Kết nghiên cứu Khoa học BVTV – Số 1/2020 KẾT QUẢ CHUYỂN GEN Xa7 KHÁNG BỆNH BẠC LÁ VÀO GIỐNG LÚA TBR225 Introgression of Xa7 for Bacterial Blight Resistance to Conventional Rice Variety TBR225 Trần Mạnh Báo1, Đặng Cao Cường1, Trần Thị Tiệc1, Nguyễn Thị Nhung1, Nguyễn Văn Hoan2 Ngày nhận bài: 08.2.2020 Ngày chấp nhận: 14.2.2020 Abstract Conventional rice variety TBR225 is valuable variety with high yield potential, short duration, wide adaptation to many ecological regions and the quality of rice is good but is infected Bacterial Leaf Blight (BLB) Backcross breeding method was conducted for transferring Xa7 gene to TBR225 variety for improving Bacterial Blast Resistance The plants which have phenotype similar to TBR225, high resistance to three typical BLB Isolate, carrying homogenous Xa7 gene of BC3 generation were selected by Pedigree Selection The selected plants were inoculated, similar phenotype was selected and MAS technique were used to identify the Xa7 gene and lines of BC3F3 which have the same phenotype of TBR225 It is continued to select on the agro-biological characters, quality and artificial infection by the form of highly toxic isolated bacteria to the BC3F5 generation that was successfully transferred the Xa7 gene into TBR225 variety and was named TBR225KBL Keywords: Bacterial Leaf Blight, TBR225, Xa7 resistance gene, TBR225BB * ĐẶT VẤN ĐỀ Trong sản xuất giống lúa có suất cao, chất lượng tốt thích ứng với nhiều vùng sinh thái khác ngày sử dụng rộng rãi góp phần đáng kể vào trình tăng suất sản lượng lúa Tuy nhiên, hầu hết giống lúa thuộc nhóm tương đối cảm nhiễm với chủng bạc vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv oryzae (Xoo) có mặt Việt Nam Bệnh bạc làm giảm diện tích quang hợp, tăng tỉ lệ hạt lép, giảm khối lượng 1000 hạt gây thiệt hại nghiêm trọng sản xuất lúa năm gần Vì vậy, việc chọn tạo giống lúa kháng bệnh bạc trở thành yêu cầu cấp thiết đặt nhà chọn tạo giống Giống lúa TBR225 giống lúa có tiềm năng suất cao, thời gian sinh trưởng ngắn, thích ứng rộng với vùng sinh thái, không kháng bệnh bạc lá, việc cải tiến giống lúa TBR225 để kháng bệnh bạc việc làm có ý nghĩa, giúp ổn định nâng cao hiệu sản xuất Tạo giống kháng bệnh mang Công ty cổ phần Tập đồn ThaiBinh Seed Học Viện Nơng Nghiệp Viêt Nam 20 gen kháng hướng chủ đạo nhà chọn giống quan tâm (Jena Mackill, 2008, Suh et al., 2013, Dương Đức Huy Nguyễn Văn Hoan 2017) Đến năm 2012, 38 gen kháng bệnh bạc từ nhiều nguồn xác định (Bhasin et