MỞ ĐẦU MỞ ĐẦU Bưởi (Citrus grandis L ) là cây ăn quả có tác dụng bổ dưỡng và có nhiều giá trị về mặt y học Bưởi được trồng rộng rãi ở Việt Nam, tuy nhiên, mỗi vùng có một số giống bưởi khác nhau do kế[.]
1 MỞ ĐẦU Bưởi (Citrus grandis L.) ăn có tác dụng bổ dưỡng có nhiều giá trị mặt y học Bưởi trồng rộng rãi Việt Nam, nhiên, vùng có số giống bưởi khác kết trình chọn lọc ảnh hưởng điều kiện khí hậu thổ nhưỡng Trên đất nước ta từ lâu hình thành vùng trồng bưởi giống bưởi tiếng bưởi Đoan Hùng (Phú Thọ), bưởi Đường Hương Sơn (Hương Sơn, Hà Tĩnh), bưởi Phúc Trạch (Hương Khê, Hà Tĩnh), bưởi Thanh trà (Huế), bưởi Biên Hòa (Đồng Nai), bưởi Năm roi, bưởi Da xanh (Vĩnh Long)… [1] Các giống bưởi mặt hình thái khác không đáng kể, từ lá, hoa hình dạng trái Sự khác thể màu sắc cùi quả, cách xếp múi, màu sắc mùi vị tép Hiện nay, nước ta bưởi trồng phổ biến đem lại thu nhập cao cho bà nơng dân Bưởi có nhiều giống trồng từ lâu có nhiều giống du nhập từ miền Bắc miền Nam Để đánh giá mức độ di truyền việc dựa vào thị hình thái chưa đủ mà cần có đánh giá sâu cấu trúc di truyền, cụ thể hệ gen Các kỹ thuật sinh học phân tử công cụ hữu hiệu, ứng dụng rộng rãi để phân tích tính đa dạng di truyền xác định mối quan hệ họ hàng loài với Trong năm gần đây, việc sử dụng thị phân tử giúp phát biến dị giống bưởi hay có múi trở nên phổ biến Việt Nam giới Các thị phân tử cho kết có độ xác cao, tiết kiệm thời gian đặc điểm phân tử thường độc lập với đặc điểm hình thái Kỹ thuật RAPD (Random amplified polymorphic DNA) kỹ thuật sinh học phân tử dựa kỹ thuật PCR, cách sử dụng primer ngắn (khoảng 10 nucleotide) có trình tự biết trước, bắt cặp nhân ngẫu nhiên đoạn DNA có trình tự bổ sung với trình tự primer Theo nguyên tắc, cá thể hoàn toàn giống nhau, sau thực phản ứng PCR-RAPD điều kiện tạo số lượng đoạn chiều dài đoạn tương ứng Khi có đột biến làm xuất hay vị trí bắt cặp ngẫu nhiên tạo số lượng chiều dài đoạn DNA khác cá thể, kỹ thuật RAPD phát đột biến Kỹ thuật RAPD giúp nhận diện thị phân tử trội Việc ứng dụng kỹ thuật RAPD để nghiên cứu đa dạng di truyền nhiều tác giả quan tâm thực nhiều đối tượng vi sinh vật, thực vật động vật [63] Để phân biệt giống bưởi dựa đặc điểm di truyền, chọn đề tài “Nghiên cứu đa đạng di truyền số giống bưởi kỹ thuật RAPD” nhằm khảo sát sai khác band điện di thu Mục tiêu đề tài Sử dụng thị RAPD để nghiên cứu đa dạng di truyền số giống bưởi thu thập vùng khác Nội dung nghiên cứu - Thu thập mẫu giống bưởi tách chiết, tinh DNA tổng số - Phân tích đa dạng di truyền giống bưởi nghiên cứu kỹ thuật RAPD - Phân tích mối quan hệ di truyền giống bưởi nghiên cứu dựa giản đồ phả hệ DNA Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU I GIỚI THIỆU CHUNG VỀ BƯỞI VÀ GIÁ TRỊ CỦA BƯỞI Giới thiệu chung bưởi Những ghi nhận lịch sử phân tích di truyền kết luận có loài thực chi Citrus (thanh yên, quýt bưởi) nhiều dạng sinh học loài Cam, chanh, chanh cốm, bưởi chùm thừa nhận rộng rãi chúng giống mặt di truyền, tạo chọn lọc, nhân giống chiết ghép hay hạt Sự khác dạng có nguồn gốc từ đột