Nghiên cứu tổng hợp hệ chất mang thuốc nano polyamidoamine (pamam) biến tính có khả năng hướng đích đến tế bào ung thư

LỜI CAM ĐOAN Cơng trình đƣợc thực phịng Hóa dƣợc – Viện Khoa học Vật liệu ứng dụng – Viện Hàn Lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam Thành phố Hồ Chí Minh Tơi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu tơi đƣợc hƣớng dẫn khoa học PGS.TS Nguyễn Cửu Khoa GS.TS Nguyễn Công Hào Các nội dung nghiên cứu, kết luận án trung thực, đƣợc hoàn thành dựa kết nghiên cứu kết chƣa đƣợc dùng cho luận văn cấp Tác giả luận án Nguyễn Thị Bích Trâm i LỜI CÁM ƠN Tơi xin trân trọng cảm ơn PGS.TS Nguyễn Cửu Khoa GS.TS Nguyễn Công Hào định hƣớng khoa học, giúp đỡ tận tình suốt trình thực luận án Xin gởi đến Thầy lời biết ơn chân thành Tôi xin cảm ơn hỗ trợ TS Trần Ngọc Quyển anh chị Viện Khoa học Vật liệu ứng dụng – Viện Hàn Lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam Tôi xin cảm ơn giúp đỡ tạo điều kiện thuận lợi Viện Cơng nghệ Hóa học suốt thời gian tơi thực luận án Sau cùng, xin gởi lời cảm ơn đến gia đình, bạn bè, đồng nghiệp động viên, giúp đỡ cho tơi hồn thành luận án ii MỤC LỤC MỞ ĐẦU CHƢƠNG - TỔNG QUAN 1.1 GIỚI THIỆU DENDRIMER .4 1.1.1 Khái niệm dendrimer 1.1.2 Tính chất dendrimer 1.1.3 Các phƣơng pháp tổng hợp .11 1.1.4 Ứng dụng dendrimer PAMAM làm chất mang thuốc chống ung thƣ hƣớng đích .15 1.2 BIẾN TÍNH BỀ MẶT DENDRIMER PAMAM .19 1.2.1 Biến tính bề mặt dendrimer với tác nhân tƣơng hợp sinh học 20 1.2.2 Biến tính bề mặt dendrimer với tác nhân hƣớng đích .20 1.3 NHỮNG NGHIÊN CỨU TRƢỚC ĐÂY 22 1.3.1 Những nghiên cứu biến tính dendrimer PAMAM với tác nhân alkyl hóa ………………………………………………………………………… 22 1.3.2 Những nghiên cứu biến tính dendrimer PAMAM với tác nhân hƣớng đích – acid folic .25 1.4 PHƢƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH KHỐI LƢỢNG PHÂN TỬ CỦA DENDRIMER VÀ DẪN XUẤT .28 1.4.1 Xác định khối lƣợng phân tử dendrimer dẫn xuất dựa vào phổ MALDI- TOF-MS (WtMALD) 28 1.4.2 Xác định khối lƣợng phân tử polymer dựa vào phổ 1H-NMR 30 1.4.3 Một số phƣơng pháp khác định khối lƣợng phân tử dendrimer dẫn xuất .30 CHƢƠNG - NGHIÊN CỨU 32 2.1 NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 32 iii 2.1.1 Nội dung nghiên cứu 32 2.1.2 Phƣơng pháp nghiên cứu 34 2.2 THỰC NGHIỆM .48 2.2.1 Hóa chất 48 2.2.2 Thiết bị dụng cụ 49 2.2.3 Thực nghiệm .50 CHƢƠNG - KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 72 3.1 TỔNG HỢP DENDRIMER PAMAM TỪ THẾ HỆ G-0.5 ĐẾN G3.0 72 3.1.1 Xác định cấu trúc dendrimer PAMAM dựa vào phổ 1H-MNR 72 3.1.2 Xác định khối lƣợng phân tử dendrimer PAMAM dựa vào phổ khối lƣợng MS .79 3.1.3 Xác định khối lƣợng phân tử dendrimer PAMAM dựa vào phổ 1H-NMR ………………………………………………………………………… 80 3.2 BIẾN TÍNH DENDRIMER PAMAM VỚI TÁC NHÂN ALKYL 84 3.2.1 Biến tính dendrimer PAMAM G3.0 với acyl chloride .84 3.2.2 Biến tính