al., 2012) số gen kháng định vị nhờ thị liên kết chặt với chúng (Yoshimura et al, (2004); Tian K.Gu (2004) Một số gen kháng Xa4 (Khush et al., 1989), xa5, Xa7, xa13 Xa21 (Perumalsamy et al., 2010) chuyển vào giống suất cao phương pháp chọn giống truyền thống Tuy nhiên, đa dạng chủng bạc làm cho tính kháng dễ bị giống mang gen (chẳng hạn Xa4 ) gieo trồng rộng rãi (Mew et al, 1992) Gen kháng Xa7, phát từ nguồn gen lúa Indonesia, có khả kháng bạc hiệu điều kiện nhiệt độ cao (Webb et al, 2010) biểu phổ kháng rộng với hầu hết mẫu phân lập Việt Nam (Lã Vinh Hoa cs,2010) Bằng thị phân tử Lã Vinh Hoa cs (2010) phát có mặt gen Xa7 nhiều giống lúa địa phương Việt Nam Trong nghiên cứu gen Xa7 chuyển từ IRBB7 (dòng đẳng gen mang gen Kết nghiên cứu Khoa học kháng Xa7) vào giống lúa TBR225 nhằm nâng cao tính kháng bệnh bạc giống VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu quy trình lai lại Dịng đẳng gen IRBB7 mang gen Xa7 kháng bạc sử dụng làm thể cho phép lai lại với giống TBR225 Giống TBR225 tập đồn ThaiBinh Seed chọn tạo, có đặc điểm sinh trưởng khỏe, thân cứng, đẻ nhánh tốt, cấu trúc to, giống lúa gieo cấy rộng rãi Dòng đẳng gen IRBB7 lai với TBR225 x F1 x BVTV – Số 1/2020 giống TBR225 F1 lai lại với giống nhận TBR225 Cây BC1F1 lựa chọn dựa theo kiểu hình thể nhận tiếp tục lai lại để tạo BC2F1; Tiếp tục thực lai lại lần để tạo BC3F1 Tồn q trình lai thực hiên Gia Lai nơi có khí hậu phù hợp để làm hệ năm Tại Gia Lai, dựa vào kiểu hình quần thể BC3F2 đánh giá tính kháng để chọn lọc cho hệ BC3F3 vụ khơ Q trình lai chọn lọc tiến hành từ vụ khô năm 2017 với sơ đồ trình bày hình IRBB7 (Vụ khơ 2- 2016-2017 Gia Lai) TBR225 (Vụ mưa 2017 Gia Lai) BC1F1 x TBR225 (Vụ khô1- 2017 Gia Lai) BC2F1 x TBR225 (Vụ khô 2- 2017-2018 Gia Lai) BC3F1x TBR225 (Chọn lọc dựa vào kiểu hình, vụ mưa 2018, Gia Lai) BC3F2 (Vụ khô 1- 2018 Gia Lai) Lây nhiễm nhân tạo chọn lọc BC3F3 (Vụ khô -2018-2019 Gia Lai) Xác định gen Xa7 đánh giá thị SSR Học Viện NNVN BC3F4 (Vụ Xuân 2019 Thái Bình) Lây nhiễm nhân tạo chọn lọc BC3F5-TBR225KBL (Vụ Mùa 2019 Thái Bình) Lây nhiễm nhân tạo chọn lọc Go Hình Sơ đồ lai lại chọn lọc dòng 2.2 Sàng lọc khả kháng bạc 72 dòng từ BC3F3 đánh giá chọn lọc đối chiếu với kiểu hình dịng TBR225 kết hợp khả kháng bạc thông qua lây nhiễm nhân tạo (Swing J.G and Civerolo E.L;1995) Ba mẫu phân lập (MPL) vi khuẩn bạc gồm mẫu Thái Bình (đại diện cho đồng Bắc Bộ), mẫu Nam Định (đại diện cho khu vực ven biển) mẫu Thanh Hóa (đại diện cho khu vực bắc