suất thu nhận γ-decalactone theo phương pháp “Chưng cất – chiết rút” thấp, đạt 35,4 %, với độ sắc ký 99,43% (Hình 3.5 C) Bảng 3.16 Hiệu suất thu nhận γ-decalactone từ dịch lên men theo phương pháp “chưng cất- chiết rút” Lƣợng Lƣợng γ- Tổng lƣợng γ- Hiệu dung decalactone decalactone suất môi (mg/mL) (mg) thu Tên mẫu chiết thu nhận đƣợc (%) (mL) Dịch lên men chiết rút diethyl ether sau axit hóa đến 4,166 4166,0 ± 0,39 100 400 7,894 3157,6 ± 0,31 75,8 6,0 204,322 1225,9 ± 0,45 29,4 pH=2 Sử dụng thiết bị chưng cất cồn 1000 mL dịch lên men pH=2, chưng cất 100oC; Thu 800 ml dịch ngưng tụ, chiết rút DE (0,5/1) Thu pha dung môi chiết Cô chân không đuổi dung môi DE nhiệt độ 35oC (760 mmHg); bổ sung ethanol (99,5%) cô chân không đuổi hết dung môi DE nhiệt độ 55oC (350 mmHg) Chưng cất thiết bị Clevenger 1000 mL dịch lên men, pH=2, chưng cất 100oC, thu nhận: Chuyên ngành Vi sinh vật học 51 z Khóa 2011-2013 Luận văn thạc sĩ khoa học Nguyễn Xuân Việt - γ-decalactone không tan 4,0 203,16 812,6 ± 0,34 4,0 165,633 662,5 ± 0,29 nước - 800 ml dịch ngưng tụ, chiết rút DE (0,5/1) Thu pha dung môi chiết Cô chân không đuổi dung môi DE 35oC (760 mmHg); bổ sung ethanol (99,5%) cô chân không đuổi hết dung môi DE 55oC (350 mmHg) Tổng 1475,1 35,4 Hiệu suất thu nhận γ-decalactone từ dịch lên men nghiên cứu chúng tôi, phương pháp thấp so với Alchihab cộng (2010): Khi sử dụng nhựa MN-202 để hấp phụ γ-decalactone từ dịch lên men thiết bị dung tích 100 lít chủng nấm men ưa lạnh Rh aurantiaca A19 sau phản hấp phụ ethanol, hiệu suất thu nhận γ-decalactone sau cô kiệt đuổi dung môi đạt 56% [8] Chuyên ngành Vi sinh vật học 52 z Khóa 2011-2013 Luận văn thạc sĩ khoa học Nguyễn Xuân Việt (A) (B) Chuyên ngành Vi sinh vật học 53 z Khóa 2011-2013 Luận văn thạc sĩ khoa học Nguyễn Xuân Việt (C) (D) Hình 3.5 Sắc ký đồ γ-decalactone thu nhận từ dịch lên men chủng Y lipolytica VTP (A), sau làm phương pháp “Chiết rút-làm sạch” (B), phương pháp “Chưng cất-chiết rút-làm sạch” (C), γ-decalactone cô đặc (D) Chuyên ngành Vi sinh vật học 54 z Khóa 2011-2013 Luận văn thạc sĩ khoa học Nguyễn Xuân Việt KẾT LUẬN Các điều kiện lên men thích hợp để chuyển hóa dầu thầu dầu thành γdecalactone nhờ chủng nấm men Y lipolytica VTP5 sau: a) Trên máy lắc, giá trị pH 6,0; tốc độ lắc 200 v/p; tuổi giống tỉ lệ giống 10% (v/v, mật độ giống = 6.5x106 tế bào/mL); thời gian thích hợp ngày b) Trên nồi lên men 5L, so sánh lên men theo mẻ theo mẻ có tiếp dần chất, (khống chế pH, DO) phương thức thứ hai cho lượng γdecalactone cao nhất, đạt 7,343 g/L c) Trên nồi lên men 50L, lên men theo mẻ có tiếp dần chất, không khống chế pH DO, lượng γ-decalactone đạt 8,10 g/L d) So sánh ba quy mô lên men cho thấy xuất thu nhận γ-decalactone sau: 50L > 5L, 5L > máy lắc Các điều kiện thích hợp để thu nhận sản phẩm từ dịch lên men chủng Y lipolytica VTP5 sau: - Dung môi diethyl ether, lactone hóa pH có gia nhiệt 90oC/10 phút - Tốc độ chiết rút 100 v/p - Tỉ lệ dung môi/ dịch lên men 0,5/1, số lần chiết rút So sánh hai phương pháp thu nhận γ-decalactone (“chiết rút – làm sạch” “chưng cất - chiết rút” ) cho thấy: - Hiệu suất thu nhận hai phương pháp thấp (29,4% 35,4%) chất