Đang tải... (xem toàn văn)
NGHIÊN CỨU LÂM SÀNG 60 TẠP CHÍ NỘI KHOA VIỆT NAM | SỐ 18/2020 Ngày nhận bài 26/6/2020 Ngày phản biện 11/8/2020 Ngày chấp nhận đăng 17/8/2020 Nghiên cứu đặc điểm một số đa hình gen Methylenetetrahydrof[.]
NGHIÊN CỨU LÂM SÀNG Nghiên cứu đặc điểm số đa hình gen Methylenetetrahydrofolate Reductase (MTHFR) bệnh nhân đột quỵ nhồi máu não Nguyễn Hà Hương Ly1, Trần Văn Khoa1, Nguyễn Việt Hà1 Triệu Tiến Sang1, Đỗ Đức Thuần2 Học viện Quân y Bệnh viện Quân y 103 TĨM TẮT Mục tiêu: Hồn thiện quy trình ARMSPCR xác định phân tích đa hình gen MTHFR phân tích mối liên quan đa hình gen MTHFR với đột quỵ nhồi máu não Đối tượng phương pháp: Mẫu máu tĩnh mạch 100 bệnh nhân khám điều trị Khoa Đột quỵ, bệnh viện Quân Y 103 mẫu máu 100 người khỏe mạnh: 50 nam, 50 nữ đối chứng; áp dụng phương pháp ARMS-PCR xác định kiểu gen đa hình C677T A1298C gen MTHFR phân tích kết để kết luận mối liên quan đa hình gen MTHFR bệnh đột quỵ nhồi máu não Kết quả: Đối với đa hình C677T, kiểu gen đồng hợp tử đột biến TT với OR cao 1,48, tương ứng với mơ hình lặn Kiểu gen có khả làm tăng nguy gây đột quỵ nhồi máu não (OR = 1,48; 95%CI = 0,54 - 4,05) Đối với đa hình A1298C, kiểu gen AA có tính chất bảo vệ, kiểu gen AC; Ngày nhận bài: 26/6/2020 Ngày phản biện: 11/8/2020 Ngày chấp nhận đăng: 17/8/2020 60 TẠP CHÍ NỘI KHOA VIỆT NAM | SỐ 18/2020 AC+CC có xu hướng làm tăng nguy gây đột quỵ nhồi máu não với OR tương ứng 1,2 1,18 (theo mơ hình trội), khác biệt chưa có ý nghĩa thống kê Kết luận: Đã hồn thiện quy trình ARMSPCR ứng dụng thành công kỹ thuật xác định phân tích đa hình gen MTHFR; Phát thấy kiểu gen TT thuộc đa hình C677T có liên quan tăng nguy đột quỵ nhồi mãu não (OR =1,48), nhiên khác biệt chưa có có ý nghĩa thống kê; Chưa phát mối liên quan kiểu gen khác thuộc đa hình C677T A1298C gen MTHFR đến đột quỵ nhồi máu não Từ khóa: ARMS-PCR, đa hình C677T, đa hình A1298C, đột quỵ nhồi máu não, gen MTHFR ĐẶT VẤN ĐỀ Đột quỵ não trở thành vấn đề quan trọng y học tất quốc gia giới bệnh có tỷ lệ mắc, tỷ lệ tử vong cao có mức độ di chứng tàn phế nặng nề NGHIÊN CỨU LÂM SÀNG bệnh lý nội khoa, chi phí điều trị tốn Đến đột quỵ não vấn đề thời cấp thiết lẽ số lượng bệnh nhân đột quỵ não ngày tăng, tỷ lệ tử vong cao Trên giới, tử vong đột quỵ não đứng hàng thứ ba sau bệnh tim mạch ung thư Đột quỵ xảy lượng máu cung cấp cho phần não bị chặn lại có mạch máu não bị vỡ khiến máu tràn vào khoảng không xung quanh tế bào não [1] Đột quỵ nhồi máu não chiếm khoảng 80-85% toàn thể đột quỵ não [2] Đột quỵ nhồi máu não tắc động mạch ni nhiều ngun nhân thường gặp huyết khối động mạch Nhiều nghiên cứu số gen liên quan đến đột quỵ nhồi máu não, có gen MTHFR nghiên cứu gần Một số đa hình gen có