biến soma Hơn nữa, nhiều hệ lai tạo người chọn lọc từ dạng ăn hay theo tiêu chí cơng nghiệp tạo nên đa dạng chi Citrus [52] Bưởi thuộc họ cam chanh (Rutaceae), họ Aurantioidae, tộc Citreaea, tộc Citrinae (Webber, 1967) Họ Rutaceae gồm tộc 33 chi Mỗi tộc Clauseneae Citreae tạo thành từ tộc: Clauseneae bao gồm Micromelinae, Clauseninae Merillinae; Citrinae gồm có Triphasiinae, Citrinae Balsamocitrinae Citrinae gồm nhóm Citrus nguyên thủy, gần giống Citrus Citrus thật Citrus thật gồm chi: Clymenia, Eremocitrus, Microcitrus, Poncitrus, Fortunella Citrus (Swingle and Reece, 1967) Hai hệ thống phân loại chi Citrus dùng phổ biến Swingle Tanaka Swingle (1967) cho chi Citrus có 16 lồi, Tanaka (1977) lại cho có đến 162 lồi Tuy nhiên, Scora (1975) cho có lồi yên (C medica), quýt (C reticulata), bưởi (C grandis C maxima) Papeda nhóm chi Citrus [62], [39] Bưởi thuộc đại mộc, cao khoảng 10 m Lá có phiến to, dày, gân phụ 56 cặp, cuống có cánh rộng có đốt vào phiến Hoa có chùm ngắn, trục có lơng, cánh hoa trắng, dài 3,5 cm, tiểu nhụy nhiều, dính Trái to, gần trịn, to 25-30 cm, bì dày, nạc quanh hột trong, ngà hay hường Bộ nhiễm sắc thể 2n=18 [8] Bưởi loài ăn thân gỗ, sống lâu năm, thường xanh quanh năm, thân cao, tán có dạng hình trịn tự nhiên, hình dẹt nón Cành thường to cam, quýt, cành phát triển mạnh Các phận lá, cành, cịn non thường phủ lớp lơng tơ mỏng Nhìn chung, có múi có rễ ăn cạn, rễ lông mọc yếu nên khả hấp thụ chất dinh dưỡng thấp [4], [16] Bưởi sinh sản hữu tính hạt hay nhân giống giâm, chiết cành Thông thường bưởi nhân giống hạt thường ý chăm sóc, chọn lọc nên có xu hướng ngày đa dạng so với loài kinh tế khác chi Citrus Bưởi xem trồng có khả thích nghi rộng với khí hậu điều kiện sống tự nhiên chúng vùng nhiệt đới ẩm [55] Bưởi trồng khắp giới, vùng nhiệt đới cận nhiệt đới, nơi mà mùa đơng có nhiệt độ ơn hịa, sống sót có đủ nước để sinh trưởng, phát triển (Gmitter cs, 1992) Chất lượng bưởi tốt vùng cận nhiệt đới Các vùng trồng Citrus phổ biến châu Mỹ (Brazil, Mỹ, Argentina Mexico), lưu vực Địa Trung Hải (Nam Âu, Tây Nam Á, Bắc Phi), châu Á (Trung Quốc, Ấn Độ Nhật Bản) Nam Phi Theo FAO (2006), sản lượng bưởi bưởi chùm giới triệu tấn, trồng 74 quốc gia với diện tích 264.000 Mỹ nước có sản lượng bưởi bưởi chùm lớn giới Vùng Đông Nam Á, đặc biệt Đông Ấn Độ, Bắc Burma Tây Nam Trung Quốc xem trung tâm phát sinh đa dạng chi Citrus chi có quan hệ gần gũi với Tổng sản lượng chi Citrus tồn cầu thời gian 2004-2005 105,4 triệu [36] Giá trị bưởi Bưởi có nhiều giá trị mặt y học đồng thời thực phẩm ăn kiêng tốt cho nhiều loại bệnh Bưởi sử dụng trực tiếp hay chế biến thành nhiều ăn khác loại mứt, bánh kẹo, gỏi nước uống [22] Theo Bộ nông nghiệp Hoa Kỳ, thành phần dinh dưỡng bưởi xác định bảng 1.1 Bảng 1.1 Thành phần dinh dưỡng bưởi Thành phần Nước Năng lượng Protein Lipid tổng số Tro Carbohydrate Chất xơ Chất khoáng Calcium Sắt Magnesium Phosphorus Potassium Sodium Kẽm Đồng Mangan Vitamin Vitamin C Thiamin Riboflavin Niacin Vitamin B-6 Vitamin A, IU Cholesterol Thành phần khác