Phần 1 Phần 1 MỞ ĐẦU I Đặt vấn đề Bệnh bạc lá lúa do vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv oryzae (Xoo) gây ra, là một trong những bệnh nhiệt đới điển hình gây hại đối với nhiều vùng trồng lúa khác nhau trên[.]
Phần MỞ ĐẦU I Đặt vấn đề Bệnh bạc lúa vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv oryzae (Xoo) gây ra, bệnh nhiệt đới điển hình gây hại nhiều vùng trồng lúa khác giới Đối với miền Bắc nước ta, bệnh gây hại vụ xuân lẫn vụ mùa hại nhiều giống khác nhau, đặc biệt vụ mùa giống lúa lai nhập nội từ Trung Quốc Để phòng trừ người ta sử dụng nhiều biện pháp khác nhau, áp dụng biện pháp kỹ thuật canh tác, bón phân sớm, cân đối, vệ sinh đồng ruộng, mật độ gieo trồng hợp lý dùng giống kháng bệnh, chọn tạo giống kháng bệnh có ý nghĩa kinh tế nhiều mặt, không gây ô nhiễm môi trường tạo nông sản Để tạo giống kháng bệnh bạc bền vững trước hết phải có nguồn gen kháng bệnh, sau phải xác định xác số thành phần chủng có vùng, nghiên cứu xác định gen kháng bệnh hữu hiệu quy tụ nhiều gen kháng vào giống Hiện người ta xác định 29 gen kháng bệnh bạc khác giới, tương ứng xác định nước có số chủng gây bệnh định Philippin có chủng, Ấn độ chủng, Nhật Bản có 12 chủng Ở Việt Nam, theo Phan Hữu Tôn cộng sự, 2002 sở lây nhiễm dòng đẳng gen, dựa vào phổ kháng nhiễm tạm thời phân miền Bắc tồn 10 chủng Đồng thời xác định gen kháng hữu hiệu Xa4, xa5, Xa7 Xa21, kháng mạnh kháng hầu hết chủng vi khuẩn phân lập Tuy nhiên, phương pháp lây nhiễm nhân tạo có số nhược điểm phụ thuộc vào môi trường, tốn thời gian, nhiều kết thu chưa thật xác Để khắc phục nhược điểm cần thiết phải xác định cách xác đa dạng di truyền chủng mức phân tử DNA Trên giới có nhiều cơng trình nghiên cứu sử dụng thị phân tử DNA việc phân lập xác định chủng vi sinh vật gây bệnh Lee cộng sự, 2005 lần công bố xác định trình tự DNA genom vi khuẩn Xoo, vịng genom dài 4,9 triệu bp, xác định số vùng bảo thủ vùng dễ biến động, sở phân tử để phân chủng khác Sau Tika cộng sự, 1999 sử dụng phương pháp rep-PCR IS-PCR để nghiên cứu đa dạng di truyền 171 chủng vi khuẩn Xoo phân lập Nepal phân 31 nhóm chủng khác Tuy nhiên, Việt Nam việc nghiên cứu ứng dụng thị phân tử DNA để xác định cách xác chủng vi khuẩn bệnh bạc lúa chưa tiến hành Vì vậy, phân công hướng dẫn thực đề tài: “Nghiên cứu đa dạng di truyền chủng vi khuẩn bạc lúa Xanthomonas oryzae pv oryzae miền Bắc Việt Nam” II Mục đích yêu cầu Mục đích Nghiên cứu xác định đa dạng di truyền mức phân tử DNA chủng vi khuẩn gây bệnh bạc sử dụng kỹ thuật rep – PCR IS-PCR, phục vụ công tác chọn tạo giống lúa kháng bệnh bền vững Yêu cầu - Nuôi cấy, phân lập thành cơng xác định xác mẫu vi khuẩn Xoo - Lây nhiễm dòng đẳng đơn gen, xác định tính độc mẫu vi khuẩn phổ kháng nhiễm - Sử dụng kỹ thuật rep – PCR IS-PCR theo phương pháp Tika cộng sự, 1999 xác định đa dạng di truyền mẫu vi khuẩn Xoo, sở phân chia chủng Phần TỔNG QUAN TÀI LIỆU I Tổng quan bệnh bạc vi khuẩn Xoo Tổng quan bệnh bạc lúa 1.1 Lịch sử phát bệnh Bệnh bạc lúa phát Fukuoka - Nhật Bản vào năm 1884 Ban đầu người ta lầm tưởng nguyên nhân gây nên triệu chứng bệnh acid đất (Bokura, 1911) Nhưng khơng lâu sau đó, người ta cơng nhận nguyên nhân vi khuẩn gây nên theo Ishiyama,1922 thuộc loại Bacillus oryzae Vi khuẩn sau Tagami, Mizukami, 1962 Mizukami, Wakimoto, 1969 đặt tên Pseudomonas oryzae, cuối Oku, 1972 xác định vi khuẩn Xanthomonas oryzae gây nên Bệnh bạc lúa trở nên phổ biến tất vùng trồng lúa khắp giới vào cuối thập kỉ 60 đến đầu thập kỉ 80 kỉ XX, đặc biệt nước trồng lúa Châu Á như: Ấn Độ (1990), Philippin (1957), Indonexia (1950), Trung Quốc (1957) Ở Việt Nam, bệnh phát từ sau hịa bình lập lại (1945) giống lúa địa phương cao Sau đó, phong trào thâm canh lúa tăng cao làm bệnh bạc lúa phát triển mạnh diện rộng phức tạp, khó phịng trừ thường xun gây hại nặng vụ mùa Bệnh phát triển thành dịch lớn số tỉnh Đồng sơng Hồng vịng từ năm 1968 – 1975 Trong năm gần đây, miền Bắc thiệt hại bệnh bạc lúa có xu hướng tăng trở lại gây hại vụ xuân 1.2 Tác hại bệnh bạc lúa gây Bệnh bạc vi khuẩn Xoo tìm thấy tất vùng trồng lúa giới Hàng năm, theo thống kê suất lúa toàn giới giảm từ 10-20% bệnh vi khuẩn, 50% bệnh bạc gây nên (Mew, 1989) Ở Việt Nam bệnh phát từ lâu giống lúa mùa cũ Hiện nay, bệnh gây hại lúa lai lúa thuần, đặc biệt gây hại nặng giống lúa lai nhập nội từ Trung Quốc Tác hại bệnh nặng hay nhẹ tuỳ thuộc vào giống lúa, thời điểm bị nhiễm bệnh mức độ nhiễm nặng hay nhẹ Tác hại bệnh chủ yếu làm cho địng sớm tàn khơ xác, giảm quang hợp, tăng lượng hạt lép, dẫn đến giảm suất lúa Theo nghiên cứu Tika, Mew & cộng sự, 1999 suất giảm chủ yếu thay đổi số nhánh, số hạt khối lượng 1000 hạt 1.3 Triệu chứng bệnh Vi khuẩn Xoo gây triệu chứng điển hình bệnh bạc lúa là: bạc lá, vàng nhợt, héo xanh (còn gọi Kresek) Cho đến mối quan hệ triệu chứng chưa làm sáng tỏ, nhiều thí nghiệm nhà lưới chứng minh tượng Kresek bạc khác rõ rệt chúng triệu chứng ban đầu nhiễm bệnh Các giống lúa khác biểu triệu chứng nhiễm Kresek bạc Triệu chứng vàng nhợt ảnh hưởng sau, hậu bạc hay Kresek gây nên độc tố (toxin) vi khuẩn sản sinh Bệnh gây hại từ thời kỳ mạ đến lúa chín, triệu chứng