Nghiên cứu ứng dụng công nghệ crisprcas9 chỉnh sửa promoter ossweet14 nhằm nâng cao tính kháng bệnh bạc lá ở giống lúa bắc thơm 7.

NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG CÔNG NGHỆ CRISPRCas9 CHỈNH SỬA PROMOTER OsSWEET14 NHẰM NÂNG CAO TÍNH KHÁNG BỆNH BẠC LÁ Ở GIỐNG LÚA BẮC THƠM 7.NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG CÔNG NGHỆ CRISPRCas9 CHỈNH SỬA PROMOTER OsSWEET14 NHẰM NÂNG CAO TÍNH KHÁNG BỆNH BẠC LÁ Ở GIỐNG LÚA BẮC THƠM 7.NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG CÔNG NGHỆ CRISPRCas9 CHỈNH SỬA PROMOTER OsSWEET14 NHẰM NÂNG CAO TÍNH KHÁNG BỆNH BẠC LÁ Ở GIỐNG LÚA BẮC THƠM 7.NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG CÔNG NGHỆ CRISPRCas9 CHỈNH SỬA PROMOTER OsSWEET14 NHẰM NÂNG CAO TÍNH KHÁNG BỆNH BẠC LÁ Ở GIỐNG LÚA BẮC THƠM 7.NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG CÔNG NGHỆ CRISPRCas9 CHỈNH SỬA PROMOTER OsSWEET14 NHẰM NÂNG CAO TÍNH KHÁNG BỆNH BẠC LÁ Ở GIỐNG LÚA BẮC THƠM 7.NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG CÔNG NGHỆ CRISPRCas9 CHỈNH SỬA PROMOTER OsSWEET14 NHẰM NÂNG CAO TÍNH KHÁNG BỆNH BẠC LÁ Ở GIỐNG LÚA BẮC THƠM 7.NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG CÔNG NGHỆ CRISPRCas9 CHỈNH SỬA PROMOTER OsSWEET14 NHẰM NÂNG CAO TÍNH KHÁNG BỆNH BẠC LÁ Ở GIỐNG LÚA BẮC THƠM 7.NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG CÔNG NGHỆ CRISPRCas9 CHỈNH SỬA PROMOTER OsSWEET14 NHẰM NÂNG CAO TÍNH KHÁNG BỆNH BẠC LÁ Ở GIỐNG LÚA BẮC THƠM 7.NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG CÔNG NGHỆ CRISPRCas9 CHỈNH SỬA PROMOTER OsSWEET14 NHẰM NÂNG CAO TÍNH KHÁNG BỆNH BẠC LÁ Ở GIỐNG LÚA BẮC THƠM 7.NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG CÔNG NGHỆ CRISPRCas9 CHỈNH SỬA PROMOTER OsSWEET14 NHẰM NÂNG CAO TÍNH KHÁNG BỆNH BẠC LÁ Ở GIỐNG LÚA BẮC THƠM 7.NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG CÔNG NGHỆ CRISPRCas9 CHỈNH SỬA PROMOTER OsSWEET14 NHẰM NÂNG CAO TÍNH KHÁNG BỆNH BẠC LÁ Ở GIỐNG LÚA BẮC THƠM 7.

BỘ GIÁO DỤC VÀĐ À O TẠO ok BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆTN A M - VŨ HỒI SÂM NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG CƠNG NGHỆ CRISPR/CAS9 CHỈNH SỬA PROMOTEROsSWEET14NHẰM NÂNG CAO TÍNH KHÁNG BỆNH BẠC LÁ Ở GIỐNG LÚA BẮC THƠM LUẬN ÁN TIẾN SĨ NÔNG NGHIỆP Hà Nội – 2023 BỘ GIÁO DỤC VÀĐ À O TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆTN A M - VŨ HOÀI SÂM NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG CƠNG NGHỆ CRISPR/CAS9 CHỈNH SỬA PROMOTEROsSWEET14NHẰM NÂNG CAO TÍNH KHÁNG BỆNH BẠC LÁ Ở GIỐNG LÚA BẮC THƠM Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học; Mã số: 9420201 LUẬN ÁN TIẾN SĨ NÔNGN G H I Ệ P NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOAHỌC: GS.TS Phạm XuânHội TS Nguyễn DuyPhương Hà Nội - 2023 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu tơi hướng dẫn Thầy hướng dẫn, với kinh phí hỗ trợ từ Đề tài: “Nghiên cứu ứng dụng công nghệ chỉnh sửa hệ gen để cải tạo tính trạng mùi thơm kháng bạc số giống lúa chủ lực Việt Nam”, năm 2017-2020 Các số liệu kết nghiên cứu luận án trung thực chưa cơng bố cơng trìnhkhác Tơi xin cam đoan giúp đỡ, hợp tác cho việc thực luận án cảm ơn thơng tin trích dẫn luận án dẫn rõ nguồn gốc Tác giả luận án Vũ Hoài Sâm LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành luận án này, nhận quan tâm, giúp đỡ nhiệt tìnhcủa Thầy, Cơ giáo, tập thể, cá nhân bạn bè, đồng nghiệp gia đình Tơi xin bày tỏ lịng kính trọng biết ơn sâu sắc tới GS.TS Phạm Xuân Hội TS Nguyễn Duy Phương – người Thầy tận tình hướng dẫn khoa học giúp đỡ tơi suốt q trình thực đề tài nghiên cứu hồn thành luận ánnày Tơi xin trân trọng cảm ơn TS Cao Lệ Quyên (chủ nhiệm đề tài), cán Bộ môn Bệnh học phân tử ln nhiệt tình giúp đỡ, tạo điều kiện tốt đóng góp nhiều ý kiến quý báu cho tơi q trình nghiên cứu thực đề tài Tôi xin trân trọng cảm ơn Ban lãnh đạo Viện Di truyền nơng nghiệp phịng Khoa họcđãtạođiềukiệnvàgiúpđỡtơitrongthờigianhọctậpvàtriểnkhaithínghiệm Tơi xin trân trọng cảm ơn Ban lãnh đạo Viện Dược liệu, đồng nghiệp, em Nguyễn Thị Hương em phịng Cơng nghệ Sinh học nơi cơng tác tạo điều kiện cho học giúp đỡ tơi suốt q trình làm việc học tập Tôi xin trân trọng cảm ơn Thầy, Cô giáo, anh, chị, em Ban Thông tin Đào tạo, Viện Khoa học Nơng nghiệp Việt Nam tận tình giúp đỡ bảo tơi suốt q trình học tập hoàn thiện hồ sơ luận án Cuối cùng, vô biết ơn người thân gia đình ln bên cạnh, động viên khích lệ, tiếp thêm sức mạnh nghị lực để tơi hồn thành q trình học tập nghiên cứu Tơi xin trân trọng cảm ơn! HàNội,ngày tháng năm2022 Vũ Hoài Sâm MỤC LỤC LỜICAMĐOAN i LỜICẢMƠN ii MỤCLỤC iii DANH MỤC CHỮVIẾTTẮT v DANHMỤCBẢNG vii DANHMỤCHÌNH viii MỞĐẦU CHƯƠNG1 1.1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU VỀ NỘI DUNGN G H I Ê N CỨU Giới thiệu công nghệ chỉnh sửagenCRISPR/Cas9 1.1.1 Giới thiệu chung công nghệ chỉnhsửagen 1.1.2 Cấu trúc chế chỉnh sửa côngnghệCRISPR/Cas9 .7 1.1.3 Ứng dụng hệ thống CRISPR/Cas9 khoa họccây trồng 13 1.2 Giới thiệu bệnh bạc lúa vi khuẩng ây bệnh 17 1.2.1 Bệnh bạclálúa 17 1.2.2 Vi khuẩn gây bệnh bạclá lúa .20 1.2.3 GenOsSWEET14và mối liên hệ với vi khuẩnXoogây bệnh bạclálúa 26 1.3 Tình hình nghiên cứu tạo giống lúa kháng bệnhb c 30 1.3.1 Nghiên cứu chọn tạo giống lúa kháng bệnh bạc dựa trêng e n kháng 30 1.3.2 Nghiên cứu chọn tạo giống lúa kháng bạc dựa trêng e n “nhiễm” 32 1.4 Giống lúa BT7 nghiên cứu cải tiến giốngl ú a BT7 34 1.4.1 Giới thiệu chung giốnglúa BT7 34 1.4.2 Bệnh bạc giốnglúaBT7 35 1.4.3 Nghiên cứu cải tiến di truyền giốnglúaBT7 35 1.5 Chuyển gen vào lúa thơng qua vi khuẩnAgrobacteriumtumefaciens 36 1.5.1 Vai trị chuyển gen nhờA tumefaciensđốiv i CRISPR/Cas9 36 1.5.2 Hiệu chuyển gen lúa nhờA tumefaciens 38 1.5.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến q chuyển gen vàoIElúa 40 1.5.4 Nghiên cứu chuyển gen vào giống lúa BT7 nhờA tumefaciens .41 CHƯƠNG NGUYÊN LIỆU, NỘI DUNG VÀP H Ư Ơ N G PHÁP 43 2.1 Nguyênliệu 43 2.1.1 Đối tượngnghiêncứu 43 2.1.2 Vật liệunghiêncứu 43 2.1.3 Hoáchất 43 2.1.4 2.2 2.3 Thiếtbị 44 Nội dung nghiêncứu 44 Phương phápnghiên cứu 45 2.3.1 Các kĩ thuật chung nghiên cứu sinh họcphân tử 45 2.3.2 Tối ưu quy trình chuyển gen vào giống lúa BT7 sửd ụ n g IE 51 2.3.3 Đánh giá tương tác vi khuẩnXoovàOsSWEET14t r ê n BT7 55 2.3.4 Thiết kế cấu trúc T-DNA chỉnhsửaSW14-BT 58 2.3.5 Tạo dòng lúa BT7 chỉnhsửaSW14-BT .61 2.3.6 Đánh giá đặc điểm dòng lúa BT7 chỉnhs a SW14-BT .64 2.4 Phương pháp xử lýsốliệu 65 CHƯƠNG3 3.1 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀTHẢOLUẬN 66 Nghiên cứu xây dựng quy trình chuyển gen vào IE giốngl ú a BT7 .66 3.1.1 Tối ưu hệ thống tái sinh in vitro từ IE cho giốngl ú a B T 66 3.1.2 Tối ưu quy trình chuyển gen vào IE lúa BT7 quaA tumefaciens .73 3.1.3 Quy trình chuyển gen vào IE giống lúa BT7 thơng quaA.tumefaciens .80 3.2 Thiết kế cấu trúc T- DNA chỉnhsửa SW14-BT .82 3.2.1 Nghiên cứu tương tác VXO vàOsSWEET14ở giốngl ú a BT7 .82 3.2.2 Thiết kế cấu trúc T-DNA chỉnhsửaSW14-BT 94 3.3 Tạo dòng lúa BT7 chỉnhsửa SW14-BT 103 3.3.1 Tạo chủngA tumefaciensmang cấu trúc T-DNA chỉnhsửaSW14-BT .103 3.3.2 Chuyển cấu trúc T-DNA chỉnh sửaSW14-BTvàolúaBT7 .104 3.3.3 Sàng lọc kiểu gen kiểu hình dòng lúa BT7t i sinh 106 3.3.4 Sàng lọc kiểu gen kiểu hình dòng lúa BT7 chỉnh sửag e n T1 .113 3.4 Đánh giá đặc điểm lúa BT chỉnhsửa SW14-BT 117 3.4.1 Đánh giá đặc điểm nơng sinh học dịng lúa BT7 chỉnhsửaSW14-BT 117 3.4.2 Nghiên cứu biểu hiệnOsSWEET14trong dòng lúa chỉnhsửaSW14-BT 120 3.4.3 Đánh giá khả kháng bạc lúa BT7 chỉnhs a SW14-BT 123 KẾT LUẬN VÀĐỀNGHỊ 127 Kếtluận 127 Đềnghị 128 DANH MỤC CƠNG TRÌNH KHOA HỌC LIÊN QUAN ĐẾNL U Ậ N ÁN .129 TÀI LIỆUTHAMKHẢO 130 PHỤ LỤC 146 Chữ viết tắt DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT TiếngAnh Alt-NHJI : Alternative non-homologous end joining AS :Acetosyringone BAP : 6-benzyl aminopurine BLB : Bacterialleafblight BT7 :B a c t h o m cultivar thơm7Cas9 : CRISPR-associated9 cDNA : Complementary Deoxiribonuceicacid cNHEJ : Classical non-homologous endjoinng CRISPR : ClusteredRegularly Interspaced Short Palindromic Repeats crRNA : CRISPRRNA Cs : Et al.(andothers) CộngsựCTAB threemethylammonium bromide DAP : Daysafterpollination DNA :D e o x y r i b o n u c l e i c acid DSB : DNAdouble-strandbreak EBE : Effectorbindingelement gRNA :g u i d e RNA HDR : Homologydirectedrepair HPT : IE LB Hygromycinphosp hotransferase :I m m a t u r e embryos :L u r i a - B e r t a n i medium MMEJ NAA NHEJ : Microhomology-mediatedendjoining : α-naphthaleneaceticacid : Non-homologousendjoining Nu :Nucleotide TiếngViệt Ghép nối tận không tương đồng thay Bệnh bạc vikhuẩn Giống lúa Bắc Trình tự DNA bổ sung Ghép nối tận khơng tương đồng gốc Nhóm trình tự ngắn, đối xứng, lặp lại phổbiến : Cetyl Ngày sau thụ phấn Axit deoxyribonucleic Đứt gãy DNA sợi đôi Yếu tố liên kết thụ thể RNA dẫnđường Sửa chữa ADN theo cơchế tái tổ hợp tương đồng Phôinon Môi trường Luria-Bertani nuôi vi khuẩn Ghép nối tận cùngtươngđồngnhỏ Axit α-naphthalene acetic Ghép nối tận cùngk h ô n g tương đồng NST :C h r o m o s o m e Nhiễm sắcthể OD :O p t i c a l density PAM : Protospaceradjacentmotif PCR : Polymerasechainreaction chuỗip o l y m e r a s e RFLP : Restriction FragmentLength Polymorphisms PGRs : Plantgrowthregulators Rgene RNA RT-PCR SSA :R e s i s t a n c e gene :R i b o n u c l e i c acid : Reversetranscriptasepolymerase chain-reaction :S t a n d a r d Deviation : Synthesis-dependent strand annealing :S u s c e p t i b i l i t y gene : SingleguideRNA : Singlenucleotide polymorphism : Statistical Package forthe Social Sciences :S i n g l e - s t r a n d annealing SW14-BT : SD SDSA Sgene sgRNA SNP SPSS Mật độ quanghọc Trình tự gần protospacer Phản ứng Đa hình chiều dài đoạn giới hạn Chất điều hòa sinhtrưởng thực vật Genkháng Axitribonucleic Phản ứng chuỗi polymerase phiên mã ngược Độ lệchchuẩn Ghép sợi phụ thuộc vào tổng hợp Gen nhiễm RNA dẫn đường sợiđơn Đa hình nucleotide đơn Phân mềm thống kê khoa học xã hội Ghép sợiđơn PromoterOsSWEET14giốnglú a Bắc thơm7 SWEET T-DNA T3SS T7E1 TAL TALEN TE VXO Xoo ZFN : Sugar will eventuallybe exported transporters :T r a n s f e r DNA : Type IIIsecretionsystem : T7 EndonucleaseI :T r a n s c r i p t i o n activator-like : Transcriptionactivator-like effector nucleases :Tris-EDTA : VietnamXanthomonasoryzae pv.oryzae :Xanthomonas oryzaepv oryzae :Z i n c - f i n g e r nuclease Protein vận chuyển đường DNAnhảy Hệ thống chất tiết loại III Protein giống yếu tố hoạth ó a phiên mã Nuclease chứa thụ thể giống yếu tố hoạt hóa phiên mã Vi khuẩnXanthomonasoryzaepv oryzaethu thập Việt Nam Vi khuẩn Nuclease ngón taykẽm DANH MỤC BẢNG TT bảng Tên bảng 1.1 Đặc điểm cơng nghệ chỉnh sửa gen 1.2 Ứng dụng CRISPR/Cas9 cải tiến di truyền lúa 1.3 Hiệu chuyển gen thông quaA tumefaciens( 2017) 2.1 Thang điểm đánh giá tính kháng bệnh bạc 3.1 Hiệu khử trùng NaOCl 1,0% hạt non giống lúa BT7 3.2 Ảnh hưởng ánh sáng đến tỉ lệ tăng sinh mô sẹo phát sinh từ IE lúa BT7 3.3 Ảnh hưởng ánh sáng đến chất lượng mô sẹo phát sinh từ IE lúaBT7 3.4 Ảnh hưởng chất ĐHST nước dừa đến khả tái sinh chồi từ mô sẹo 3.5 3.6 3.7 3.8 3.9 3.10 3.11 3.12 3.13 3.14 3.15 3.16 3.17 3.18 3.19 Trang 15 39 65 67 69 70 72 Ảnh hưởng mật độ vi khuẩn thời gian đồng nuôi cấy đến hiệu chuyển gen vào IE giống lúaB T Ảnh hưởng tuổi IE đến hiệu chuyển gen vào lúa BT7 Ảnh hưởng nồng độ AS đến trình chuyển gen vào IE giống lúa BT7 74 Trình tự đặc điểm sgRNA ứng viên chỉnh sửaSW14-BT Phân tích hiệu hoạt động sgRNA mang crRNA ứng viên chỉnh sửaSW14-BT Trình tự DNA hệ gen lúa tương đồng với crRNA Kết biến nạp cấu trúc pCas9/gRNA-SW14 vào lúaB T Kết sàng lọc kiểu gen dòng lúa BT7 tái sinh Kiểu genSW14-BTcủa dòng lúa chuyển gen T0 Khả tạo hạt dòng lúa BT7 chỉnh sửa gen T0 Phân ly di truyền cấu trúc T-DNA dòng lúa BT7 T1 Phân ly di truyền đột biếnSW14-BTở dòng lúa chỉnh sửa genT1 Kiểu genSW14-BTcủa dòng lúa BT7 T1mang đột biếnđồng hợp không chứa T-DNA Kết đánh giá kiểu hình dịng lúa BT7 chỉnh sửa genT Một số đặc điểm nơng học dòng lúa BT7 chỉnh sửaSW14-BT 95 96 77 79 97 104 106 109 113 114 115 115 117 118