β-Carotene α-Carotene β-Cryptoxanthin Hàm lượng (100 g phần ăn được) 89,10 g 38 kcal 0,76 g 0,04 g 0,48 g 9,62 g 1,0 g mg 0,11 mg mg 17 mg 216 mg mg 0,08 mg 0,048 mg 0,017 mg 61,0 mg 0,034 mg 0,027 mg 0,220 mg 0,036 mg IU mg µg µg 10 µg Nguồn: United States Department of Agriculture (USDA), 2004 Trong dung dịch nước ép múi bưởi có khoảng 9% citric acid, 14% đường Ngồi cịn có lycopin, enzyme amylase, peroxidase, vitamin C (50 mg 100 g dịch ép), vitamin A B [11] Phần vỏ bưởi sử dụng để làm mứt dùng làm nguyên liệu hộp thùng chứa Hoa, hạt bưởi ứng dụng mục đích y tế Hoa bưởi cịn sử dụng để tách chiết chất trình chế tạo nước hoa pectin tách từ vỏ [55] Bưởi xem nguồn vitamin C hợp chất giúp tăng cường sức khỏe carotenoids, flavonoids, linonoids chất xơ (Yu cs, 2005) Các chất có khả chống chất sinh ung thư kháng đột biến, giúp người chống lại bệnh tật Ngoài ra, hoạt tính chống oxy hóa bưởi cịn liên quan đến diện nhiều loại polyphenols acid ascorbic [56] Bưởi chứa nhiều loại flavonoid có cấu trúc khác nhau, bao gồm flavanone flavone O- C-glycosides, ngồi cịn có methoxylated flavone Mỗi nhóm hợp chất biểu hoạt tính cao chống viêm trị ung thư Có chứng cho tác dụng sinh học flavonoid bưởi có liên quan đến tương tác chúng với enzyme điều hịa chủ chốt tác động đến kích hoạt tế bào gắn kết thụ thể Các flavonoid bưởi biểu hoạt tính thấp tế bào khỏe mạnh, bình thường, biểu đặc tính gây độc thấp rõ rệt lồi động vật Những chất mở rộng ảnh hưởng chúng thể thông qua cảm ứng enzyme gan I II, thông qua hoạt động sinh học chất chuyển hóa chúng Như vậy, có chứng rõ ràng đặc tính tiềm hợp chất việc tăng cường sức khỏe người [50] Carotenoid xem tiền chất vitamin A – chất quan trọng chế độ ăn người động vật; ngồi cịn đóng vai trị chất chống oxy hóa, giúp giảm nguy mắc bệnh ung thư (Olson, 1989) Bưởi nguồn phức hệ carotenoid với số lượng carotenoid lớn tìm thấy loại trái Nồng độ thành phần carotenoid thay đổi lớn loài bưởi phụ thuộc vào điều kiện phát triển (Gross, 1987) [46] Ngày nay, khoa học khám phá thêm đặc tính trị liệu bưởi Trong bưởi chứa nhiều pectin, chất sợi hòa tan chứa polysaccharide giúp hấp thu cholesterol thức ăn muối mật nên làm giảm cholesterol máu [11] II ỨNG DỤNG CỦA CÁC KỸ THUẬT SINH HỌC PHÂN TỬ TRONG NGHIÊN CỨU ĐA DẠNG DI TRUYỀN Ở CHI CITRUS Trong xu hướng nay, để chọn giống trồng hay xác định nguồn gốc loài trồng người ta thường sử dụng thị phân tử (marker) Việc sử dụng thị phân tử cho kết có độ xác cao, tiết kiệm thời gian đặc điểm phân tử thường độc lập với đặc điểm hình thái, khơng chịu tác động môi trường chủ động nghiên cứu Việc sử dụng kỹ thuật sinh học phân tử cơng cụ đắc lực để phân tích tính đa dạng di truyền nhiều loài Gần đây, phân tích phân tử phân tích trình tự đoạn nucleotide lặp lại đơn giản (SSR-Simple sequence repeat), hay microsatellite đoạn hai SSR (ISSR-Inter-simple sequence repeat), đa hình chiều dài đoạn cắt hạn chế (RFLP-Restriction fragment length polymorphism), đa hình đoạn khuếch đại ngẫu nhiên (RAPD-Random amplified polymorphic DNA), đa hình