Trung Bộ) nuôi cấy môi trường Wakimoto 48h để tạo dung dịch lây nhiễm Lây nhiễm tiến hành phương pháp cắt đầu giai đoạn đòng già đánh giá phản ứng với bệnh theo thang điểm dựa vào chiều dài vết bệnh sau 18 ngày lây nhiễm (Furuya et al.,2002) Dòng IRBB7 sử dụng làm đối chứng kháng giống IR24 làm đối chứng nhiễm mô tả sau: 21 Kết nghiên cứu Khoa học BVTV – Số 1/2020 Chiều dài vết bệnh (cm) 12 Mức độ nhiễm bệnh Kháng cao (HR) Kháng (R) Kháng trung bình (MR) Nhiễm trung bình (MS) Nhiễm (S) - Dựa vào kết đánh giá lây nhiễm nhân tạo, 72 cá thể hệ BC3F3 lựa chọn để đánh giá có mặt gen Xa7 Học viện Nơng nghiệp Việt Nam Cặp thị sử dụng RM5509 có trình tự bazơ (F) 5’TGATCCATGCTTTGGCC3’ (R) 5’CCAGCAGAAAGAAGACGC3’ Đối chứng gồm giống gốc TBR225, IRBB7( chuẩn kháng) IR24 (chuẩn nhiễm) Lá non mẫu giống lúa sử dụng để tách chiết DNA tinh theo phương pháp CTAB (Cetyl Trimethyl Ammonium Bronmide) Doyle cs (1987) phịng thí nghiệm Cơng nghệ sinh học, Học Viên Nơng Nghiệp Việt Nam Thể tích cho phản ứng PCR 20ul bao gồm10x buffer, 200 µM dNTPs, 500 µM MgCl2, 0,2 mM mồi, 1ul DNA tổng số, unit Taqpolymerase Chu o trình nhiệt thực gồm 95 C phút, o 35 chu kỳ gồm 95 C 30 giây, 52 o o 53 C 30 giây, 72 C phút 30 giây Chu kỳ cuối 72oC trong7 phút giữ ổn định 4oC Sản phẩm PCR gen Xa7 kiểm tra gel agarose 3% hiệu điện 60V 15phút, sau nhuộm ethium bromide Các dòng mang gen Xa7 đồng hợp thể chọn lọc lại hệ BC3F3 Kết đánh giá kiểu hình so sánh với giống gốc TBR225 có 10 dịng đạt u cầu 2.3 Đánh giá dịng lai lại đặc điểm nơng học 10 dòng lại lại hệ BC3F4 BC3F5 đánh giá với giống nhận vụ xuân 2019 vụ mùa 2019 Thái Bình Thí nghiệm bố trí theo kiểu tập đồn dịng 330 cây, diện tích thí nghiệm 10m Các đặc điểm nông học đánh giá gồm: Bắt đầu đẻ nhánh, đẻ nhánh tối đa, trỗ 10%, trỗ 90%, thời gian sinh trưởng,chiều cao (cm), thời gian trỗ, thời gian sinh trưởng, số bơng/khóm, số hạt/bơng, tỷ lệ hạt (%), khối lượng 1000 hạt, suất cá thể (thế hệ BC3F4) Ở hệ BC3F5 tiêu đánh giá gồm: Phản ứng với chủng phân lập vi khuẩn bạc lá, đặc điểm nông sinh học, chất lượng thử nếm Phương pháp đánh giá tiêu theo Nguyễn Thị Lan, Phạm Tiến Dũng (2006) Giáo trình phương pháp thí nghiệm, Nhà xuất Nơng nghiệp KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Đánh giá chọn lọc dịng lai lại dựa vào kiểu hình lây nhiễm nhân tạo Thế hệ BC3F2 trồng Gia Lai với cá thể có kiểu hình giống với TBR225 chọn lọc Bốn nhóm dịng xuất phát từ phép lai trồng để đánh giá tính kháng với ba mẫu vi khuẩn