thơm thu có độ tinh cao (99,43%) Chuyên ngành Vi sinh vật học 55 z Khóa 2011-2013 Luận văn thạc sĩ khoa học Nguyễn Xuân Việt KIẾN NGHỊ Về trình lên men - Tiếp tục lên men chuyển hóa dầu thầu dầu thành γ-decalactone chủng Y lipolytica VTP nồi lên men 50L lớn mà có khả khống chế pH DO Về dung môi - Cần nghiên cứu thêm dung mơi có khả chiết rút nhiều lượng decalactone dung môi dùng - Cần nghiên cứu thêm phương pháp thu nhận sản phẩm cách chiết nhờ hai hay nhiều nhóm dung môi khác Chuyên ngành Vi sinh vật học 56 z Khóa 2011-2013 Luận văn thạc sĩ khoa học Nguyễn Xuân Việt TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Lại Thị Ngọc Hà (2003), “ Một số yếu tố ảnh hưởng đến khả sinh tổng hợp γ-decalactone chủng nấm men Yarrowica lipolytica W29”, Tạp chí khoa học kỹ thuật Nông nghiệp, tr 222 – 226 Đặng Thị Thu, Cơ sở công nghệ sinh học tập 2, Công nghệ hóa sinh, Nhà xuất Giáo dục Việt Nam Vũ Nguyên Thành (2003), Báo cáo tổng kết nhiệm vụ thường xuyên “ Bảo tồn, lưu giữ nguồn gen vi sinh vật công nghiệp thực phẩm 2003”, Viện Công nghiệp Thực phẩm Bùi Quang Thuật Kula J ( 2006), “ Tổng hợp hợp chất thơm chất hoạt động sinh học từ dầu thầu dầu”, Tuyển tập cơng trình nghiên cứu ứng dụng cơng nghệ sinh học – công nghiệp thực phẩm giai đoạn 2001 – 2005, Nhà xuất Lao động xã hội, tr 377 – 383 Internet https://www.google.com.vn/search?q=Ricinus+communis&newwindow Tiếng Anh Aguedo M, Gomes N, Escamilla García E, Waché Y, Mota M, Teixeira J.A & Belo I (2005), “Decalactone production by Yarrowia lipolytica under increased O2 transfer rates”, Biotechnology Lett, 27(20), pp 1617-1621 Aguedo M, Ly MH, Belo I, Teixeira JA, Belin JM, Waché Y (2004), “The use of enzymes and microorganisms for the production of aroma compounds from lipits”, Food Technology and Biotechnology, 42(4), pp 327-336 Alchihab M, Destain J, Aguedo M, Wathelet JP, Thonart P (2010), “The utilization of gum Tragacanth to improve the growth of Rhodotorula aurantiaca and the production of γ-decalactone in large scale”, Appl Biochem, 62(1), pp 233-241 Barnett JA (2003), “Beginnings of microbiology and biochemistry: the contribution of yeast research”, Microbiology (Reading, Engl.), pp 557-567 Chuyên ngành Vi sinh vật học 57 z Khóa 2011-2013 Luận văn thạc sĩ khoa học Nguyễn Xuân Việt 10 Barth G, Gaillardin C (1997), “Physiology and genetics of the dimorphic fungus Yarrowia lipolytica”, FEMS Microbiology Reviews, 19, pp 219-237 11 Beoloupos A, Mrozova Z, Thevennieau F, Le Dall MT, Hapala I, Papanikolaou S, Chardot T, Nicaud JM (2008), “Control of lipid accumulation in the yeast Yarrowia lipolytica”, Applied and Environmental Microbiology, 74(24), pp 77797789 12 Berger R.G (1986), “Biosynthesis of Flavor Compounds by Microorganisms Odorous Constituents of Polyporus durus”, (Basidiomycetes), Volume 41, Section C, A European journal of biosciences, pp 559-563 13 Boog ALGM, Peters ALJ, Ross R (1998), “Process for producing γdecalactone”, Unite States patent 5.789.212 14 Chanika S, Benjamas C, thanwadde T.S and Thanwien B (2011), “Efficicient concomitant production of lipids and carotenoids by oleaginous red yeast Rhodotorula glutinis