bệnh biểu rõ vào giai đoạn lúa trỗ, chín Khi bị bệnh, vết bệnh lan dần từ mép vào phiến lá, kéo dài theo gân chính, có vết bệnh từ phiến lan rộng Vết bệnh lan từ mép vào gân theo đường gợn sóng Vào lúc trời ẩm buổi sáng sớm, đầu mép có dạng giọt vi khuẩn dịch màu vàng, gặp trời nắng tạo thành dạng hạt keo vi khuẩn màu hổ phách Hiện có hai dạng triệu chứng bạc gợn vàng bạc tái xanh Trong đó, dạng bạc gợn vàng phổ biến 1.4 Quy luật yếu tố ảnh hưởng đến phát sinh, phát triển bệnh 1.4.1 Quy luật phát sinh, phát triển Bệnh bạc phát sinh phát triển mạnh vụ mùa tỉnh phía Bắc Bệnh phát triển, lây lan nhanh điều kiện nhiệt độ 26-29°C, ẩm độ 90 %, đặc biệt có mưa to gió lớn làm rập nát lúa tạo thuận lợi cho bệnh truyền lan Vì vụ mùa bệnh thường gây tác hại nặng vụ xuân Vụ chiêm xuân bệnh phát triển mạnh vào tháng 5-6, cịn vụ mùa tháng 8-9 có nhiều mưa bão gây tổn thương cho lúa Nhìn chung, bệnh phát triển mạnh vào giai đoạn lúa làm đòng đến chín sữa giai đoạn lúa mẫn cảm với bệnh bạc Từ nghiên cứu gần vi khuẩn bạc Xoo cho thấy vùng, lãnh thổ lại có số chủng vi khuẩn bạc đặc trưng Sự có mặt chủng vi khuẩn bạc phụ thuộc vào cấu giống lúa điều kiện tự nhiên vùng Như Philipin tồn chủng, Nhật Bản 12 chủng, Ấn Độ chủng (Tika B Adhikari cộng sự, 1999) Còn Việt Nam, theo nghiên cứu Phan Hữu Tôn cộng năm 2002 phân lập xác định miền Bắc Việt Nam có 10 chủng tồn Gần đây, nghiên cứu bệnh bạc 15 tỉnh miền Bắc, Nguyễn Văn Viết cộng sự, 2005 nhận thấy nhóm chủng Xoo thường xuất đan xen, địa phương xuất nhiều nhóm chủng, trái lại nhóm chủng diện nhiều địa phương Trên vết bệnh đơi tồn chủng vi khuẩn định 1.4.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến phát sinh, phát triển bệnh Có nhiều yếu tố ngoại cảnh ảnh hưởng đến phát sinh phát triển bệnh Ẩm độ lượng mưa hai yếu tố định cho phát sinh phát triển bệnh bạc lá, lượng mưa lớn nhiều kèm theo gió bão khơng làm tổn thương đến khiến vi khuẩn dễ dàng xâm nhập mà tạo điều kiện cho vi khuẩn sinh sản nhanh, tạo nhiều giọt dịch vi khuẩn lây lan nhanh chóng Phân bón thời kỳ bón yếu tố ảnh hưởng rõ rệt đến phát sinh phát triển bệnh Lượng đạm bón lớn làm thân phát triển mạnh, mềm yếu dễ bị tổn thương nên dễ bị nhiễm bệnh Bón sớm, tập trung giảm khả bị bệnh so với bón muộn, rải rác Bón đạm cân lân kali làm giảm khả nhiễm bệnh Tuy nhiên, bón q nhiều đạm (>120 kg N/ ha) bón thêm lân kali khơng cịn tác dụng Đất màu mỡ nhiều chất hữu bệnh phát triển chân đất cằn cỗi Những nơi đất chua, ngập úng, nhiều mùn, lúa bị che bóng bệnh phát triển mạnh Giống yếu tố ảnh hưởng đến phát sinh