liên quan đến giảm hoạt tính methylenetetrahydrofolate reductase dẫn đến tượng ứ đọng tăng homocysteine máu tạo thành cục máu đông làm cứng thành mạch, kể trẻ nhỏ Nghiên cứu xác định đa hình hình gen MTHFR tìm hiểu đa hình có liên quan với bệnh lý đột quỵ nhồi máu não, từ đưa khuyến cáo cơng tác dự phịng điều trị bệnh lý nêu Mặt khác, có nhiều phương pháp xác định đa hình gen MTHFR khác nhau, phương pháp có ưu nhược điểm riêng Để có phương pháp đơn giản, có tính khả thi dễ áp dụng thực tiễn cần thiết Từ lí nêu trên, chúng tơi thực đề tài “Nghiên cứu số đặc điểm đa hình gen Methylenetetrahydrofolate reductase (MTHFR) bệnh nhân đột quỵ nhồi máu não”, nhằm hai mục tiêu sau: • Hồn thiện quy trình ARMS-PCR xác định phân tích đa hình gen MTHFR • Phân tích mối liên quan đa hình gen MTHFR với đột quỵ nhồi máu não ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP Đối tượng nghiên cứu • Mẫu bệnh: Mẫu máu tĩnh mạch: 3ml chống đông chống đông ETDA 100 bệnh nhân khám điều trị Khoa Đột quỵ, Bệnh viện Quân Y 103 • Mẫu chứng: 3ml chống đông chống đông ETDA 100 người khỏe mạnh: 50 nam, 50 nữ Phương pháp nghiên cứu * Tách chiết DNA tổng số từ mẫu máu (mẫu chứng mẫu bệnh) thu thập được: tách chiết kít tách chiết DNA từ máu tồn phần Favorgen * Khuếch đại đoạn gen phương pháp ARMS-PCR với trình tự mồi tham khảo theo Cassar cộng [7] Sản phẩm PCR điện di gel agarose 3%, phân tích kết Kết kiểm chứng phương pháp lai ngược kít IVD, StripAssay, hãng Vienna Lab, theo quy trình nhà sản xuất Kết lai nhìn thấy mắt thường * Xử lý số liệu thống kê: Sử dụng phần mềm MedCalc, so sánh tần suất alen nhóm bệnh nhóm chứng phép so sánh tỷ lệ quan sát; xác định mối liên quan đa hình C677T A1298C gen MTHFR bệnh đột quỵ nhồi máu não Odds ratio (kí hiệu: OR) khoảng tin cậy 95% (95%CI) χ2 KẾT QUẢ, BÀN LUẬN Hồn thiện quy trình ARMS-PCR phát đa hình gen MTHFR Qua trình chạy ARMS - PCR bước đầu, chúng tơi có điều chỉnh thành phần phản ứng để từ tối ưu phản ứng nhằm hạn chế tiêu tốn hóa chất đạt kết mong muốn Kỹ thuật ARMS - PCR chuẩn hóa với trình tự mồi bảng 1: TẠP CHÍ NỘI KHOA VIỆT NAM | SỐ 18/20200 61 NGHIÊN CỨU LÂM SÀNG Bảng Thành phần phản ứng ARMS-PCR Thành phần phản ứng MTHFR C677T Master mix MTHFR A1298C 10µl Mồi 677-Common F: 0,4µl 1298-Common F: 0,5µl 677-Common R: 0,4µl 1298-Common R: 0,4µl 677-C: 0,4µl 1298-A: 2µl 677-T: 0,6µl 1298-C: 0,3µl 3,7µl 2,3µl H2O DNA mẫu 4,5µl Tổng 20µl Chu trình nhiệt sau tối ưu bảng 2: Bảng Chu trình nhiệt phản ứng ARMS-PCR MTHFR C677T MTHFR A1298C Số chu kỳ 95,0ºC - phút 95,0ºC - phút chu kỳ 95,0ºC - 30 giây 95ºC - 30 giây 62,6ºC - 30 giây 58,5ºC - 30 giây 72ºC - 40 giây 72ºC - 40 giây 72ºC - 10 phút 72ºC - 10 phút 4ºC - ∞ 35 chu kỳ chu kỳ chu kỳ Hình Kết điện di sản phẩm ARMS- PCR đa hình C677T số mẫu bệnh ((-): Chứng âm; (+): Chứng dương; M: Marker 100 bp; dải lại: Sản phẩm PCR nhóm bệnh nhân) Mẫu 1,4 - Kiểu gen TT; Mẫu 2,5,7 - Kiểu gen CT; Mẫu 3,6,8,9,10 - Kiểu gen CC 62 TẠP CHÍ NỘI KHOA VIỆT NAM | SỐ 18/2020 NGHIÊN CỨU LÂM SÀNG Bệnh nhân mang đa hình C677T dạng dị hợp tử (CT), kết điện di xuất băng có kích thước 273bp 190bp; Bệnh nhân không mang đột biến (CC) xuất băng có kích thước 273bp; Bệnh nhân mang đột biến (TT) xuất băng có kích thước 190bp; Ở mẫu đối chứng dương (+) xuất băng có kích thước 406bp, 273bp 190bp đối chứng âm (H2O) không xuất băng Trên hình hình ảnh minh họa kết điện di số bệnh nhân đột quỵ nhồi máu não Hình Kết điện di sản phẩm ARMS-PCR đa hình A1298C số mẫu bệnh ((-): Chứng âm; (+): Chứng dương; M: Marker 100 bp; dải cịn lại: Sản phẩm PCR nhóm bệnh nhân);Mẫu 1,2,3,4,6,8,9 - Kiểu gen AA; Mẫu 5,7 - Kiểu gen AC; Mẫu 10 - Kiểu gen CC Hình cho thấy, bệnh nhân mang đa hình A1298C dạng dị hợp tử (AC), kết điện di có xuất băng có kích thước 361bp 281bp; bệnh nhân không mang đột biến (AA), xuất băng có kích thước 281bp; bệnh nhân mang đột biến (CC), xuất băng có kích thước 361bp; tất so với đối chứng dương (+) mang băng có kích thước 593bp, 361bp 281bp đối chứng âm (H2O) không xuất băng Sau thực tối ưu nồng độ mồi chu trình nhiệt, sản phẩm khuếch đại gen có băng sản phẩm lên rõ ràng, kích thước sản phẩm khuếch đại đa hình C677T A1298C phù hợp với dự kiến theo thiết kế; tất mẫu tách DNA lên băng sản phẩm khuếch đại gen nội chứng có kích thước 407bp (đối với đa hình C677T) 593 bp (đối với đa hình A1298C) Kết cho thấy băng xuất điện di sản phẩm PCR rõ ràng, kích thước thiết kế khơng xuất băng phụ Như vậy, tối ưu hóa phản ứng PCR đa hình C677T A1298C Hình Kết điện di sản phẩm ARMS-PCR đa hình: số mẫu bệnh (từ 31 đến 35) ((-): Chứng âm; (+): Chứng dương; M: Marker 100 bp; dải cịn lại: Sản phẩm PCR nhóm bệnh nhân) Đa hình C677T: Mẫu 31-Kiểu gen CC; Mẫu 32,34,35: Kiểu gen CT; Mẫu 33 - Kiểu gen TT Đa hình A1298C: Mẫu 31-Kiểu gen CC; Mẫu 32,33,35-Kiểu gen AA; Mẫu 34-Kiểu gen AC TẠP CHÍ NỘI KHOA VIỆT NAM | SỐ 18/20200 63 NGHIÊN CỨU LÂM SÀNG Bảng Kết đối chiếu kiểu gen phương pháp ARMS-PCR lai ngược Mẫu 31 32 33 34 35 Phương pháp ARMS - PCR Lai ngược ARMS - PCR Lai ngược ARMS - PCR Lai ngược ARMS - PCR Lai ngược ARMS - PCR Lai ngược Đa hình Mẫu C677T A1298C CC CC 36 CT AA 37 TT AA 38 CT AC 39 CT AA 40 Phương pháp ARMS - PCR Lai ngược ARMS - PCR Lai ngược ARMS - PCR Lai ngược ARMS - PCR Lai ngược ARMS - PCR Lai ngược Đa hình C677T A1298C TT AA CC AA CT AC CT AC CC AA Hình Kết lai ngược số mẫu bệnh (từ 31 đến 33) Đa hình C677T: Mẫu 31 - Kiểu gen CC; Mẫu 32 Kiểu gen CT; Mẫu 33 - Kiểu gen TT Đa hình A1298C: Mẫu 31 - Kiểu gen CC; Mẫu 32 Kiểu gen AA; Mẫu 33 - Kiểu gen AA Hình Kết lai ngược số mẫu bệnh (34 35) Đa hình C677T: Mẫu 34 - Kiểu gen CT; Mẫu 35 Kiểu gen CT Đa hình A1298C: Mẫu 34 - Kiểu gen AC; Mẫu 35 Kiểu gen AA Khi kiểm chứng quy trình phương pháp lai ngược ngẫu nhiên 10% số mẫu nghiên cứu, chúng tơi thu kết hồn toàn đồng phương pháp ARMS - PCR lai StripAssay Phương pháp lai StripAssay, IVD thương mại hóa áp dụng nhiều sở xét nghiệm phân tử với độ xác cao Điều chứng tỏ quy trình ARMS-PCR hồn 64 TẠP CHÍ NỘI KHOA VIỆT NAM | SỐ 18/2020 NGHIÊN CỨU LÂM SÀNG toàn tối ưu kết đáng tin cậy Xác định phân tích mối liên quan đa hình gen MTHFR với đột quỵ nhồi máu não Tiến hành áp dụng quy trình ARMS-PCR hồn thiện phân tích đa hình C677T A1298C gen MTHFR 100 bệnh nhân đột quỵ nhồi máu não 100 người nhóm đối chứng, chúng tơi thu kết sau: • Đối với đa hình C677T Trong nghiên cứu này, chúng tơi tiến hành khảo sát phân bố kiểu gen, tần số alen phân tích mối liên quan tới đột quỵ nhồi máu não đa hình C677T gen MTHFR 100 bệnh nhân đột quỵ nhồi máu não 100 người khỏe mạnh Bảng Kết phân tích tần số alen đa hình C677T nhóm đột quỵ nhồi máu não C677T Nhóm bệnh (n=100) Nhóm chứng (n=100) (p) Số lượng Tỷ lệ (%) Số lượng Tỷ lệ (%) Alen C 158 79 159 79,5 0,9 Alen T 42 21 41 20,5 0,9 Nhận xét: Kết bảng cho thấy chưa thấy có khác biệt có ý nghĩa thống kê tỷ lệ alen C T nhóm chứng nhóm bệnh với p > 0,05 Bảng Kết phân tích kiểu gen đa hình C677T nhóm đột quỵ nhồi máu não Nhóm bệnh (n=100) Nhóm chứng (n=100) C677T χ2 (p) OR 95% CI Số lượng Tỷ lệ (%) Số lượng Tỷ lệ (%) CC 68 68 66 66 0,76 1,09 0,61 - 1,97 CT 22 22 27 27 0,41 0,76 0,40 - 46 TT 10 10 7 0,45 1,48 0,54 - 4,05 CT+TT 32 32 34 34 0,76 0,91 0,51 - 1,65 Nhận xét: Số liệu Bảng cho thấy, kiểu gen đồng hợp tử đột biến TT với OR cao 1,48, tương ứng với mơ hình lặn Kiểu gen có khả làm tăng nguy gây đột quỵ nhồi máu não (OR = 1,48; 95%CI = 0,54 - 4,05) Song khác biệt chưa có ý nghĩa thống kê Nhận định phù hợp với nghiên cứu Zhenchang Zhang CS, 2017 Nucleotide thứ 677 gen MTHFR thường coi yếu tố nguy bệnh tim mạch Các nghiên cứu trước chứng minh nguy đột quỵ thiếu máu cục với kiểu gen TT đa hình C677T gen MTHFR [14] Đa hình C677T, nằm miền xúc tác làm giảm hoạt độ enzym khoảng 60% TẠP CHÍ NỘI KHOA VIỆT NAM | SỐ 18/20200 65 NGHIÊN CỨU LÂM SÀNG có mặt trạng thái đồng hợp tử Đột biến gây khả chịu nhiệt enzym dẫn đến tăng cholesterol máu, yếu tố nguy bệnh tắc động mạch huyết khối [11] Brattstrom cộng phân tích tổng hợp 13 nghiên cứu kiểm soát trường hợp báo cáo cá thể mang kiểu gen đồng hợp tử TT đa hình C677T gen MTHFR thường có mức homocysteine lúc đói cao cá thể có kiểu gen dị hợp tử CT cá thể bình thường có kiểu gen CC kết luận tính đa hình yếu tố nguy khiêm tốn huyết khối động mạch [6] Một phân tích tổng hợp tương tự Li cộng tìm thấy mối liên quan có ý nghĩa thống kê đột quỵ thiếu máu cục với alen T gen MTHFR, cho thấy đa hình di truyền C667T gen MTHFR có liên quan đáng kể với nguy đột quỵ thiếu máu cục [9] Ngoài ra, nghiên cứu gần Zhou CS quần thể người Trung Quốc quan sát thấy đa hình C677T gen MTHFR ảnh hưởng đến nguy đột quỵ thiếu máu cục làm thay đổi nồng độ homocysteine huyết [15] Theo nghiên cứu Fekih-Mrissa, alen T làm tăng nguy đột quỵ nhồi máu não gấp 1,70 lần (OR=1,70; p=0,02) Các kiểu gen CT (OR=2,10, p = 0,01) kiểu gen (CT + TT) (OR = 2,10; p = 0,01) có nguy gây đột quỵ nhồi máu não gấp 2,10 lần [8] Kết cho thấy tác động đa hình làm tăng nguy theo mơ hình trội Nghĩa có mặt alen T làm tăng nguy đột quỵ nhồi máu não Từ số cơng trình cơng bố cho thấy, kết chưa thống nhất: Chưa thấy mối liên quan [12], có liên quan theo mơ hình lặn [3] hay có liên quan theo mơ hình trội [5], [8] Từ cho thấy cần có nghiên cứu tiếp với cỡ mẫu lớn chủng tộc người khác để có chứng khoa học rõ ràng Kết nghiên cứu cho thấy phát mối liên quan kiểu gen TT đa hình C677T với bệnh đột quỵ nhồi máu não, song chưa có ý nghĩa thống kê Do đó, chúng tơi nhận thấy cần thiết tiếp tục sàng lọc nhiều bệnh nhân đột quỵ nhồi máu não để có kết luận khoa học ảnh hưởng kiểu gen TT đa hình C677T gen MTHFR đột quỵ nhồi máu não người Việt Nam * Đối với đa hình A1298C Trong nghiên cứu này, tiến hành khảo sát phân bố kiểu gen, tần số alen phân tích mối liên quan tới đột quỵ nhồi máu não đa hình A1298C gen MTHFR 100 bệnh nhân đột quỵ nhồi máu não 100 người khỏe mạnh Bảng Kết phân tích tần số alen đa hình A1298C nhóm đột quỵ nhồi máu não A1298C Nhóm bệnh (n=100) Nhóm chứng (n=100) (p) Số lượng Tỷ lệ (%) Số lượng Tỷ lệ (%) Alen A 140 70 144 72 0,66 Alen C 60 30 56 28 0,66 Nhận xét: Kết trình bày bảng phân tích tần số đa hình alen A1298C gen MTHFR đột quỵ nhồi máu não cho thấy chưa thấy khác biệt có ý nghĩa có ý nghĩa thống kê tỷ lệ alen A C nhóm bệnh chứng với p > 0,05 66 TẠP CHÍ NỘI KHOA VIỆT NAM | SỐ 18/2020 ... thể đột quỵ não [2] Đột quỵ nhồi máu não tắc động mạch ni nhiều nguyên nhân thường gặp huyết khối động mạch Nhiều nghiên cứu số gen liên quan đến đột quỵ nhồi máu não, có gen MTHFR nghiên cứu. .. với đa hình C677T Trong nghiên cứu này, tiến hành khảo sát phân bố kiểu gen, tần số alen phân tích mối liên quan tới đột quỵ nhồi máu não đa hình C677T gen MTHFR 100 bệnh nhân đột quỵ nhồi máu não. .. lọc nhiều bệnh nhân đột quỵ nhồi máu não để có kết luận khoa học ảnh hưởng kiểu gen TT đa hình C677T gen MTHFR đột quỵ nhồi máu não người Việt Nam * Đối với đa hình A1298C Trong nghiên cứu này,