culture in palm oil mill effuluent and application of lipids for biodiesel production”, Biotechnology and Bioprocess Engineering, 16(1), pp 23-33 15 Cheetham P.S.J., Maume K.A, De Rooij J.F.M (1993), “Method of producing gamma hydroxydecanoic acid or its lactone by feeding a ricinoleic acid source to Sporobolomyces odrus or Rhodotorula glutinis”, United States Patent 5.219.742 16 Coelho M.A.Z, Amaral P.F.F and Belo I (2010), “Yarrowia lipolytica : an industrial work horse”, Current Research, Technology and Education Topic in Applied Microbiology and Microbial Biotechnology, Vol 2, pp 930-944 17 Farbood MI, Willis BJ (1985), “Production of γ-decalactone”, Unite States Patent 4.560.656 18 Fickers, P., Benetti, P.H., Wache, Y., Marty, A., Mauersberger, S., Smit, M.S and Gerold Barth, Claude Gaillardin, (1996), “Physiology and genetics of the dimorphic fungus Yarrowia lipolytica” 19 Gatfield, I.-L (1999), “Biotechnological production of natural flavor materials”, In Flavor Chemistry: 30 Years of Progress ed, Teranishi, R., Wick, E.L and Hornstein, I., pp 211–227 New York: Kluwer Academic, Plenum Publishers Chuyên ngành Vi sinh vật học 58 z Khóa 2011-2013 Luận văn thạc sĩ khoa học Nguyn Xuõn Vit 20 Gateld, I.-L., Guăntert, M., Sommer, H., and Werkhoff, P.(1993), “Some aspects of the microbiological production offlavor-active lactones with particular reference to γ-decalactone”, Chem Microbiol Technol Lebensm, 15, pp 165–170 21 Gill C.O, Haill M.G, and Ratledge C (1977), “Lipid accumulation in an oleaginous yeast (Candida 107) growing on glucose in single – stage continous culture”, Appl Environ Microbiol 1977 February, 33(2), pp 231-239 22 Gomes N, Teixeira JA, Belo I (2012), “Fed-batch culture of Yarrowia lipolytica for γ-decalactone production from methyl ricinolate”, Biotechnol Lett, 34, pp 649654 23 Gopinath M, Vijayakumar L, Dhannasekar R, Viruthagiri T (2008), “Microbial biosynthetic of γ-decalactone and its applications”, Global Journal of Biotechnology, Biochemistry, 3(2), pp 60-68 24 Groguenin, A., Wache ´, Y., Escamilla Garcı´a, E., Aguedo, M., Husson, F., Ledall, M.-T., Nicaud, J.-M., and Belin, J.-M (2004), “Genetic engineering of βoxidation pathway in the yeast Yarrowia lipolytica to increase the production of aroma compounds”, J Molec Catal B, 28, pp 75–79 25 Le Clainche A (1997), “Mtrise de la production de γ-lactone par la levure Yarrowia lipolytica : mise en évidence de l’existence d’une famille multigénitique d’acyl-CoA oxydases” 26 Li Y, Zongbao Z, and Fengwu B (2007), “High density cultivation of oaleagious yeast Rhodosparidrum toruloides Y4 in fed-batch culture”, Enzyme and and Microbial Technology, 41(3), pp 312-317 27 Martina Carnecka, Andrea Halienova, Radka Koci, “Production of carotenoidergosterol-supplemented biomass by red yeast Rhodotorula glutinis grown under external stress”, Food Technology and Biotechology, Vol 48 (1) 28 Mediaros ABP, Pandey A, Vandenberghe LPS, Pastore GM, Soccd CR (2006), “Prodution and recovery of aroma compounds produced by solid-state fermentation using different adsorbents”, Food technol Biotechnol, 44, pp 47-51 Chuyên