dendrimer PAMAM G3.0 với acid carboxylic 91 3.2.3 Biến tính dendrimer PAMAM G3.0 với alcohol 95 3.2.4 Biến tính dendrimer PAMAM G2.5 với alkylamine 99 3.3 BIẾN TÍNH DENDRIMER PAMAM G3.0 VỚI TÁC NHÂN HƢỚNG ĐÍCH – ACID FOLIC 105 3.4.1 Biến tính dendrimer PAMAM G3.0 với tác nhân hƣớng đích - acid folic 105 3.4.2 Biến tính dendrimer PAMAM G3.0 với hexanoyl chloride tác nhân hƣớng đích - acid folic .108 3.4 KẾT QUẢ THỬ ĐỘC TÍNH TẾ BÀO 112 3.5 KẾT QUẢ THÂM NHẬP TẾ BÀO 113 iv 3.6 XÁC ĐỊNH KÍCH THƢỚC NANO CỦA DENDRIMER G3.0 VÀ MỘT SỐ DẪN XUẤT 116 3.7 KHẢO SÁT KHẢ NĂNG MANG VÀ NHẢ THUỐC 117 3.7.1 Khảo sát khả mang (nang hóa) thuốc chống ung thƣ 5-fluorouracil ………………………………………………………………………….117 3.7.2 Khảo sát khả nhả thuốc 119 KẾT LUẬN 120 KIẾN NGHỊ 122 DANH MỤC CÁC CƠNG TRÌNH LIÊN QUAN ĐẾN ĐỀ TÀI LUẬN ÁN 123 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC v DANH MỤC BẢNG BIỂU Bảng 1.1: Đánh giá khối lƣợng phân tử PAMAM dẫn xuất dựa vào MALDI-TOF-MS [77] .29 Bảng 1.2: Khối lƣợng phân tử tính toán theo lý thuyết (WtLT) dendrimer PAMAM từ G-0.5 – G3.0 [1, 98] 31 Bảng 2.1: Tỉ lệ proton vị trí (e), (a) phân tử dendrimer (LT)của dendrimer PAMAM từ G-0.5 đến G3.0 42 Bảng 2.2: Tỉ lệ proton vị trí (j), (a) phân tử dẫn xuất alkyl-dendrimer PAMAM G3.0 (LT) .44 Bảng 2.3 Một số thơng số vật lý hóa chất 48 Bảng 3.1: Dữ liệu phổ 1H-NMR sản phẩm dendrimer PAMAM từ hệ G-0.5 đến G3.0 .78 Bảng 3.2: Khối lƣợng phân tử dendrimer PAMAM từ G-0.5 đến G3.0 sở khối phổ MS 79 Bảng 3.3: Tỉ lệ diện tích tín hiệu proton vị trí (a), (e) thể phổ 1HMNR (NMR) dendrimer PAMAM từ G-0.5 đến G3.0 80 Bảng 3.4: Khối lƣợng phân tử dendrimer PAMAM từ G-0.5 đến G3.0 sở phổ 1H-NMR MS 82 Bảng 3.5: Dữ liệu phổ 1H-NMR sản phẩm khảo sát biến tính dendrimer PAMAM G3.0 với decanoyl chloride theo thời gian 85 Bảng 3.6: Kết khảo sát biến tính dendrimer PAMAM G3.0 với decanoyl chloride theo thời gian 87 Bảng 3.7: Dữ liệu phổ 1H-NMR sản phẩm biến tính dendrimer PAMAM G3.0 với acyl chloride .89 Bảng 3.8: Kết biến tính dendrimer PAMAM G3.0 với tác nhân acyl chloride .90 Bảng 3.9: Dữ liệu phổ 1H-NMR sản phẩm dendrimer PAMAM G3.0- acid carboxylic .92 Bảng 3.10: Kết biến tính dendrimer PAMAM G3.0 với acid carboxylic .93 Bảng 3.11 Dữ liệu phổ 1H-NMR sản phẩm biến tính dendrimer PAMAM G3.0 với alcohol .96 Bảng 3.12: Kết biến tính dendrimer PAMAM G3.0 với alcoholhol .97 Bảng 3.13: Dữ liệu phổ 1H-NMR sản phẩm khảo sát nhiệt độ phản ứng biến tính dendrimer PAMAM G2.5 với dodecylamine 100 Bảng 3.14: Kết khảo sát nhiệt độ phản ứng biến tính dendrimer PAMAM G2.5 với dodecylamine .101 Bảng 3.15: Dữ liệu phổ 1H-NMR sản phẩm biến tính dendrimer PAMAM G2.5 với alkylamine .103 vi Bảng 3.16: Kết biến tính dendrimer PAMAM G2.5 với alkylamine 104 Bảng 3.17: Dữ liệu phổ 1H-NMR sản phẩm G3.0-FA 106 Bảng 3.18: Dữ liệu phổ 1H-NMR dẫn xuất dendrimer PAMAM G3.0-C6-FA 110 vii DANH MỤC CƠNG THỨC Cơng thức 2.1: Cơng thức tính khối lƣợng phân tử dendrimer PAMAM dựa phổ 1H-NMR .41 Công thức 2.2: Công thức tính độ chuyển hóa dẫn xuất dendrimer PAMAM G3.0 thông qua phổ 1H-NMR 44 viii DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH Hình 1.1: Cấu trúc phân tử dendrimer [2] Hình 1.2: Các hệ dendrimer [4] Hình 1.3: Cấu trúc dendrimer PAMAM với lõi EDA hệ chẵn .5 Hình 1.4: Cấu trúc dendrimer PAMAM với lõi hexane diamine hệ lẻ Hình 1.5: Các dạng phân bố dendrimer dung dịch [8] Hình 1.6: Kích thƣớc dendrimer kích thƣớc vật chất thể [8] Hình 1.7: Các hình thức mang thuốc dendrimer [9] Hình 1.8: Cấu trúc thành vách tế bào Eukaryotic [15] 11 Hình 1.9: Phƣơng pháp tổng hợp từ ngồi [16] 12 Hình 1.10: Phƣơng pháp tổng hợp từ vào [16] 12 Hình 1.11: Phƣơng pháp tổng hợp từ vào hai bƣớc 13 Hình 1.12: Phƣơng pháp tổng hợp tăng lũy thừa hai [16] 14 Hình 1.13: Phƣơng pháp tổng hợp trực giao [16] .14 Hình 1.14: Phƣơng pháp tổng hợp với monomer siêu nhóm chức [16] .15 Hình 1.15: Nồng độ thuốc huyết tƣơng ứng với phƣơng pháp sử dụng thuốc: Tiêm qua tĩnh mạch (a); Uống trực tiếp (b); Thuốc nhả chậm từ chất mang (c) [33] 16 Hình 1.16: Sự hƣớng đích thụ động theo chế EPR [15] 17 Hình 1.17: Dendrimer mang thuốc đƣợc gắn tác nhân hƣớng đích đến tế bào ung thƣ [37] .18 Hình 1.18: Quá trình nhập bào chất mang-thuốc vào tế bào [15] 19 Hình 1.19: Thành phần cấu trúc acid folic .21 Hình 1.20: Sơ đồ biến tính dendrimer PAMAM với nhóm alkyl bề mặt [25] .24 Hình 1.21: Cấu trúc hóa học dẫn xuất: (a) amino/hexyl dendrimer PAMAM G4.0; (b) hydroxyl/hexyl dendrimer PAMAM G4.0; (c) glucosamine/hexyl dendrimer PAMAM G4.0 [73] .25 Hình 1.22: Sơ đồ tổng hợp dẫn xuất dendrimer PAMAM (G5.0-FITC-Folate)Ac [76] .25 Hình 1.23: Cấu trúc hóa học dendrime PAMAM G4.0-FA-PEG4000 [47] 27 Hình 1.24: Sơ đồ phản ứng tổng hợp dendrimer PAMAM G5-Ac(96)-FA-PhiPhiLux G1D2 [78] 28 Hình 2.1: Phổ 1H-NMR dendrimer PAMAM G3.0 .43 Hình 2: Phổ 1H-NMR dẫn xuất dendrimer PAMAM G3.0-C10 .46 Hình 3.1: Phổ 1H-NMR cấu trúc phân tử dendrimer PAMAM G-0.5 73 Hình 3.2: Phổ 1H-NMR cấu trúc phân tử dendrimer PAMAM G0.0 .73 Hình 3.3: Phổ 1H-NMR cấu trúc phân tử dendrimer PAMAM G0.5 .74 Hình 3.4: Phổ 1H-NMR cấu trúc phân tử dendrimer PAMAM G1.0 .75 Hình 3.5: Phổ 1H-NMR cấu trúc phân tử dendrimer PAMAM G1.5 .75 Hình 3.6: Phổ 1H-NMR cấu trúc phân tử dendrimer PAMAM G2.0 .76 Hình 3.7: Phổ 1H-NMR cấu trúc phân tử dendrimer PAMAM G2.5 .77 Hình 3.8: Phổ 1H-NMR cấu trúc phân tử dendrimer PAMAM G3.0 .78 ix Hình 3.9: Cấu trúc sản phẩm G3.0-(NH-CO-CH2(CH2)nCH3)z 84 Hình 3.10: Phổ 1H-NMR sản phẩm dendrimer PAMAM G3.0-C10-36h (G3.0-C10) .87 Hình 3.11: Cấu trúc sản phẩm G3.0-(NH-CO-CH2(CH2)nCH3)z 91 Hình 3.12: Cấu trúc dẫn xuất dendrimer PAMAM G3.0-alcohol 95 Hình 3.13: Cấu trúc dẫn xuất dendrimer PAMAM G2.5-alkylamine 99 Hình 3.14: Cấu trúc sản phẩm dendrimer PAMAM G 3.0-FA 105 Hình 3.15: Phổ 1H-NMR sản phẩm dendrimer PAMAM G3.0-FA 106 Hình 3.16: Cấu trúc dẫn xuất dendrimer PAMAM G 3.0-C6-FA 109 Hình 3.17: Phổ dẫn xuất dendrimer PAMAM G3.0-C6-FA 109 Hình 3.18: Kết phân tích kính hiển vi laser quét đồng tiêu 114 Hình 3.19: Kết TEM Dendrimer PAMAM G3.0 dẫn xuất dendrimer PAMAM G3.0-C6 .116 Hình 3.20: Kết TEM dẫn xuất dendrimer PAMAM G3.0-FA G3.0-C6-FA .116 Hình 3.21: Sắc kí đồ 5-FU khơng nang hóa dendrimer PAMAM G3.0 118 Hình 3.22: Sắc kí đồ 5-FU khơng nang hóa dẫn xuất dendrimer PAMAM G3.0-C6-FA 118 x Phụ lục 12: Phổ 1H-NMR dẫn xuất dendrimer PAMAM G3.0-C14-EDC P14 Phụ lục 13: Phổ 1H-NMR dẫn xuất dendrimer PAMAM G3.0-C2-NPC P15 Phụ lục 14: Phổ 1H-NMR dẫn xuất dendrimer PAMAM G3.0-C6-NPC P16 Phụ lục 15: Phổ 1H-NMR dẫn xuất dendrimer PAMAM G3.0-C8-NPC P17 Phụ lục 16: Phổ 1H-NMR dẫn xuất dendrimer PAMAM G3.0-C12-NPC P18 Phụ lục 17: Phổ 1H-NMR dẫn xuất dendrimer PAMAM G2.5-C12-poC P19 Phụ lục 18: Phổ 1H-NMR dẫn xuất dendrimer PAMAM G2.5-C12-60oC P20 Phụ lục 19: Phổ 1H-NMR dẫn xuất dendrimer PAMAM G2.5-C12-80oC P21 Phụ lục 20: Phổ 1H-NMR dẫn xuất dendrimer PAMAM G2.5-C4 P22 Phụ lục 21: Phổ 1H-NMR dẫn xuất dendrimer PAMAM G2.5-C8 P23 Phụ lục 22: Phổ 1H-NMR dẫn xuất dendrimer PAMAM G2.5-C10 P24 Phụ lục 23: Phổ 1H-NMR dẫn xuất dendrimer PAMAM G3.0-FA P25 Phụ lục 24: Phổ 1H-NMR dẫn xuất dendrimer PAMAM G3-C6-FA P26 Phụ lục 25: Xây dựng sơ đồ đƣờng chuẩn 5-FU 5-FU đƣợc pha với nồng độ khác từ 0.00125 -1 (mg/mL), bƣớc sóng 260 nm; tiêm mẫu 5µL; tốc độ dịng 1mL/phút.sau đo HPLC để xây dựng phƣơng trình đƣờng chuẩn Bảng P1: Số liệu đƣờng chuẩn STT Nồng độ dung dịch chuẩn C(mg/ml) 0.00125 0.0025 0.005 0.01 0.1 Area[ ] 29.189 51.429 97.886 201.425 1605.171 14 800.000 Từ ta dựng đƣợc đồ thị nhƣ sau: Hình P1: Đồ thị đƣờng chuẩn 5-FU Từ đồ thị ta có phƣơng trình đƣờng chuẩn: y = 14732x + 45.442 (R2 =0.9999) P27 Phụ lục 26: Số liệu nhả thuốc dẫn xuất dendrimer PAMAM G3.0-C6-FA Bảng P2: Số liệu nhả thuốc dẫn xuất dendrimer PAMAM G3.0-C6-FA Thời gian 5-FU (mg) G3.0-C6-FA/5FU (mg) 5-FU % G3.0-C6/5FU % 12 24 1.981 2.111 2.132 2.133 2.163 1.16 1.88 1.93 2.12 2.12 90,046 95,956 96,955 96,954 98,322 73,6 85,6 87,5 96,5 96,5 P28 ... thực đề tài: ? ?Nghiên cứu tổng hợp hệ chất mang thuốc nano polyamidoamine (PAMAM) biến tính có khả hướng đích đến tế bào ung thư? ?? Mục tiêu luận án Tổng hợp hệ dendrimer PAMAM biến tính bề mặt dendrimer... lược tác nhân hướng đích đến tế bào ung thư Tác nhân hƣớng đích đến tế bào ung thƣ phân tử có khả nhận diện tế bào ung thƣ, từ giúp chất mang thuốc di chuyển đến vị trí tế bào ung thƣ Phối tử đƣợc... Dendrimer mang thuốc đƣợc gắn tác nhân hƣớng đích đến tế bào ung thƣ [50] Khi đƣợc gắn tác nhân tƣơng tác đặc hiệu với tế bào ung thƣ, chất mang thuốc di chuyển đến vị trí tế bào ung thƣ, có tƣơng