phân lập Kết lây nhiễm với mẫu phân lập với đối chứng kháng IRBB7 đối chứng nhiễm IR24 xác định nhóm sối nhóm dịng có cá thể kháng cao với vi khuẩn gây bệnh bạc lúa có chiều dài vết bệnh cm (Bảng 1) Bảng Số dòng kháng với ba mẫu phân lập vi khuẩn bạc Thế hệ/Đối chứng BC3F2 IRBB7(đc kháng) IR24 ( đc nhiễm) 22 Tổng số nhóm dịng 1 Số nhóm dịng kháng mức cao (HR) Mẫu phân Mẫu phân lập Mẫu phân lập lập 3 + + + + + + Số nhóm dịng kháng ba mẫu phân lập Kết nghiên cứu Khoa học BVTV – Số 1/2020 Kết chọn lọc qua lây nhiễm nhân tạo cho thấy hệ lai lại thứ tỷ lệ kháng đạt 7,2 % Kết phù hợp với nghiên cứu trước (Bùi Chí Bửu Nguyễn Thị Lang (2003), Hien Vu Thu et al.,(2007) Từ ba mẫu phân lập chọn 72 cá thể (dòng) kháng bệnh bạc lá, chúng kiểm tra có mặt gen Xa7 để tiếp tục chọn lọc hệ BC3F3 3.2 Sàng lọc dòng lai lại thị phân tử với gen Xa7 Kiểm tra có mặt gen Xa7 thị RM5509 cho thấy dòng BC3F3 mang gen kháng trạng thái dị hợp tử đồng hợp tử (Hình 2) Kết 31 dịng BC3F3 mang gen đồng hợp tử xác định (Bảng 3,4,5) 10 11 12 a b c d L 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 A 25 2627282930 31 32 3334 35 36 a b c d L 373839 40 41 42434445 46 47 48 B 49 5051 525354 555657585960 a b c d L 61626364656667686970 7172 C 300bp Hình Ảnh điện di 72 cá thể qua lây nhiễm nhân tạo sơ có phản ứng kháng Bảng Sự có mặt Xa7 thơng qua phân tích PCR với cặp mồi RM5509 24 cá nhóm 1(1-24) hệ BC3F3 Băng a b Đối chứng/Cá thể chọn lọc TBR225 IR24 Kiểu gen Băng Không mang gen Không mang gen Dị hợp tử c d 13 Đối chứng/Cá thể chọn lọc IRBB7 IRBB5/7 - Kiểu gen Đồng hợp tử Xa7 Đồng hợp tử Xa7 Xa5 Dị hợp tử 23 Kết nghiên cứu Khoa học Băng 10 11 12 Đối chứng/Cá thể chọn lọc 2.1 2.2 2.3 2.4 2.5 2.6 2.7 2.8 - BVTV – Số 1/2020 Kiểu gen Băng Đồng hợp tử Dị hợp tử Đồng hợp tử Đồng hợp tử Dị hợp tử Đồng hợp tử Đồng hợp tử Đồng hợp tử Đồng hợp tử Đồng hợp tử Dị hợp tử 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 Ở nhóm gồm 24 cá thể có ký hiệu 1-24 bảng điện di có 14 cá thể mang gen đồng hợp thể Xa7 Khi lúa trổ chín vào phân tích kiểu gen đánh giá lại chi tiết kiểu hình Đối chứng/Cá thể chọn lọc 2.9 2.10 2.11 2.12 2.13 2.14 - Kiểu gen Dị hợp tử Đồng hợp tử Đồng hợp tử Dị hợp tử Đồng hợp tử Đồng hợp tử Dị hợp tử Đồng hợp tử Dị hợp tử Đồng hợp tử Dị hợp tử nhóm chọn dịng hồn tồn đồng dạng tất tính trạng so với TBR225 gốc 2.1, 2.2, 2.3, 2.4 2.6 Bảng Sự có mặt Xa7 thơng qua phân tích PCR với cặp mồi RM5509 24 cá nhóm (25-48) hệ BC3F3 Đối Băng chứng/Cá thể Kiểu gen Băng chọn lọc thể chọn lọc Kiểu gen A R212 Không mang gen c IRBB7 Đồng hợp tử Xa7 B IR24 Không mang gen d IRBB5/7 Đồng hợp tử Xa7 Xa5 25 4.1 Đồng hợp tử 37 4.11 Đồng hợp tử Đồng hợp tử 26 4.2 Đồng hợp tử 38 4.12 27 4.3 Đồng hợp tử 39 - Dị hợp tử 28 4.4 Đồng hợp tử 40 - Dị hợp tử 29 4.5 Đồng hợp tử 41 4.13 30 4.6 Đồng hợp tử 42 - Dị hợp tử 31 - Dị hợp tử 43 - Dị hợp tử 32 - Dị hợp tử 44 - Dị hợp tử 33 4.7 Đồng hợp tử 45 - Dị hợp tử 34 4.8 Đồng hợp tử 46 - Dị hợp tử 35 4.9 Đồng hợp tử 47 4.14 Đồng hợp tử 36 4.10 Đồng hợp tử 48 4.15 Đồng hợp tử Ở 24 cá thể nhóm (25-48) có 15 cá thể mang gen đồng hợp thể Xa7 Khi lúa trổ chín vào phân tích kiểu gen đánh giá lại chi 24 Đối chứng/Cá Đồng hợp tử tiết kiểu hình nhóm chọn dịng hồn tồn đồng dạng tất tính trạng so với TBR225 gốc 4.2 4.4 4.8 Kết nghiên cứu Khoa học BVTV – Số 1/2020 Bảng Sự có mặt Xa7 thơng qua phân tích PCR với cặp mồi RM5509 24 cá nhóm hệ BC3F3 (49-72) Băng A B 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 Đối chứng/Cá thể chọn lọc TPR225 IR24 - Kiểu gen Băng Không mang gen Không mang gen Dị hợp tử Dị hợp tử Dị hợp tử Không mang gen Dị hợp tử Dị hợp tử Dị hợp tử Dị hợp tử Dị hợp tử Dị hợp tử Dị hợp tử Không mang gen c D 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 Ở nhóm 24 cá thể thuộc nhóm (4972) có cá thể mang gen đồng hợp thể Xa7 ký hiệu 10.1 10.2 Khi lúa trổ chín vào phân tích kiểu gen đánh giá lại chi tiết kiểu hình nhóm dịng đạt yêu cầu so với TBR225 gốc Như số 31 dòng mang gen Xa7 đồng hợp thể có dịng nhóm 1, dịng nhóm dịng thuộc nhóm (tổng số 10 dịng) hồn toàn đạt tiêu chuẩn để đưa vào chọn lọc hệ BC3F4 BC3F5 Thái Bình Đối chứng/Cá thể chọn lọc IRBB7 IRBB5/7 10.1 10.2 - Kiểu gen Đồng hợp tử Xa7 Đồng hợp tử Xa7 Xa5 Đồng hợp tử Dị hợp tử Dị hợp tử Không mang gen Không mang gen Dị hợp tử Đồng hợp tử Dị hợp tử Dị hợp tử Không mang gen Dị hợp tử Dị hợp tử 3.3 Đặc điểm nông học suất dòng lai lại đạt yêu cầu 10 dòng hệ BC3F4 với dòng nhận đánh giá vụ Xn 2019 Thái Bình Các dịng lai lại (gọi tắt TBR225KBL) có đặc điểm nơng học thời gian từ cấy đễn trỗ, số nhánh, thời gian sinh trưởng…tương tự giống TBR225 (Bảng 5) Tuy nhiên, số dịng lai lại có chiều cao cao 1-2cm, khác biệt nằm sai số Bảng Thời gian qua giai đoạn sinh trưởng dịng TBR225 KBL vụ Xn 2019 Thái Bình ĐVT: Ngày Dòng lai lại chọn Bắt đầu đẻ nhánh Đẻ nhánh tối đa Trỗ 10% Trỗ 90% Thời gian sinh trưởng Chiều cao (cm) 2.1 15 29 54 105 136 102,5 2.2 16 28 58 106 137 105,2 2.3 16 28 55 107 138 106,6 2.4 15 30 57 107 138 103,8 2.6 16 28 53 107 138 106,1 4.2 16 28 58 106 137 104,0 25 Kết nghiên cứu Khoa học BVTV – Số 1/2020 Dòng lai lại chọn Bắt đầu đẻ nhánh Đẻ nhánh tối đa Trỗ 10% Trỗ 90% Thời gian sinh trưởng Chiều cao (cm) 4.6 16 28 55 106 138 104,0 4.8 10.1 16 16 27 32 56 57 106 106 138 138 103,6 106,4 10.2 16 31 57 107 138 104,4 TBR225 LSD0,05 17 44 56 107 138 4,2 106,4 5,6 Số hạt/bông khối lượng 1000 hạt phần lớn dòng lai lại cao giống gốc nằm sai số Năng suất cá thể phần lớn dịng khơng cao có ý nghĩa so với TBR225 số hạt/bơng có cao khơng đáng kể, tỷ lệ lép dòng chọn lọc thấp giống gốc dẫn tới suất cá thể dòng chọn lọc tương tự TBR225 nguyên (Bảng 6) Bảng Các yếu tố cấu thành suất suất cá thể dòng TBR225KBL triển vọng Xuân 2019 Thái Bình Dịng lai lại chọn 2.1 2.2 2.3 2.4 2.6 4.2 4.4 4.8 10.1 10.2 TBR225 LSD0,05 Số bơng/khóm 5,6 6,0 6,3 5,8 5,3 7,0 5,8 5,6 5,1 5,2 6,6 2,3 Số hạt/bông 239,4 238,2 204,0 230,5 194,7 238,6 227,7 226,6 203,6 223,2 198,8 5,2 Các dòng lai lại chọn lọc mang kiểu gen dòng nhận chứa gen Xa7 trạng thái đồng hợp tử Kết lây nhiễm nhân tạo với chủng vi khuẩn gây bệnh bạc phân lập từ Thái Bình, Nam Định Thanh Hóa dịng Tỷ lệ hạt (%) 90,4 90,2 90,9 90,7 91,0 91,2 89,9 90,6 90,2 92,4 93,4 3,2 Khối lượng 1000 hạt (g) 23, 24,1 24,0 24,5 24,2 24,4 24,1 24,1 23,9 24,2 24,2 2,3 Năng suất cá thể (g/khóm) 23,0 23,7 23,1 23,8 23,5 24,7 25,1 24,6 24,9 23,9 23,8 3,8 vụ Xuân 2019 (hế hệ BC3F4) Thái Bình cho thấy tất dịng TBR225KBL tuyển chọn kháng đến kháng cao với chủng vi khuẩn (Bảng 7) Bảng Đánh giá khả kháng bệnh bạc dòng lúa TBR225KBL triển vọng qua lây nhiễm nhân tạo vụ Xuân 2019 Dòng lai lai chọn 2.1 2.2 2.3 26 Chiều dài vết bệnh (cm) Chủng Thái Chủng Chủng Bình Nam Định Thanh Hoá 0,4 1,7 0,9 0,5 1,6 0,8 0,9 2,5 0,7 Mức độ kháng nhiễm Chủng Thái Chủng Chủng Bình Nam Định Thanh Hoá HR R HR HR R HR HR R HR .. .Kết nghiên cứu Khoa học kháng Xa7) vào giống lúa TBR225 nhằm nâng cao tính kháng bệnh bạc giống VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu quy trình lai lại Dịng đẳng gen IRBB7 mang gen. .. (dòng) kháng bệnh bạc lá, chúng kiểm tra có mặt gen Xa7 để tiếp tục chọn lọc hệ BC3F3 3.2 Sàng lọc dòng lai lại thị phân tử với gen Xa7 Kiểm tra có mặt gen Xa7 thị RM5509 cho thấy dòng BC3F3 mang gen. .. gen Xa7 kháng bạc sử dụng làm thể cho phép lai lại với giống TBR225 Giống TBR225 tập đoàn ThaiBinh Seed chọn tạo, có đặc điểm sinh trưởng khỏe, thân cứng, đẻ nhánh tốt, cấu trúc to, giống lúa