đoạn khuếch đại với primer đặc hiệu (SCAR-Sequence characterized amplified region), phản ứng RAPD cho gen ctv (CAPS)… sử dụng để kiểm tra mối quan hệ họ hàng số nhóm phân loại chi Citrus [52] So sánh với phương pháp truyền thống phân loại nghiên cứu đa hình thị phân tử cho kết có độ tin cậy cao [3] Trong số thị RAPD sử dụng phổ biến để phân biệt loài khác hay để xác định đồ gen loài thực vật Kỹ thuật sử dụng thành công việc xác định đa hình cà chua, mâm xôi, táo mơ (Bogani cs, 1994; Davis cs, 1995; Dubouzet cs, 1997; Mariniello cs, 2002; Tartarini, 1996; Warburton cs, 1996) [51] Ứng dụng kỹ thuật RAPD phân tích đa dạng di truyền Kỹ thuật RAPD dựa nguyên tắc PCR, sử dụng primer ngắn không đặc hiệu để nhân đoạn DNA genome cách ngẫu nhiên [9] Sự đa hình RAPD tạo thành từ thay đổi nucleotide, ví dụ chèn đoạn hay đoạn dẫn đến thay đổi vị trí kết hợp primer (Williams cs, 1993) Những sản phẩm khuếch đại đa hình sử dụng thị di truyền (Tingey and del Tufo, 1993) [65] RAPD kỹ thuật dễ thực có giá thành rẻ, với ưu điểm bật cần lượng nhỏ DNA khn mẫu, khơng tạo thành phóng xạ cho kết phân tích nhanh mà khơng địi hỏi thơng tin tình tự DNA loài (Williams et al., 1990; Martin et al., 1997) Mặc dù số trường hợp, kỹ thuật RAPD có khả lặp lại thấp vấn đề khắc phục cách tối ưu hóa điều kiện phản ứng (Weising et al., 1995) Nhìn chung, RAPD cung cấp liệu có giá trị đa dạng di truyền bên quần thể loài (Lynch and Milligan, 1994; Collignon et al., 2002) [47] Trong kỹ thuật RAPD primer ngẫu nhiên chứa 10 nucleotide cho kết khuếch đại tốt (Coletta Filho cs, 1998; Elisiario cs, 1999) Trong chi Citrus, RAPD sử dụng để xác định đột biến loài chanh (Deng cs, 1995), xây dựng đồ gen (Cai cs, 1994), xác định thị liên quan với đặc điểm nông học (Cheng Roose, 1995; Gmitter cs, 1996) cho nghiên cứu phân loại học (Luro cs, 1992) [33] Tính đa dạng sinh học lồi có múi Gò Quao (Kiên Giang) Nguyễn Hữu Hiệp cs (2004) nghiên cứu dựa vào đặc điểm hình thái phân tử Các đặc điểm hình thái học cho thấy có múi Gị Quao, Kiên Giang chia làm nhóm bao gồm: bưởi, cam, quýt, chanh hạnh Sử dụng primer OPA02, OPA04, OPA11 OPA13 (Operon Technologies, CA) phân tích đa dạng di truyền kỹ thuật RAPD cho kết 49 thị phân tử ghi nhận Giản đồ phả hệ cho thấy có múi Gị Quao, Kiên Giang chia thành nhóm: bưởi, cam-quýt, chanh hạnh Kết phân tích cho thấy khoảng cách di truyền nhóm biến động từ 0-43% Trong 49 thị có 11 thị xuất 100% số cá thể, 26 thị 90%, thị 80%, thị 70%, thị 70% có thị 45% [7] Kỹ thuật RAPD sử dụng để phân biệt có nguồn gốc từ phôi tâm hợp tử tạo thành từ phép lai giống quýt Montenegrina (Citrus deliciosa Tenore) King (C nobilis Loureiro) Phôi tách từ hạt giống, nhân giống in vitro thích nghi điều kiện nhà kính Bốn primer ngẫu nhiên sử dụng để nhận biết 54 có nguồn gốc hữu tính từ tổng số 202 cá thể Mức độ đa hình primer phản ánh qua số lượng có nguồn gốc hợp tử thu primer Thuật tốn phân tích nhóm bố mẹ xếp cá thể vào nhóm riêng biệt với khoảng cách di truyền lớn 20% [23] Abkenar cs (2003) sử dụng kỹ thuật RAPD nghiên cứu đặc điểm phân tử khoảng cách di truyền loài Citrus Nhật Đối tượng nghiên cứu gồm 31 lồi Citrus khác nhau, có loài cam chua, loài ‘Yuzu’ 21 loài họ hàng Trong số 60 primer sử dụng có 27 primer lựa chọn với 108 thị tạo thành, 76 thị số đa hình, trung bình 2,8 thị primer Số lượng thị đa hình primer nằm khoảng từ đến kích thước thị từ 400 bp (OPA18) đến 3.200 bp (OPA01) Trong nghiên cứu này, số thị RAPD giúp phân biệt lồi trồng gần gũi: OPA17 (1.100) OPE20 (675) có ‘Kabosu’ mà khơng có ‘Aka kabosu’; tương tự OPA20 (1.400), OPB05 (990) OPE16 (1.000) có ‘Aka kabosu’ mà khơng có ‘Kabosu’ Cây phát sinh 10 loài tạo thành dựa khoảng cách di truyền cho thấy loài cam chua khác với loài ‘Yuzu’ họ hàng chúng Các lồi ‘Yuzu’ có mối quan hệ gần gũi với nhau, nhiên đa hình di truyền lồi nghiên cứu khác xác định dễ dàng kỹ thuật RAPD đa dạng di truyền loài cao, biểu lộ nguồn gốc khác chúng [18] Trong nghiên cứu nhằm xác định 10 giống chanh vùng Campania, miền Nam nước Ý, Mariniello cs (2004) sử dụng kỹ thuật RAPD với 44 primer ngẫu nhiên có độ dài 10 nucleotide Tất primer sử dụng phản ứng RAPD với DNA khuôn mẫu giống chanh nghiên cứu nhằm xác định đa hình Mọi primer tạo sản phẩm khuếch đại có primer tạo band dùng để xác định giống trồng Sản phẩm khuếch đại giống Sorrento thực phản ứng với primer OPL02 cho thấy diện band (1.000-1.200bp) mà khơng có giống khác Giống chanh tạo sản phẩm khuếch đại khuếch đại với primer OPL16 Ngồi ra, primer OPL14 cịn hữu ích xác định giống Amalfi với hình ảnh điện di biểu thị vắng mặt band có khối lượng phân tử cao thấp Giống Procida nhận dạng primer OPL19 với band khuếch đại đặc biệt có khối lượng phân tử thấp Cuối cùng, với việc sử dụng primer OPL31, giống Gloria d’Amalfi cho kết điện di khơng có band khối lượng phân tử cao Kết cho thấy mức độ tương đồng giống chanh nghiên cứu cao, lớn 80%, xếp chúng vào nhóm Nhóm thứ bao gồm giống Napoli S Agnello; nhóm thứ hai gồm Gloria d’Amalfi, Sorrento, Procida, Sfusato d’Amalfi, Variegato, and Cannellino; nhóm thứ ba nhóm thứ tư chứa giống Massa Lubrense Amalfi [51] Bastianel cs (2001) sử dụng thị RAPD để phân tích tương đồng mặt di truyền 15 giống thuộc chi Citrus (Citrus spp.) Brazil, bao gồm giống cam (C sinensis Osbeck), giống quýt (C reticulata Blanco, C nobilis Loureiro, C sunki Loureiro C deliciosa Tenore), cam chua (C aurantium L.), bưởi chùm (C paradisi Marcf.), bưởi (C grandis Osbeck), ... cứu đa dạng di truyền số giống bưởi thu thập vùng khác Nội dung nghiên cứu - Thu thập mẫu giống bưởi tách chiết, tinh DNA tổng số - Phân tích đa dạng di truyền giống bưởi nghiên cứu kỹ thuật RAPD. .. biệt giống bưởi dựa đặc điểm di truyền, chọn đề tài ? ?Nghiên cứu đa đạng di truyền số giống bưởi kỹ thuật RAPD? ?? nhằm khảo sát sai khác band điện di thu Mục tiêu đề tài Sử dụng thị RAPD để nghiên cứu. .. ngẫu nhiên tạo số lượng chiều dài đoạn DNA khác cá thể, kỹ thuật RAPD phát đột biến Kỹ thuật RAPD giúp nhận di? ??n thị phân tử trội Việc ứng dụng kỹ thuật RAPD để nghiên cứu đa dạng di truyền nhiều