phát triển bệnh bạc Các giống lúa cũ, lúa địa phương nhiễm bệnh nhẹ so với giống lúa nhập nội có thời gian sinh trưởng ngắn, phàm ăn Theo điều tra Viện bảo vệ thực vật giống lúa lai Trung Quốc nhập nội từ năm 1993 – 1997 hầu hết bị nhiễm bệnh bạc với mức tỷ lệ bệnh 50-80%, cấp phổ biến 5-7, bệnh nặng suất giảm 20-50% 1.5 Nghiên cứu cách chẩn đoán bệnh bạc Hiện có nhiều phương pháp khác để chẩn đốn bệnh bạc Mỗi phương pháp có ưu nhược điểm riêng Có thể kể vài phương pháp kỹ thuật chẩn đoán phổ biến sau: - Phương pháp giọt dịch - Phương pháp ELISA - Phương pháp thấm hút tế bào trực tiếp (Direct tissue blotting) - Sử dụng que DNA/RNA - Phương pháp thấm hút nén (Squash blot method) - Phương pháp sử dụng kỹ thuật PCR với cặp mồi XOR theo Adachi cộng sự, 1990 Trong số phương pháp kể phương pháp Adachi, 2000 tiên tiến cho kết xác Phương pháp khắc phục nhược điểm phương pháp khác phương pháp thích hợp sử dụng điều kiện nghiên cứu phòng thí nghiệm Các bước thực phương pháp sau: thu thập mẫu bệnh, phân lập, chiết tách DNA chúng tiến hành PCR nhân đoạn DNA bảo thủ nằm gen tổng hợp cấu tử rDNA 16S 23S vi khuẩn Xoo với chu trình nhiệt độ thành phần phản ứng PCR thích hợp Sử dụng đọan mồi có trình tự: XOR-F: 5'- GCA TGA CGT CAT CGT CCT GT-3' XOR-R2: 5'- CTC GGA GCT ATA TGC CGT GC-3' 1.6 Các biện pháp phòng trừ bệnh bạc Các biện pháp canh tác bao gồm vệ sinh đồng ruộng, diệt trừ cỏ dại, phun thuốc trừ bệnh, tăng cường chăm sóc bón phân cách, thích hợp điều chỉnh mực nước hợp lý trồng giống kháng bệnh Ngồi cịn có biện pháp xử lý hạt giống trước gieo Cho đến nay, biện pháp sử dụng giống kháng bệnh coi biện pháp có hiệu khả thi Vi khuẩn Xoo 2.1 Đặc điểm hình thái cấu trúc Vi khuẩn Xoo thuộc họ Pseudomonadaceae, có dạng hình gậy hai đầu trịn, có lơng roi đầu, kích thước 1-2 x 0,5-0,9 µm Trên mơi trường nhân tạo khuẩn lạc cầu vi khuẩn có dạng hình trịn, màu vàng sáp, rìa nhẵn, bề mặt khuẩn lạc ướt, háo khí, nhuộm Gram âm Vi khuẩn khơng có khả phân giải nitrat, khơng dịch hố gelatin, khơng tạo NH 3, tạo H2S, tạo khí khơng tạo axít mơi trường có đường Nhiệt độ thích hợp cho vi khuẩn sinh trưởng từ 26 - 300C, nhiệt độ tối thiểu - 50C, tối đa 400C cao 530C làm vi khuẩn chết Vi khuẩn sống phạm vi pH rộng từ 5,7 - 8,5 thích hợp pH 6,8 - 7,2 Hình Ảnh hiển vi điện tử quét tế bào Hình Hình dạng tế bào vi vi khuẩn Xoo mạch dẫn khuẩn bệnh bạc lúa (Anna lúa Maselli, 1999) 2.2 Nghiên cứu đặc điểm genom Xoo Hiện có số nghiên cứu trình tự genom chủng vi khuẩn Xoo, gần phải kể đến cơng trình nghiên cứu cấu trúc genom hai chủng phổ biến là: MAF311018 (Nhật Bản) KACC10331 (Hàn Quốc), công bố website: http://microbe.dna.affrc.go.jp 2.2.1 Bộ genome Xoo chủng MAFF311018 Hinh Bản đồ genom vi khuẩn Xoo chủng MAFF311018 Hình phía trình bầy cấu trúc genom nhiễm sắc thể vi khuẩn Xoo chủng MAFF311018 biểu tám vịng trịn Vịng ngồi biểu chiều dài vùng gen đơn vị 100 kb, vịng thứ biểu vị trí gen theo hướng phiên mã khác tương ứng Những gen xác định rõ chức ký hiệu màu vàng, gen chưa xác định rõ chức ký hiệu màu xanh Vòng tròn thứ tư biểu vị trí tụ tập gen hrp gen gây độc avr ký hiệu màu xanh Vịng trịn thứ năm biểu vị trí trình tự gắn chèn Vịng thứ sáu biểu thị hàm lượng C + G trung bình 20 kb đoạn Vòng số bẩy biểu vị trí gen mã hóa tạo tRNA rRNA vi khuẩn Cuối vòng số tám biểu vị trí prophage gen phage Theo genom Xoo chủng MAFF 311018 gồm nhiễm sắc thể vòng dài 4.940.217 bp, với hàm lượng G+C trung bình chiếm 63,7% Bên khơng phát thấy có chứa thể plasmid Trong phát thấy có hai copy operon rrn thứ tự liền kề số gen sau: 16S-tRNAAla -tRNAIle -23S-5S Genom chứa tổng số 53 gen mã hóa tạo thành tRNAs đại diện cho 43 loại tRNA khác Trong tổng số 4.372 khung đọc mở phát (ORFs) genom chủng MAFF311018 có 2.799 (64%) gen xác định chức năng, 1.383 (32%) proteins xác định tương đồng với nhiều protein điển hình vi khuẩn Xoo chưa biết rõ chức Có 190 gen (4%) xác định không tương đồng rõ rệt với gen xác định cơng bố trước vi khuẩn 2.2.2 Cấu trúc genom chủng KACC10331 Theo Lee cộng sự, 2008 genom vi khuẩn Xoo chủng KACC10331 có cấu trúc sau: Tổng genom nhiễm sắc thể vòng dài 4.941.439 bp, với hàm lượng C + G chiếm 63.7% Genom có 4637 khung đọc mở, có 3340 (72.0%) xác định chức Khoảng 80% số gen phát thấy loài vi khuẩn X axonopodis pv citri (Xac) X.campestris pv campestris (Xcc) Tuy nhiên, 245 gen xác định đặc thù Xoo, có gen gây độc Đồng thời nhóm tác giả cịn xác định vị trí gen tạo phản ứng siêu mẫn (hrp), gen sinh vỏ polysaccharide, gen mã hóa tạo 10 ... hướng dẫn thực đề tài: ? ?Nghiên cứu đa dạng di truyền chủng vi khuẩn bạc lúa Xanthomonas oryzae pv oryzae miền Bắc Vi? ??t Nam? ?? II Mục đích yêu cầu Mục đích Nghiên cứu xác định đa dạng di truyền mức... 2.5 Nghiên cứu đa dạng vi khuẩn Xoo Vi? ??t Nam Những nghiên cứu rề đa dạng vi khuẩn Xoo miền Bắc Vi? ??t Nam thường sử dụng phương pháp lây nhiễm nhân tạo dòng lúa đẳng đơn gen (gen kháng bệnh bạc lá) ... cứu đa dạng di truyền 171 chủng vi khuẩn Xoo phân lập Nepal phân 31 nhóm chủng khác Tuy nhiên, Vi? ??t Nam vi? ??c nghiên cứu ứng dụng thị phân tử DNA để xác định cách xác chủng vi khuẩn bệnh bạc lúa