ngành Vi sinh vật học 59 z Khóa 2011-2013 Luận văn thạc sĩ khoa học Nguyễn Xuân Việt 29 Moradi H, Asadllahi MA, Nahvi I (2013), “Improved γ-decalactone production from castor oil by fed-batch culture cultivation of Yarrowia lipolytica”, Biocatalysis and Agriculture Biotechnology, 2, pp 64-68 30 Nadal M, García-Pedrajas MD, Gold SE (2008), “Dimorphism in fungal plant pathogens”, FEMS Microbiol Lett, 284, pp 127–134 31 Pagot Y, Le Clainche A, Nicaud JM, Waché Y, Belin JM (1998), “Peroxisomal β-oxidation activities and γ-decalactone production by the yeast Yarrowia lipolytica”, Appl Microbiol Biotechnol , 49, pp 295-300 32 Papaparaskevas D, Christakopoulos P, Kelos D, Macris BJ (1992), “Optimizing production of extracellular lipase from Rhodotorula glutinis”, Biotechnology Lett, 14, pp 397-402 33 Rabenhorst J, Gatfield I (2002), “Method of producing γ-decalactone using Yarrowia lipolytica strain HR 145 (DSM 12397)”, Unite States Patent 6.415.565 34 Rabenhorst J, Gatfield I (2012), “Method of producing γ-decalactone using Yarrowia lipolytica strain HR 124 (DSM 12397)”, Unite States patent N0 6451565 B1 35 Rodrigues G, Pais C (2007), “The influence of acetic and other weak carboxylic acids on growth and cellular death of the yeast Yarrowia lipolytica”, Food Technology and Biotechnology, 38, pp 27-32 36 Ruiz-Herrera J, Sentandreu R (2002), “Different effectors of dimorphism in Yarrowia lipolytica”, Arch Microbiol, 178, pp 477–483 37 Souchon I, Spinnler HE, Dufoss L,Voilleg A (1998), “Trapping of γdecalactone by adsorption on hydrophobic sorbents: application to the bioconversion of methyl ricinoleate by the yeast”, Sporidiobolus salmonicolor Biotechnol tech, 12, pp 109-113 38 Suryadi I, Suresh B (2000), “Adsorption of flavor ester on granular activated carbon”, CanjChem Eng, 78, pp 892-901 39 Waché Y et al., (2001), “Role of β-oxidation enzymes in γ-decalactone production by the yeast Yarrowia lipolytica”, Appl Environ Microbiol., 67(12), pp 5700-5704 Chuyên ngành Vi sinh vật học 60 z Khóa 2011-2013 Luận văn thạc sĩ khoa học Nguyễn Xuân Việt 40 Waché Y et al., (2002),“Optimization of Yarrowia lipolytica 's β-oxidation pathway for γ-decalactone production”, J Mol Catal B: Enzym , pp 347-351 41 Waché Y, Aguedo M, Nicaud JM, Belin JM (2003), “Catabolism of hydroxyacids and biotechnological production of lactones by Yarrowia lipolytica”, Applied Microbiology and Biotechnology, 61, pp 393-600 Chuyên ngành Vi sinh vật học 61 z Khóa 2011-2013 ... vi sinh vật chưa quan tâm nghiên cứu nhiều Vì lẽ đây, chúng tơi tiến hành đề tài ? ?Nghiên cứu điều kiện nuôi cấy, chuyển hóa sinh học thu nhận γ- decalactone từ dầu thầu dầu nấm men Yarrowia lipolytica? ??...ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN NGUYỄN XUÂN VIỆT NGHIÊN CỨU ĐIỀU KIỆN NI CẤY, CHUYỂN HĨA SINH HỌC VÀ THU NHẬN - DECALACTONE TỪ DẦU THẦU DẦU BẰNG NẤM MEN Yarrowia lipolytica. .. chọn điều kiện chiết rút thu nhận γ- decalactone từ dịch lên men 44 Chuyên ngành Vi sinh vật học Khóa 2011-2013 z Luận văn thạc sĩ khoa học Nguyễn Xuân Việt 3.3.1 Lựa chọn điều kiện chiết rút γ- decalactone
Ngày đăng: 16/03/2023, 09:17
Xem thêm: