Xác định hoạt tính ức chế enzyme α amylase và α glucosidase của cao chiết nước cỏ sữa lá lớn (euphorbia hirta l )

TC.DD & TP 16 (6) - 2020 XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH ỨC CHẾ ENZYME α-amylase VÀ α-glucosidase CỦA CAO CHIẾT NƯỚC CