Đồ án công nghệ cố định enzym và ứng dụng

Đồ án mơn học MỤC LỤC TRANG BÌA i NHẬN XÉT CỦA GIÁO VIÊN HƢỚNG DẪN ii LỜI CẢM ƠN iii MỤC LỤC iv DANH MỤC HÌNH vi DANH MỤC BẢNG vi Chƣơng 1: TỔNG QUAN 1.1 Lịch sử phát triển enzym cố định 1.2 Sơ lƣợc enzym cố định 1.2.1 Định nghĩa 1.2.2 Đặc điểm enzym cố định 1.2.3 Ƣu nhƣợc điểm enzym cố định 1.2.4 Các phƣơng pháp cố định enzym 1.2.5 Vật liệu cố định 1.2.6 Một số yếu tố ảnh hƣởng đến cố định enzyme Chƣơng 2: ỨNG DỤNG CỦA ENZYM CỐ ĐỊNH 2.1 Ứng dụng công nghệ thực phẩm 2.1.1 Enzym β-galactosidase 2.1.1.1 Giới thiệu enzym β-galactosidase 2.1.1.2 Nguồn thu nhận enzym β-galactosidase 2.1.1.3 Các phƣơng pháp cố định enzym β-galactosidase 10 2.1.1.4 Ứng dụng enzym β-galactosidase cố định 13 2.1.1.4.1 Thủy phân lactose sữa lactoserum 13 2.1.1.4.2 Tổng hợp Galacto-Oligosaccharides (GOSs) 16 2.1.2 Enzym lipase 17 2.1.2.1 Giới thiệu enzym lipase 17 2.1.2.2 Nguồn thu nhận enzym lipase 17 2.1.2.3 Các phƣơng pháp cố định enzym lipase 18 2.1.2.4 Ứng dụng enzym lipase cố định công nghệ thực phẩm 20 2.1.2.4.1 Ứng dụng lipase cố định tổng hợp ester có hƣơng trái 20 2.1.2.4.2 Ứng dụng enzyme lipase cố định để sản xuất liên tục monoacylglycerol từ olein dầu cọ 21 2.1.3 Enzym α-galactosidase (raffinase) 23 ~ iv ~ Đồ án môn học 2.2 2.1.3.1 Giới thiệu enzym α-galactosidase 23 2.1.3.2 Nguồn thu nhận enzym α-galactosidase 23 2.1.3.3 Cách phƣơng pháp cố định enzym α-galactosidase 23 2.1.3.4 Ứng dụng enzym riffinase cố định 26 Ứng dụng phân tích 27 2.2.1 Tổng quan cảm biến sinh học (biosensor) 27 2.2.1.1 Giới thiệu cảm biến sinh học 27 2.2.1.2 Lịch sử phát triển cảm biến sinh học 27 2.2.1.3 Phân loại 28 2.2.1.4 Các yếu tố sinh học 29 2.2.1.4.1 Enzym 29 2.2.1.4.2 Kháng thể 29 2.2.1.4.3 Vi sinh vật 30 2.2.1.5 Bộ chuyển đổi (transducer) 30 2.2.1.5.1 Chuyển đổi điện hóa 30 2.2.1.5.2 Chuyển đổi quang 30 2.2.1.5.3 Chuyển đổi nhiệt 30 2.2.1.5.4 Chuyển đổi tinh thể áp điện (piezoelectric) 30 2.2.2 Cảm biến sinh học sử dụng L-glutamate oxidase L-glutamate dehydrogenase cố định dùng để phân tích monosodium glutamate thực phẩm 31 2.2.2.1 Giới thiệu 31 2.2.2.2 Phƣơng pháp thí nghiệm 31 2.2.2.2.1 Các hóa chất sử dụng 31 2.2.2.2.2 Sự cố định enzym 31 2.2.2.2.3 Điện cực 32 2.2.2.2.4 Thử nghiệm 32 2.2.2.2.5 Quá trình phản ứng 33 2.2.2.2.6 Cấu hình nhiệt độ pH 33 2.2.2.2.7 Xác định giá trị Km Vmax 34 2.2.2.2.8 Sự ổn định màng cố định 35 TÀI LIỆU THAM KHẢO 36 ~v~ Đồ án môn học DANH MỤC HÌNH Hình 2.1: Mơ hình biosensor 27 Hình 2.2: Mơ hình cảm biến sinh học phân tích MSG dùng L-GLOD–L-GLDH cố định 32 Hình 2.3: Đƣờng hiệu chỉnh vận tốc tiêu thụ Oxy theo nồng độ MSG cặp L-GLOD–LGLDH cố định cảm biến sinh học 33 Hình 2.4: pH nhiệt độ 25 ± ◦C có mặt 2mM NADPH 10mM ammonium với nồng độ MSG 1.2mg/L 34 Hình 2.5: Nhiệt độ pH 7.0 với nồng độ MSG 12mg/dL 34 Hình 2.6: Hoạt tính enzym cố định cảm biến sinh học thời gian 60 ngày: LGLOD 25U–L-GLDH 143.2U; L-GLOD 25U–L-GLDH 35U; L-GLOD 25U 35 DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1: Ƣu – Nhƣợc điểm phƣơng pháp cố định enzyme Bảng 2.1: Tóm tắt phƣơng pháp cố định enzym β-galactosidase 13 Bảng 2.2: Thủy phân lactose sử dụng kỹ thuật cố định khác 15 Bảng 2.3: Nguồn VSV thu nhận enzym lipase tính chất enzyme lipase 18 ~ vi ~ Chương 1: Tổng quan Đồ án môn học Chƣơng 1: TỔNG QUAN 1.1 Lịch sử phát triển enzym cố định [1] - Năm 1916, Nelson Griffin quan sát cho thấy enzym invertase nấm men (EC.3.2.1.2.6) hấp thụ vào than có khả thủy phân đƣờng saccharose Sau giới xuất nhiều báo cáo khả cố định enzym liên kết đồng hóa trị chất mang Trƣớc năm 1953 chƣa có nghiên cứu enzym khơng hịa tan đƣợc ứng dụng vào thực tế - Năm 1953, Grubhofer Schleith cố định đƣợc số enzym nhƣ carboxy peptidase, diastase, pepsin ribonuclease polyaminostyrene liên kết đồng hóa trị nghiên cứu bắt đầu thử nghiệm ứng dụng qui mô pilot - Năm 1954, Chang tạo đƣợc vi tiểu cầu bán thấm có gắn enzym để chống lại dị ứng đƣa enzym vào thể - Năm 1963, Bernfeld Wan thí nghiệm thành cơng việc nhốt enzym nhƣ amylase, trypsin, papain, ribonuclease vào gel polyacrylamide - Năm 1964, Quiociio Richards mô tả phƣơng pháp liên kết chéo cố định carboxy peptidase A với glutaraldehyde Cũng năm Chang triển khai phƣơng pháp tạo vi nang để nhốt enzym carbonic anhydrase - Năm 1969, Wilson xây dựng thành công xƣởng thực nghiệm để sản xuất glucose glucoamylase cố định - Năm 1969, Chibata ngƣời cộng tác công ty Tanabe Seiyaku – Nhật ngƣời thực thành công việc áp dụng enzym cố định vào sản xuất công nghiệp Theo phƣơng pháp cố định enzym tác giả ngƣời Nhật, enzym aminoacylase nấm sợi đƣợc gắn vào DEAE-sephadex thông qua liên kết ion sử dụng chúng cho trình thủy phân - Năm 1970, Mosbach tiến hành cố định ba loại enzym: -galactosidase, hexokinase, glucophosphatase liên kết cộng hóa trị với hạt sephadex - Năm 1971, Gregoriadis triển khai liposome có chứa amyloglucosidase - Năm 1973, Chibata cộng tác viên ngƣời thành công việc cố định tế bào vi sinh vật để sản xuất L-aspartate từ ammonium fumarate gel acrylamid Tế bào E.coli chứa gel có hoạt tính aspartate cao ~1~ Chương 1: Tổng quan - Đồ án môn học Đến năm 1987, công nghệ ứng dụng enzym glucoisomerase cố định, tiến hành sản xuất siro fructose từ glucose theo qui mô công nghiệp Cho đến có khoảng 4,5 triệu siro fructose đƣợc sản xuất theo phƣơng pháp enzym cố định - Ngồi sản phẩm trên, enzym cố định cịn đƣợc ứng dụng nhiều công nghệ lên men, chống ô nhiễm môi trƣờng y học 1.2 Sơ lƣợc enzym cố định 1.2.1 Định nghĩa [1] Enzym cố định hiểu theo nghĩa: - Nghĩa hẹp: enzym khơng hịa tan enzym đƣợc đƣa vào pha riêng rẽ, pha tách riêng với môi trƣờng dung dịch phản ứng Pha enzym không hòa tan nƣớc đƣợc gắn với polymer ƣa nƣớc có trọng lƣợng phân tử lớn - Nghĩa rộng: chất xúc tác cố định enzym, tế bào, thể sống trạng thái cho phép sử dụng lại Nhƣ vậy, theo nghĩa rộng, enzym không hòa tan bao gồm enzym đƣợc cố định vào chất mang, enzym có tế bào sống, chúng đƣợc cố định bình phản ứng sinh học có gắn kết vào chất mang cho phép ta sử dụng nhiều lần - Enzym khơng hịa tan hay enzym cố định thƣờng enzym hòa tan đƣợc gắn vào chất mang nhiều kỹ thuật khác Nhờ trình gắn mà enzym từ trạng thái hịa tan chuyển sang khơng hịa tan 1.2.2 Đặc điểm enzym cố định [1] Enzym cố định có đặc điểm nhƣ sau: - Hoạt tính enzym cố định thƣờng nhỏ hoạt tính enzym tự loại Sở dĩ có thay đổi hoạt tính riêng enzym cố định nguyên nhân sau:  Do ảnh hƣởng điện tích chất mang: điện tích chất mang có khác biệt với điện tích enzym gắn enzym vào chất mang, cấu trúc không gian enzym có thay đổi mức độ định Chính thay đổi cấu trúc mà kết hợp enzym chất đi, dẫn đến hoạt tính chúng giảm  Do enzym bị nhốt vào mạng lƣới bị liên kết chất mang khiến cho tiếp xúc enzym chất bị - Enzym cố định hoàn tồn tn theo định luật Michaelis – Menten nhƣng có số sai khác định:  Có thể xảy cạnh tranh chất với enzym chất mang ~2~ Chương 1: Tổng quan  Đồ án môn học Xảy tƣợng cản trở khuếch tán chất sản phẩm làm giảm tốc độ phản ứng - Enzym cố định thƣờng có tính bền nhiệt enzym tự nhờ có tác dụng che chở chất mang - Enzym cố định thƣờng có pH tối ƣu không trùng với enzym tự loại - Enzym cố định có chất mang che chắn nên đƣợc bảo vệ tốt enzym tự - Enzym cố định tái sử dụng nhiều lần dễ dàng tách khỏi chất cách dễ dàng sau phản ứng độ bền enzym cố định cao enzym tự 1.2.3 Ƣu nhƣợc điểm enzym cố định [1] Ưu điểm: - Enzym cố định tái sử dụng nhiều lần thời gian dài - Enzym cố định không lẫn vào sản phẩm cuối phản ứng enzym, khơng gây ảnh hƣởng xấu đến chất lƣợng sản phẩm, hay nói cách khác khơng tốn chi phí cho việc tách enzym khỏi sản phẩm - Có thể ngừng phản ứng cần thiết cách tách hệ chất mang – enzym khỏi dung dịch chất - Enzym cố định tƣơng đối bền với tác nhân vật lý hóa học enzym tự - Dễ dàng tiến hành trình sản xuất theo phƣơng pháp liên tục Nhược điểm: - Sự có mặt chất mang làm giảm hoạt tính enzym - Trong đa số trƣờng hợp, enzym bị giảm hoạt hoạt tính sau q trình cố định - Tuy nhiên, hạn chế khơng đáng kể so với lợi ích mà enzym cố định mang lại Do vậy, ngày có nhiều nghiên cứu cố định enzym nhƣ ứng dụng enzym cố định vào sản xuất công nghiệp 1.2.4 Các phƣơng pháp cố định enzym [1] Các phƣơng pháp cố định enzym đƣợc chia thành nhóm: hóa học vật lý ~3~ Chương 1: Tổng quan Đồ án môn học Bảng 1.1: Ưu – Nhược điểm phương pháp cố định enzyme [1] Phƣơng pháp hóa học Phƣơng pháp Ƣu điểm Nhƣợc điểm Phƣơng pháp gắn enzym Liên kết enzym chất Hoạt tính enzym bị lên chất mang liên mang liên kết bền, hạn giảm biến đổi kết cộng hóa trị chế tối đa mát enzym cấu trúc enzym trong trình phản ứng trình cố định Phƣơng pháp gắn Tạo đƣợc liên kết bền trƣớc Chi phí cao, thao tác thực phân tử enzym lại với tác nhân pH, nhiệt độ… hiên tƣơng đối phức tạp liên kết cộng Thƣờng đƣợc dùng phối hợp với Hoạt tính enzym bị hóa trị phƣơng pháp khác giảm biến đổi cấu trúc enzym trình cố định Phƣơng pháp vật lý Phƣơng pháp Ƣu điểm Phƣơng pháp gắn enzym Thao tác thực đơn giản Nhƣợc điểm Do lực tƣơng tác enzym lên chất mang tác Điều kiện tiến hành cố định chất mang yếu nên dễ xảy nhân vật lý enzym ơn hịa nên khơng làm tƣợng nhả hấp phụ hoạt tính enzym trong trình sử dụng trình cố định Có khả tái sử dụng chất enzym cố định khuấy trộn hay thay đổi nhiệt độ, pH môi trƣờng mang Phƣơng pháp nhốt enzym Thao tác đơn giản Chỉ thích hợp cho phản ứng Khơng địi hỏi phải có nhóm với chất có khối lƣợng tạo liên kết nên phù hợp với phân tử nhỏ nhiều loại enzym Hiệu cố định enzym cao Có thể cố định đồng thời nhiều enzym ~4~ Chương 1: Tổng quan Đồ án môn học Phương pháp hóa học: - Gắn enzym lên chất mang liên kết cộng hóa trị - Gắn phân tử enzym lại với liên kết cộng hóa trị Phương pháp vật lý: - Hấp phụ enzym lên chất mang liên kết vật lý nhƣ sau: lực mao quản, liên kết ion, lực Van der Walls… - Phƣơng pháp nhốt enzym khuôn gel màng bao vi thể 1.2.5 Vật liệu cố định [1] Vật liệu phƣơng pháp cố định hai yếu tố có tính chất định đến hiệu trình cố định enzym Trong đó, khơng có đặc điểm, tính chất vật liệu cố định thích hợp cho tất loại enzym khơng có enzym thích hợp với tất loại vật liệu cố định Vật liệu cố định enzym tế bào chia làm hai loại: vật liệu vô vật liệu hữu Vật liệu vô cơ: - Đặc điểm: chất mang vô bền với tác động bên ngồi, khơng bị vi sinh vật ăn mịn, phân hủy, nhƣng việc gắn với enzym thƣờng khó khăn - Một số chất mang vô thông dụng nhƣ: thủy tinh xốp, oxid kim loại nhƣ oxid nhôm, oxid mangan, oxid magie, silicagel… Vật liệu hữu cơ: - Đặc điểm: chất mang hữu thƣờng có nhóm hoạt động hóa học nhƣ: -NH2, COOH, -OH, -SH,… nên dễ kết gắn với enzym nhƣng độ bền với tác động môi trƣờng không cao, đặc biệt polymer sinh học dễ bị vi sinh vật xâm nhập công  Các polymer tự nhiên: - Tinh bột vật liệu phong phú rẻ tiền Tinh bột dùng để đóng mạch, diethanolamin tinh bột đƣợc dùng làm chất mang cố định enzym nhƣ lipase, glucoisomerase, trypsin, amylase Nhƣợc điểm tinh bột độ trƣơng kém, thiếu nhóm chức nên khả cố định hoạt tính enzym cịn thấp Tinh bột thƣờng đƣợc ghép copolymer với vinyl monomer ƣa nƣớc nhƣ acrylamide, acrylic acid để cải thiện tính chất lý, độ trƣơng nở tạo nhóm chức bề mặt ~5~ Chương 1: Tổng quan - Cellulose Đồ án môn học dẫn xuất cellulose CM-cellulose, DEAE-cellulose, nitrocellulose… vật liệu rẻ so với agarose nhƣng lại không đồng nhất, thƣờng sử dụng dạng sợi, dạng tinh thể (microcrystalline) Cellulose vật liệu đƣợc nghiên cứu cố định enzym đầu tiên, quy trình cố định vật liệu đƣợc nghiên cứu hoàn chỉnh Cellulose thƣờng đƣợc dùng để hấp thụ, liên kết ion, liên kết cộng hóa trị với enzym nhốt gel - Chitin hợp chất đƣợc Braconnot phân lập từ năm 1811 Odier đặt tên chitin từ năm 1823 Chitin polymer sinh học có nhiều triển vọng nghiên cứu ứng dụng làm vật liệu cố định enzym tế bào Chitin polymer sinh học phổ biến tự nhiên, đứng sau cellulose - Chitin có cấu trúc tƣơng tự cellulose, polymer gốc 2-acetoamide-2deoxy-β-D-glucoza, liên kết với liên kết β-1,4-glycoside Chitin có thành phần cấu trúc vỏ trùng, vỏ tơm cua, sị, vách tế bào sinh vật,…Chitin vật liệu có chứa nhóm chức –OH cho liên kết với enzym, có cấu trúc siêu lỗ, có khả hấp thụ tốt, dễ tạo màng Chitin có cấu trúc mạng tinh thể chặt chẽ, khơng có liên kết hydro hình thành chuỗi mà cịn có lớp với mạng tinh thể Chitin polymer kỵ nƣớc, độ trƣơng thấp, diện tích bề mặt tiếp xúc nhỏ bền mặt hóa học Gần có nhiều nghiên cứu cố định enzym chitin, chủ yếu phƣơng pháp hấp thụ liên kết cơng hóa trị qua cầu nối glutaraldehyde Chitin đƣợc tìm thấy thành tế bào nấm sợi Nó chất hữu chiếm lƣợng lớn để hình thành nên lớp vỏ ngồi động vật không xƣơng sống (côn trùng, giáp xác…) Về mặt cấu trúc, chitin có cấu trúc tƣơng tự nhƣ cellulose, điểm khác biệt hóa học nhóm acetamido vị trí số khung carbon chitin đƣợc thay cho nhóm hydroxyl (-OH) cellulose - Chitosan dẫn xuất chitin đƣợc deacetyl hóa kiềm mạnh Chitosan dễ tạo màng, tạo hạt, có cấu trúc siêu lỗ, có nhóm - NH2 Chitosan cố định enzym phƣơng pháp hấp phụ, phƣơng pháp cộng hóa trị, nhốt enzym gel chitosan Chitosan không tan nƣớc, tan dung môi hữu nhƣ acid formic, acid dipic, acid acetic Chitosan polymer sinh học có trọng lƣợng phân tử cao, có nhóm amin hoạt động, nhóm hydroxyl tham gia phản ứng hóa học - Anginate, carrageenan, hai vật liệu tạo gel dung dịch CaCl2 dùng để nhốt tế bào, enzym - Chất mang protein thƣờng gelatin, keratin, albumin,… thƣờng có khả dễ tạo màng, tạo hạt, nhốt enzym khuôn gel với tác nhân đóng mạch glutaraldehyde; nhƣợc điểm nhóm thƣờng bền, dễ bị nhiễm khuẩn ~6~ Chương 1: Tổng quan  - Đồ án môn học Các polymer tổng hợp: Các polymer tổng hợp đƣợc sử dụng làm chất mang cố định enzym nhƣ polyacrylamide, polyester, polyvinylalcohol, polyvinylacetate, polyacrylic, polyhydroxyethylacrylate, polystyrene,… - Ƣu điểm chung polymer tổng hợp bền, tính chất lý tốt, hồn tồn trơ với cơng vi khuẩn, độ trƣơng tốt, số polymer điều chỉnh kích thƣớc siêu lỗ - Nhƣợc điểm số polymer có giá thành cao, khả tƣơng hợp sinh học kém, phân hủy môi trƣờng tự nhiên nên gây ô nhiễm môi trƣờng 1.2.6 Một số yếu tố ảnh hƣởng đến cố định enzyme [1] Ảnh hưởng chất mang - Các tính chất lý học chất mang nhƣ tính hịa tan, tính bền hóa, diện tích, tính háo nƣớc kỵ nƣớc,…đều có ảnh hƣởng định đến lƣợng enzym đƣợc liên kết, đến tính bền hoạt tính sinh học chất dẫn xuất enzym không tan - Bản chất hóa học chất mang ảnh hƣởng đến khả tạo thành dẫn xuất enzym tới khả chất mang hấp phụ không đặc trƣng chất từ môi trƣờng phản ứng - Sự định vị enzym giúp cho dẫn xuất enzym khơng tan có tính bền nhiệt cao enzym tan - Chất mang có tác dụng hạn chế biến tính enzym dung môi, làm đứt nối liên kết hydro liên kết kỵ nƣớc Ảnh hưởng pH - Khi lực ion thấp nồng độ H+ gần chất mang tích điện âm cao hơn, cịn gần chất mang tích điện dƣơng cao dung dịch Kết pH tối ƣu enzym liên kết đồng hóa trị với chất mang tích điện âm chuyển dịch sang pH kiềm so với enzym hòa tan, trái lại enzym liên kết đồng hóa trị với chất mang tích điện dƣơng pH tối ƣu chuyển dịch sang phía pH acid - Khi lực ion lớn điện tích chất mang đƣợc trung hịa ion trái dấu pH tối ƣu enzym cố định gần giống enzym hòa tan Ảnh hưởng enzyme - Theo Poltorak, nguyên nhân làm giảm hoạt độ enzym cố định tƣơng tác protein-protein phân tử enzym đƣợc liên kết - Trong trƣờng hợp thấy hoạt độ riêng chế phẩm bị giảm với tăng lƣợng enzym đƣợc kết hợp đơn vị diện tích chất mang ~7~ Chương 2: Ứng dụng Đồ án môn học hiệu suất trung bình đạt đƣợc 14,01%, giảm nhẹ tăng thời gian phản ứng với Còn phản ứng thực thiết bị CSTR hiệu suất trung bình suất tƣơng ứng 14.34% 1.07 × 10−2 g MAG/U.ngày 2.1.3 Enzym α-galactosidase (raffinase) 2.1.3.1 Giới thiệu enzym α-galactosidase [15] α-D-Galactosidase (α-D-galactoside galactohydrolase EC 3.2.1.22) có mặt rộng rãi VSV, thực vật động vật Nhìn chung, α-galactosidase thủy phân giải phóng galactose tự từ galactosyl-sucrose oligosaccharide tự nhiên nhƣ raffinose stachyose nhƣ α-galactoside khác nhƣ galactolipid galactoprotein Tuy nhiên, loài động vật nhƣ ngƣời khơng có khả tổng hợp đầy đủ α-D-Galactosidase hệ thống đƣờng ruột để thủy phân α-galactoside, cụ thể oligosaccharide thuộc họ Raffinose đậu nành nhƣ lồi đậu khác Vì thế, vào đến ruột già galactose-oligosaccharide bị vi sinh vật lên men gây chứng đầy Do đó, việc loại bỏ oligosaccharide đậu nành loại đậu khác làm tăng giá trị dinh dƣỡng nhƣ khả tiêu thụ sản phẩm đậu 2.1.3.2 Nguồn thu nhận enzym α-galactosidase [15] Enzym α-galactosidase đƣợc thu nhận từ nhiều nguồn khác nhƣ động vật, thực vật vi sinh vật Trong enzym thƣơng mại thƣờng đƣợc sản xuất từ hai nguồn: hạt cà phê cịn xanh (green coffee bean) Aspergillus niger Ngồi ra, ngƣời ta nghiên cứu thu nhận α-galactosidase từ loài vi sinh vật nhƣ: Thermus sp T2, Gibberella fujikuroi, Bacillus stearothermophilus, Streptomyces griseoloalbus, Streptomyces griseoloalbus, Penicillium sp., Talaromyces flavus, Thermomyces lanuginosus,… 2.1.3.3 Cách phƣơng pháp cố định enzym α-galactosidase Cố định α-galactosidase phương pháp bao gói Enzym α-galactosidase từ Aspergillus oryzae đƣợc cố định theo phƣơng pháp Ates Mehmetoglu ml dung dịch sodium alginate (3.75%) đƣợc trộn với ml dung dịch enzym để tạo thành dung dịch đồng chứa 3% alginate Hỗn hợp sau đƣợc tạo giọt cách nhỏ giọt kiêm tiêm vô trùng vào dung dịch CaCl2 0,2M 4oC để tạo hạt Các hạt đƣợc làm cứng dung dịch CaCl2 2h Các hạt hình cầu tạo thành đƣợc rửa nƣớc cất đƣợc bảo quản dung dịch đệm acetate 0,2M (pH 4.8) 4oC Glutaraldehyde đƣợc sử dụng làm tác nhân liên kết chéo để cố định enzym α-galactosidase Hạt calcium alginate đƣợc xử lí phút 5ml với 1% glutaraldehyde Các hạt đƣợc ~ 23 ~ Chương 2: Ứng dụng Đồ án môn học lọc rửa nƣớc vơ trùng sau bảo quản 4oC đem sử dụng Enzym αgalactosidase đƣợc cố định gel alginate 3% bị 54,5% hoạt tính so với enzym tự Kmax Vmax enzym cố định với chất raffinose 5.5mM 0.15Uml−1 Nhiệt độ tối ƣu enzym cố định 57oC pH tối ƣu 4,5 Enzym hòa tan giữ đƣợc 92% 88% hoạt tính sau 8h 12h, enzym cố đinh giữ đƣợc 94% 92% [15] Enzym α-galactosidase từ G fujikuroi đƣợc cố định gel polyacrylamide theo phƣơng pháp Thanunkul et al 712,5 mg acrylamide 37,5 mg N,N‟-methylenebisacrylamide đƣợc thêm vào 10ml dung dịch enzym α-galactosidase thơ Sau đó, dung dịch đƣợc khí chân khơng thêm 20 mg ammonium persulphate 50 ml TEMED (NNN‟N‟-tetramethy-lethylene diamine) Sau polymer hóa hạt gel thu đƣợc có chứa enzym α-galactosidase đƣợc cho qua rây 1000 µm đƣợc rửa vài lần nƣớc pH tối ƣu enzym α-galactosidase hịa tan 5,8, pH tối ƣu enzym cố định nằm khoảng 5,2-5,6 Trong khoảng pH 4,0 6,3 enzym cố định enzym hòa tan có hoạt tính 90% Hoạt tính enzym tự giảm zero nhiệt độ 65oC, nhƣng nhiệt độ enzym cố định có hoạt tính 50% Nhiệt độ tối ƣu hầu hết enzym α-galactosidase khoảng 37oC 40oC Sau 24h, enzym tự enzym cố định giữ đƣợc 44% 36% hoạt tính, nhƣng sau ngày enzym tự giữ đƣợc 6% hoạt tính ban đầu enzym cố định giữ đƣợc 17% hoạt tính ban đầu [16] Cố định α-galactosidase phương pháp liên kết cộng hóa trị Enzym hexameric α-galactosidase từ Thermus sp chủng T2 (khối lƣợng phân tử 320 kDa) có hoạt tính cao dãy điều kiện hoạt động rộng nhƣ pH 5.0-10.0, nhiệt độ tối ƣu xung quanh giá trị 70oC pH 7.0, điểm đẳng điện 5.5 số lƣợng phân tử Lys tiểu đơn vị 10 [17] Liên kết cộng hóa trị đa điểm kỹ thuật cố định đồng thời vị trí tƣơng đối vài nhóm enzym sử dụng chất mang rắn có nhóm hoạt hóa sử dụng tác nhân liên kết chéo, điều tăng cƣờng đáng kể tính ổn định enzym Các cách thức cố định đáp ứng cho yêu cầu tạo thành liên kết cộng hóa trị đa điểm: Glyoxyl agarose: đƣợc cho phƣơng pháp hữu ích việc tạo liên kết cộng hóa trị đa điểm Chất mang cố định protein trực tiếp điểm ổn định thấp dạng liên kết imine aldehyde amine Theo phƣơng pháp này, tốc độ cố định phụ thuộc vào mật độ aldehyde bề mặt chất mang mật độ Lys bề mặt enzym Vì phân tử enzym đƣợc cố định liên kết cộng hóa trị đa điểm trƣớc hết khu vực có mật độ Lys cao [17] ~ 24 ~ Chương 2: Ứng dụng Đồ án môn học Glutaraldehyde: hoạt chất mà sử dụng nhiều phƣơng pháp khác nhau: sử dụng tiền hoạt hóa chất mang diễn trình trao đổi ion enzym, hấp phụ enzym chất mang đƣợc amin hóa xử lí thêm enzym đƣợc hấp phụ với glutaraldehyde để tạo liên kết chéo enzym chất mang Trong hai trƣờng hợp, cuối enzym đƣợc gắn chất mang nhóm Lys hầu hết bề mặt đƣợc tích điện âm bƣớc có trao đổi ion [17] Chất mang có chứa nhóm epoxy: chất mang phản ứng với nhiều nhóm khác chất mang nhƣ amino, thiol, hydroxyl, imidazole, carboxylic Tuy nhiên khả phản ứng enzym chất mang thấp nên chế q trình cố định thơng qua bƣớc: trƣớc tiên hấp phụ enzym chất mang, sau phản ứng cộng hóa trị nhóm chất mang nhóm epoxy chất mang đƣợc hấp phụ enzym [17] Một lƣợng khoảng 10g chất mang khác (Sepabeads®-EC-EP, Sepabeads®aminoepoxy-ECHFA, glyoxyl-agarose, MANAE-agarose or MANAE-agarose preactivated with glutaraldehyde) dạng huyền phù 20ml dung dịch đệm potassium phosphate 25mM có pH 7.0 chứa IU/ml enzym α-galactosidase Trong trƣờng hợp Sepabeads®-ECEP, enzym đƣợc ủ dung dịch đệm sodium phosphate 1M có pH 7.0 sử dụng chất mang glyoxyl trình đƣợc thực dung dịch đệm sodium carbonate 100mM có pH 10.05 Trong trƣờng hợp, hệ huyền phù đƣợc khuấy nhẹ 25oC Các dẫn xuất ổn định hầu hết thu đƣợc cách cố định enzyme glutaraldehyde- agarose, chế phẩm enzym có hoạt tính cao (95%) Trong đó, dẫn xuất thu đƣợc cách sử dụng amino-epoxide-Sepabead có hoạt tính thấp 10% [17] Việc cố định α-galactosidase sử dụng glutaraldehyde chất mang đƣợc amin hóa xảy theo hai cách Cách thứ sử dụng chất mang đƣợc amin hóa đƣợc tiền hoạt hóa với glutaraldehyde Cách thứ hai, trƣớc hết hấp phụ enzym lên chất mang đƣợc amin hóa sau xử lí với glutaraldehyde Với cách thứ nhất, enzym trao đổi ion với chất mang, cuối đƣợc xử lí với glutaraldehyde 0.5% (v/v) độ ổn định thu đƣợc cao phƣơng pháp thứ hai Trong đó, phƣơng pháp thứ hai, trình hấp phụ diễn nhanh giữ đƣợc 90% hoạt tính, nhƣng việc xử lí với glutaraldehyde 0.5% khơng ảnh hƣởng đến hoạt tính enzyme [17] Nhiệt độ tối ƣu enzym tự 65oC pH 7.0, nhiệt độ tối ƣu enzym cố định 70oC Ở 80oC, chế phẩm tối ƣu có hoạt tính cịn lại gấp lần hoạt tính cịn lại enzym hịa tan (72% so với 40%) Điều cho thấy độ ổn định nhiệt enzym cố ~ 25 ~ Chương 2: Ứng dụng Đồ án môn học định cao enzym hòa tan Mặt khác, pH tối ƣu enzym hầu nhƣ không thay đổi sau cố định, pH tối ƣu 25oC 4-5 [17] 2.1.3.4 Ứng dụng enzym riffinase cố định Các loại đậu đóng vai trị quan trọng chế độ ăn truyền thống nhiều vùng giới thực tế chúng có chất béo nguồn protein, xơ vi chất dinh dƣỡng tuyệt vời Nguồn isoflavone đậu nành nhận đƣợc ý với vai trò tiềm việc điều trị ung thƣ loãng xƣơng Hơn nữa, sữa đậu nành đƣợc xem nguồn thay chi phí thấp cho sữa bị nƣớc phát triển nhƣ bổ sung chất dinh dƣỡng không dung nạp lactose cho trẻ sơ sinh trẻ nhỏ Tuy nhiên, sản phẩm thực phẩm làm từ đậu có chứa nhiều yếu tố kháng dinh dƣỡng, số họ đƣờng Raffinose oligosaccharide Niêm mạc ruột ngƣời dày loài động vật thiếu enzym αgalactosidase cần thiết cho thủy phân oligo-saccharide Vì thế, vào đến ruột già oligo-saccharide bị vi sinh vật lên men gây chứng đầy Do đó, việc loại bỏ oligo-saccharide từ thực phẩm làm từ đậu nành yếu tố quan trọng việc cải thiện giá trị dinh dƣỡng chúng Việc thủy phân họ đƣờng raffinose đƣợc tiến hành thiết bị phản ứng gián đoạn hay liên tục [15] Trong thiết bị phản ứng gián đoạn, ngƣời ta tiến hành ủ enzym α-galactosidase cố định từ Aspergillus oryzae chất mang calcium alginate sữa đậu nành thời gian khác 2, 4, 12h, cho kết thủy phân oligo-saccharide tƣơng ứng 74%, 78%, 79% 81% Với kết ta thấy hiệu suất thủy phân 2h 74% việc kéo dài thời gian khơng làm tăng đáng kể hiệu suất [15] Quá trình loại bỏ oligo-saccharide liên tục đƣợc tiến hành thiết bị “fluidized bed reactor” Ở 50oC, hiệu suất thủy phân oligo-saccharide 90%, 78%, 74%, 52% 35% tƣơng ứng với tốc độ dòng chảy 40, 80, 120, 160 200ml.h-1 Những kết cho thấy với tốc độ dịng 40ml.h-1 hiệu suất thủy phân đạt cao 90% Qua cho thấy tốc độ dịng chảy tối ƣu thơng số quan trọng ảnh hƣởng đến hiệu hoạt động thiết bị “fluidized bed reactor” [15] Ngoài ra, enzym α-galactosidase đƣợc thu nhận từ G fujikuroi M vinacea đƣợc cố định gel polyacrylamide cho việc loại bỏ oligo-saccharide từ đậu nành pH sửa đậu nành 6.2-6.4 pH tối ƣu α-galactosidase cố định từ G fujikuroi 5.2-5.6 giữ đƣợc 90% hoạt tính pH 6.4 Trong pH tối ƣu α-galactosidase cố định từ M vinacea 4.0-4.5, phải hạ thấp pH tiến hành phản ứng, nhƣng pH thấp ~ 26 ~ Chương 2: Ứng dụng Đồ án môn học làm cho protein sữa đậu nành bị kết tủa làm cho sữa có vị chua Do đó, αgalactosidase cố định từ G fujikuroi lựa chọn tốt việc xử lí sữa đậu nành [16] 2.2 Ứng dụng phân tích 2.2.1 Tổng quan cảm biến sinh học (biosensor) 2.2.1.1 Giới thiệu cảm biến sinh học [18] Cảm biến sinh học (biosensor) thiết bị tích hợp có khả cung cấp thơng tin phân tích định lƣợng bán định lƣợng đặc trƣng, bao gồm phần tử nhận biết sinh học (bioreceptor) kết hợp trực tiếp với phần tử chuyển đổi (International Union of Pure and Applied Chemistry) Cảm biến sinh học thiết bị sử dụng tác nhân sinh học nhƣ enzym, kháng thể, để phát hiện, đo đạc phân tích hố chất Do cấu tạo cảm biến sinh học bao gồm thành phần bản: thành phần hoá học, thành phần sinh học thành phần vật lý Hình 2.1: Mơ hình biosensor 2.2.1.2 Lịch sử phát triển cảm biến sinh học [18] Giáo sƣ Leyland D.Clark đƣợc biết nhƣ ngƣời tiên phong lĩnh vực cảm biến sinh học Năm 1956, ông công bố báo điện cực oxy hố Những năm ơng tiếp tục thực nhiều thí nghiệm nhằm cố gắng mở rộng khả hoạt động cảm biến nhƣ phát đƣợc thêm nhiều tác nhân, nâng cao độ xác cảm biến Vào năm 1962, hội nghị New York Academy of Science, ơng thuyết trình cảm biến sinh học: “To make electrochemical sensors (pH, polarographic, potentiometric or conductometric) more intelligent by adding enzyme transducers as membrane enclosed sandwiches” Cảm biến sinh học theo mơ hình D.Clark bao gồm điện cực oxy hóa, có màng giữ enzyme glucose oxidase cố định Khi mật độ glucose môi trƣờng phản ứng ~ 27 ~ Chương 2: Ứng dụng Đồ án mơn học giảm mật độ chất oxi hóa bề mặt điện cực giảm cách tƣơng ứng Dựa thay đổi đó, Clark phát thay đổi nồng độ glucose môi trƣờng cần kiểm tra Những năm tiếp theo, nhóm Guilbault Montalvo lần công bố chi tiết chế tạo thành công cảm biến sinh học dựa điện cực chứa enzyme đo điện thế, cảm biến đo nồng độ urê điện cực chọn lọc ion NH4+, có gắn màng cố định urease Urease Urea HCO-3 + NH+4 Năm 1975, Lubber Opitz mô tả cảm biến sợi quang (fiber-optic sensor) gắn chất thị dùng để đo nồng độ CO2 O2 Cũng vào năm 1975, số vi khuẩn đƣợc sử dụng nhƣ thành phần sinh học điện cực vi sinh để đo nồng độ cồn Năm 1975, công ty Yellow Springs Instrument (Ohio) lần biến ý tƣởng Clark thành thực thông qua việc thƣơng mại hóa cảm biến sinh học Sản phẩm thiết bị phân tích glucose dựa hydrogen peroxide cột mốc đánh dấu xuất cảm biến sinh học đời sống β- D- Glucose + O2 Glucose oxidase D – Gluconic acid + H2O2 Vào năm 1982, Shichiri đồng nghiệp báo cáo mô tả cảm biến “glucose in vivo”, loại cảm biến dạng kim cho xét nghiệm dƣới da Cùng với phát triển nhanh chóng khoa học công nghệ, đặc biệt ngành công nghệ vật liệu nano công nghệ thông tin, cảm biến sinh học đạt đƣợc tiến vƣợt bậc, hứa hẹn đƣa vi thiết bị nhằm xác định nhanh, xác loại vi khuẩn, virus gây bệnh Các thiết bị dị tìm hay phân tích lƣợng mẫu nhỏ (cỡ vài nM) với độ tin cậy cao 2.2.1.3 Phân loại [19] Cảm biến sinh học đƣợc phân loại dựa vào thành phần sinh học thành phần chuyển đổi chúng Thành phần sinh học chúng bao gồm enzym, kháng thể, vi sinh vật, mô sinh học bào quan - Khi liên kết yếu tố cảm biến chất cần phân tích biến cố đƣợc phát (detected event) đƣợc gọi cảm biến lực (affinity sensor) - Khi có tƣơng tác yếu tố sinh học chất cần phân tích kèm theo sau thay đổi nồng độ chất sản phẩm đƣợc gọi cảm biến trao đổi chất (metabolism sensor) ~ 28 ~ Chương 2: Ứng dụng Đồ án môn học - Khi tính hiệu đƣợc tạo sau liên kết chất cần phân tích yếu tố sinh học nhƣng khơng có thay đổi hóa học yếu tố sinh học cảm biến đƣợc gọi cảm biến xúc tác (catalytic sensor) 2.2.1.4 Các yếu tố sinh học 2.2.1.4.1 Enzym [19] Nhƣ biết enzym protein có hoạt tính xúc tác cao đặc hiệu cao chất Chúng đƣợc sử dụng để kiểm sốt phân tích nồng độ nhiều chất cần phân tích khác Các chế phẩm enzym có sẵn thị trƣờng với độ tinh khiết cao điều kiện thuận lợi cho việc sản xuất cảm biến sinh học dùng enzym cố định Bên cạnh đó, hạn chế enzyme pH, lực ion, chất kìm hãm, nhiệt độ ảnh hƣởng đến hoạt tính enzym Hầu hết enzym hoạt tính nhiệt độ 60oC Các enzym sử dụng để chế tạo biosensor enzym oxy hóa, sử dụng oxy hịa tan sản xuất hydrogen peroxide Enzym đƣợc cố định chuyển đổi (transducer) phƣơng pháp hấp phụ, liên kết cộng hóa trị, phƣơng pháp bao gói khn gel, polymer phát sinh điện hóa (electrochemically generated polymer), màng lipid kép (bilipid membrane) dung dịch bên màng chọn lọc Enzym thƣờng đƣợc ghép thành đôi với chuyển đổi điện hóa chuyển đổi sợi quang học 2.2.1.4.2 Kháng thể [19] Kháng thể có chất glycoprotein, tế bào lympho B nhƣ tƣơng bào (biệt hóa từ lympho B) tiết để hệ miễn dịch nhận biết vơ hiệu hóa tác nhân lạ, chẳng hạn vi khuẩn virus Mỗi kháng thể nhận diện epitope kháng nguyên Nhiều kháng thể đƣợc thƣơng mại hóa đƣợc sử dụng rộng rãi xét nghiệm miễn dịch Các kháng thể đƣợc cố định bề mặt chuyển đổi theo phƣơng pháp liên kết cộng hóa trị sử dụng nhóm chức nhƣ amino, carboxyl, aldehyde sulfhydryl Các mặt hạn chế sử dụng kháng thể giống nhƣ sử dụng enzym Hơn muốn tái tạo phục hồi bề mặt chuyển đổi cần phải có điều kiện nhƣ pH thấp, lực ion lớn, chất làm sạch,… Ƣu điểm cảm biến kháng thể khả phân tích nhanh xét nghiệm miễn dịch truyền thống Cảm biến miễn dịch thƣờng sử dụng chuyển đổi quang học hay âm học ~ 29 ~ Chương 2: Ứng dụng Đồ án môn học 2.2.1.4.3 Vi sinh vật [19] Việc sử dụng vi sinh vật nhƣ yếu tố sinh học thiết bị cảm biến sinh học dựa trình trao đổi chất chúng Trong hầu hết trƣờng hợp, ngƣời ta đo thay đổi điện hóa học tế bào sử dụng oxy CO2 Tế bào vi sinh vật có lợi rẻ so với enzym kháng thể, ổn định đƣợc sử dụng phản ứng phức hợp có tham gia enzym cofactor Tuy nhiên, phƣơng pháp có tính chọn lọc so với phƣơng pháp sử dung enzym, có thời gian đáp ứng, thời gian phục hồi dài đòi hỏi phải thƣờng xuyên tiến hành hiệu chỉnh Chất mang thƣờng dùng để cố định nylon, màng cellulose nitrate, acetyl cellulose 2.2.1.5 Bộ chuyển đổi (transducer) 2.2.1.5.1 Chuyển đổi điện hóa [19] Bộ chuyển đổi dịng điện chuyển đổi điện áp đƣợc dùng phổ biến thiết bị cảm biển sinh học kiểu điện hóa Hầu hết, điện cực đƣợc làm kim loại nhƣ bạch kim, vàng, bạc, thép không gỉ vật liệu carbon Những vật liệu phải trơ điện mà phản ứng điện hóa xảy 2.2.1.5.2 Chuyển đổi quang [19] Chuyển đổi quang chuyển đổi hoạt động dựa hiệu ứng nhƣ: hấp thụ ánh sáng nhìn thấy tia UV; phát xạ huỳnh quang lân quang; bio–luminiscence; chemi– luminiscence… Bộ chuyển đổi quang học loại đầu dò mà đỉnh đƣợc cố định enzym chất màu (thƣờng huỳnh quang) Những loại đầu dị chứa hai sợi quang Một sợi đƣợc nối với nguồn sáng phát dãy bƣớc sóng khác nhau, sợi đƣợc nối với diot quang để phát thay đổi mật độ quang bƣớc sóng thích hợp 2.2.1.5.3 Chuyển đổi nhiệt [19] Hoạt động dựa tƣợng thay đổi entanpi hình thành phá vỡ liên kết hóa học phản ứng enzyme Bộ chuyển đổi có ƣu điểm hoạt động tốt với tất phản ứng Tuy nhiên, dạng chuyển đổi có tính chọn lọc thấp 2.2.1.5.4 Chuyển đổi tinh thể áp điện (piezoelectric) [19] Chuyển đổi hoạt động dựa nguyên lý: tinh thể thay đổi tần số dao động lực tác dụng lên thay đổi Chuyển đổi dạng có ƣu điểm độ nhạy cao (cỡ picogam), thời gian phản ứng nhanh, khả động cao, sử dụng đo đạc môi trƣờng lỏng khí ~ 30 ~ Chương 2: Ứng dụng Đồ án môn học 2.2.2 Cảm biến sinh học sử dụng L-glutamate oxidase L-glutamate dehydrogenase cố định dùng để phân tích monosodium glutamate thực phẩm 2.2.2.1 Giới thiệu [20] Glutamate amino acid đƣợc xác định nguồn lƣợng nguồn Nitơ quan trọng cho tế bào nhân thật tế bào loài động vật có vú Nó hoạt động nhƣ chất dẫn truyền kích thích thần kinh hệ thống thần kinh trung ƣơng đƣợc cho chịu trách nhiệm cho số q trình nhƣ học tập, trí nhớ, phát triển hệ thần kinh Việc tăng mức độ glutamate dịch não tủy đƣợc cho nguyên nhân chứng rối loạn thần kinh nhƣ bệnh đột quỵ, bệnh Alzheimer‟s bệnh Parkinson‟s Ngoài ra, monosodium glutamate đƣợc sử dụng phổ biến làm chất tăng cƣờng hƣơng vi thực phẩm Do đó, việc phát triển thiết bị đo lƣờng hàm lƣợng glutamate cách nhanh chóng đáng tin cậy vấn đề quan trọng cần xem xét nghiên cứu Một vài kỹ thuật nhƣ khối phổ, điện mao dẫn, microdialysis cảm biến sinh học đƣợc phát triển để phân tích glutamate Trong số phƣơng pháp đó, cảm biến sinh học phƣơng pháp đƣợc quan tâm phát triển nhanh Một vài loại cảm biến sinh học sử dụng chuyển đổi dòng điện đƣợc chế tạo để phát glutamate ứng dụng khác nhƣ chế biến thực phẩm, tế bào đƣợc nuôi cấy, dịch não ngoại bào (extracellular brain fluid) Các cảm biến sinh học có độ nhạy khả chọn lọc cao, nhƣng cần có bƣớc xây dựng phức hợp để chuẩn bị điện cực enzym Không giống với cảm biến sinh học dạng chuyển đổi dòng điện, cảm biến sinh học loại chuyển đổi quang học đƣợc chế tạo đơn giản hơn, dễ sử dụng phát chỗ 2.2.2.2 Phƣơng pháp thí nghiệm 2.2.2.2.1 Các hóa chất sử dụng [20] Enzym L-glutamate oxidase (L-GLOD) (EC 1.4.3.11, 63U/mg protein từ Streptomuces sp.), enzym L-glutamate dehydrogenase (L-GLDH) ((EC 1.4.1.3, 452U/mg protein từ Proteus sp.), NADPH, màng polycarbonate (kích thƣớc lỗ 0.4 µm), dung dịch đệm loại dung dịch khác… 2.2.2.2.2 Sự cố định enzym [20] Ngƣời ta sử dụng dung dịch đệm phosphate saline (PBS, pH 7.0) có chứa đồng thời hai enzym Enzym L-GLOD L-GLDH đƣợc trộn sau đƣợc tạo liên kết chéo với màng polycarbonate 20µl dung dịch glutaraldehyde 25µl bovine serum albumin (BSA) đƣợc sử dụng để nâng cao hiệu suất ổn định cho cảm biến Hỗn hợp enzym đƣợc chuẩn bị với hàm lƣợng khác với L-GLDH (35–143.2U) L-GLOD đƣợc giữ cố định ~ 31 ~ Chương 2: Ứng dụng Đồ án môn học giá trị 25U Sau đó, 10 µl đƣợc sử dụng để cố định Màng polycarbonate sau cố định đƣợc rửa vài lần dung dịch PBS để loại glutaraldehyde dƣ thừa enzym không tạo liên kết với màng Màng chứa enzym đƣợc bảo quản 4oC dung dịch PBS chứa túi polypropylene kín khí 2.2.2.2.3 Điện cực [20] Điện cực với đƣờng kính 1cm sử dụng dung dịch KCl chất điện phân, điện cực dƣơng làm bạc, điện cực âm làm vàng Điện cực oxy đƣợc phủ lớp polypropylene kị nƣớc (để bảo vệ điện cực nƣớc) cho khí thấm qua lớp enzym màng polycarbonate (kích thƣớc lỗ 0.4µm) đƣợc gắn điện cực hệ thống “push cap” Để phân tích, ngƣời ta sử dụng dung dịch đệm bảo hịa khơng khí với nồng độ oxy 7–8 ppm 25oC Dung dịch đệm đƣợc loại oxy dung dịch sodium sulfite Hình 2.2: Mơ hình cảm biến sinh học phân tích MSG dùng L-GLOD–L-GLDH cố định 2.2.2.2.4 Thử nghiệm [20] Đầu dò đƣợc phân cực khoảng 30-40 phút lần trƣớc sử dụng Việc thử nghiệm bắt đầu cách thêm MSG nồng độ khác Lƣợng oxy tiêu thụ đƣợc đo sau phút Để khôi phục lại độ bảo hòa oxy 100%, màng cố định enzym đƣợc rửa vài lần với PBS trƣớc tiến hành lần thử nghiệm Sự khuếch tán oxy từ khơng khí làm giảm hiệu q trình thử nghiệm thực với enzym dung dịch, để khắc phục vấn đề ngƣời ta tiến hành thử nghiệm thiết bị phản ứng kín khí thủy tinh (12mL) Ngƣời ta tiến hành thí nghiệm ba trƣờng hợp với nồng độ MSG khác nhau: - : Không tái sinh chất vắng mặt 2mM NADPH 10mM ammonium - :Có tái sinh chất có mặt 2mM NADPH - :Có tái sinh chất có mặt 2mM NADPH 10mM ammonium ~ 32 ~ Chương 2: Ứng dụng Đồ án môn học Ngƣời ta tiến hành tối ƣu nồng độ NADPH ammonium nhận thấy giá trị đáp ứng cho ổn định cao 2mM NADPH 10mM ammonium Hình 2.3: Đường hiệu chỉnh vận tốc tiêu thụ Oxy theo nồng độ MSG cặp L-GLOD–LGLDH cố định cảm biến sinh học 2.2.2.2.5 Quá trình phản ứng [20] L-glutamate + H2O L-GLOD α-Ketoglutarate + NH3 (1) Phản ứng (1) xảy có mặt MSG, q trình tái sinh chất khơng xảy khơng có mặt NADPH, NADPH hoạt động nhƣ cofactor L-GLDH 0.1mg/L nồng độ giới hạn phát phƣơng trình (1) (2) Với có mặt 2mM NADPH MSG hai enzym hoạt động MSG đƣợc tái sinh nhƣ phản ứng (2) MSG đƣợc chuyển đổi thành α-ketoglutarate phản ứng thứ chất phản ứng thứ (2) Việc bổ sung NADPH vào môi trƣờng phản ứng tạo điều kiện cho LGLDH thực phản ứng nghịch Việc nhận biết L- glutamate cung cấp khuếch đại giới hạn phát đƣợc xác định 0.04mg/L Sự khuếch đại tín hiệu cao đƣợc nhận thấy có mặt ammonium-một sản phẩm phụ phản ứng (1) giới hạn nồng độ phát 0.02mg/L 2.2.2.2.6 Cấu hình nhiệt độ pH [20] Cảm biến hoạt động tốt khoảng pH 4-10 (pH dung dịch đệm citratephosphate: 4, 5, 6; sodium phosphate: 7,8; glycine–NaOH: 9, 10) đƣợc đo nồng ~ 33 ~ Chương 2: Ứng dụng Đồ án môn học độ dung dịch MSG 1.2mg/L với có mặt 2mM NADPH 10mM ammonium pH tối ƣu cảm biến 7.0 nhiệt độ 25±2 oC, pH tối ƣu GLDH khoảng 8.25 pH tối ƣu GLOD khoảng 8.0 Cảm biến hoạt động tốt khoảng nhiệt độ (13±2 đến 55±2 oC) đƣợc đo nồng độ MSG 1.2mg/L Cảm biến hoạt động tốt nhiệt độ 25±2 oC, sau giá trị cảm biến bị hoạt tính bị vơ hoạt nhiệt độ Hình 2.4: pH nhiệt độ 25 ± ◦C có mặt 2mM NADPH 10mM ammonium với nồng độ MSG 1.2mg/L Hình 2.5: Nhiệt độ pH 7.0 với nồng độ MSG 12mg/dL 2.2.2.2.7 Xác định giá trị Km Vmax [20] Giá trị Km xác định cho cặp L-GLOD-LGLDH giống nhƣ cho LGLOD Vận tốc ban đầu phản ứng hàm số nồng độ chất theo động học „Michaelis-Menten‟ Km Vmax đƣợc xác định theo phƣơng pháp Lineweaver-Burk Giá trị Km biểu kiến đƣợc xác định 0.4451mM với có mặt 2mM NADPH 10mM ammonium Vmax xác định đƣợc điều kiện 3.07mg/(L.min) Giá trị Km Vmax biểu kiến điều kiện khơng tái sinh chất (chỉ có L-GLOD hoạt động) tƣơng ứng 1.9222mM 13.245mg/(Lmin) so với Km L-GLOD dạng tự 0.21mM Vì thế, cặp L-GLOD-LGLDH đƣợc sử dụng giá trị Km tăng xấp xỉ ~ 34 ~ Chương 2: Ứng dụng Đồ án môn học lần, sử dụng L-GLOD giá trị Km tăng lần Giá trị Km cao thu đƣợc cố định enzym lực enzym với chất giảm, cản trở trung tâm hoạt động enzym trình cố định 2.2.2.2.8 Sự ổn định màng cố định [20] Sự ổn định màng đƣợc phân tích chu kì 60 ngày Màng chứa enzym đƣợc bảo quản dung dịch đệm phosphate 0.2M, pH 7.0, nhiệt độ 4oC túi polypropylene kín khí Q trình phân tích đƣợc thực ngày lần với 0.8mg/L MSG Màng chứa cặp enzym L-GLOD–L-GLDH giữ đƣợc 80% hoạt tính ban đầu sau 30 ngày ứng với GLOD= 25U; GLDH= 35U 39 ngày ứng với GLOD= 25U; GLDH= 143.2U với diện 2mM NADPH 10mM ammonium Trong đó, màng cố định enzym LGLOD (25U) giữ đƣợc 80% hoạt tính ban đầu chí sau 48 ngày Hình 2.6: Hoạt tính enzym cố định cảm biến sinh học thời gian 60 ngày: LGLOD 25U–L-GLDH 143.2U; L-GLOD 25U–L-GLDH 35U; L-GLOD 25U Trong nghiên cứu gần đây, ngƣời ta nhận thấy lƣợng nhỏ GLDH khơng trì đƣợc hoạt tính enzym, điều vơ hoạt rò rỉ enzym Sự ổn định biosensor trình bảo quản cao hoạt độ GLDH 143.2U GLOD 25U ~ 35 ~ Đồ án môn học Tài liệu tham khảo TÀI LIỆU THAM KHẢO Wolfgang Aehale, Enzymes in Industry, Copyright © 2004 WILEY-VCH Verlag GmbH & Co.KGa, Weinheim Parmjit S Panesar, Shweta Kumari, and Reeba Panesar, Potential Applications of Immobilized β-Galactosidase in Food Processing Industries, SAGE-Hindawi Access to Research, Enzyme Research, Volume 2010, Article ID 473137, 16 pages M.L Foresti, M.L Ferreira, Chitosan-immobilized lipases for the catalysis of fatty acid esterifications, Enzyme and Microbial Technology 40 (2007) 769–777 Yin Hoon Chew, Lee Suan Chua, Kian Kai Cheng, Mohamad Roji Sarmidi, Ramlan Abdul Aziz, Chew Tin Lee, Kinetic study on the hydrolysis of palm olein using immobilized lipase, Biochemical Engineering Journal 39 (2008) 516–520 K.N Kilcawley, M.G Wilkinson,P.F.Fox, Determination of key enzyme activities in commercial peptidase and lipase preparations from microbial or animal sources, Enzyme and Microbial Technology 31 (2002) 310–320 G.D Haki, S.K Rakshit, Developments in industrially important thermostable enzymes: a review, Bioresource Technology 89 (2003) 17–34 V Ramachandra Murty*, Jayadev Bhat, and P K A Muniswaran , Hydrolysis of Oils by Using Immobilized Lipase Enzyme: A Review, Biotechnol Bioprocess Eng 2002, 7: 57-66 José M Palomo, Gloria Muñoz, Gloria Fernández-Lorente, Cesar Mateo, Roberto Fernández-Lafuente∗, José M Guisán1, Interfacial adsorption of lipases on very hydrophobic support (octadecyl–Sepabeads) immobilization, hyperactivation and stabilization of the open form of lipases, Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic 19–20 (2002) 279–286 S.-W Chang, J.-F Shaw, K.-H Yang, S.-F Chang, C.-J Shieh, Studies of optimum conditions for covalent immobilization of Candida rugosa lipase on poly(c-glutamic acid) by RSM, Bioresource Technology 99 (2008) 2800–2805 10 Dasciana S Rodrigues, Adriano A Mendes, Wellington S Adriano, Luciana R.B Goncalves,Raquel L.C Giordano, Multipoint covalent immobilization of microbial lipas on chitosan and agarose activated by different methods, Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic 51 (2008) 100–109 ~ 36 ~ Đồ án môn học Tài liệu tham khảo 11 Seema S.Betigeri, Steven H.Neau, Immobilization of lipase using hydrophilic polymers in the form of hydrogel beads, Biomaterials 23 (2002) 3627–3636 12 Keehoon Won, Sangbum Kim, Kwang-Je Kim, Hong Woo Park, Sang-Jin Moon, Optimization of lipase entrapment in Ca-alginate gel beads, Process Biochemistry 40 (2005) 2149–2154 13 Paramita Mahapatra, Annapurna Kumari, Vijay Kumar Garlapati, Rintu Banerjee, Ahindra Nag, Enzymatic synthesis of fruit flavor esters by immobilized lipase from Rhizopus oligosporus optimized with response surface methodology, Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic 14 Wiphum Kaewthong, Sarote Sirisansaneeyakul, Poonsuk Prasertsan, Aran H-Kittikun, Continuous production of monoacylglycerols by glycerolysis of palm olein with immobilized lipase, Process Biochemistry 40 (2005) 1525–1530 15 S.J Prashanth, V.H Mulimani, Soymilk oligosaccharide hydrolysis by Aspergillus oryzae-galactosidase immobilized in calcium alginate, Process Biochemistry 40 (2005) 1199–1205 16 S Thippeswamy, V.H Mulimani, Enzymic degradation of raffinose family oligosaccharides in soymilk by immobilized a-galactosidase from Gibberella fujikuroi, Process Biochemistry 38 (2002) 635/640 17 Miguel Filho, Benevides C Pessela, Cesar Mateo, Alfonso V Carrascosa, Roberto Fernandez-Lafuente, Jose M Guis´ an, Immobilization–stabilization of an -galactosidase from Thermus sp strain T2 by covalent immobilization on highly activated supports: Selection of the optimal immobilization strategy, Enzyme and Microbial Technology 42 (2008) 265–271 18 Saraju P.Mohanty and Elias Kougianos ,Biosensors: A tutorial review 19 Jose ´ I Reyes De Corcuera, Ralph P Cavalieri, Biosensors, Washington State University, Pullman, Washington, U.S.A 20 Anjan Kumar Basu, Parimal Chattopadhyay, Utpal Roychudhuri, Runu Chakraborty, Glutamate optical biosensor based on the immobilization of glutamate dehydrogenase in titanium dioxide sol–gel matrix, , Department of Food Technology and Biochemical Engineering, Jadavpur University, Kolkata 700032, India ~ 37 ~ ... ~8~ Chương 2: Ứng dụng Đồ án môn học Chƣơng 2: ỨNG DỤNG CỦA ENZYM CỐ ĐỊNH 2.1 Ứng dụng công nghệ thực phẩm 2.1.1 Enzym β-galactosidase 2.1.1.1 Giới thiệu enzym β-galactosidase [2] Enzym β-galactosidase... vậy, ngày có nhiều nghiên cứu cố định enzym nhƣ ứng dụng enzym cố định vào sản xuất công nghiệp 1.2.4 Các phƣơng pháp cố định enzym [1] Các phƣơng pháp cố định enzym đƣợc chia thành nhóm: hóa... pháp enzym cố định - Ngoài sản phẩm trên, enzym cố định cịn đƣợc ứng dụng nhiều cơng nghệ lên men, chống ô nhiễm môi trƣờng y học 1.2 Sơ lƣợc enzym cố định 1.2.1 Định nghĩa [1] Enzym cố định hiểu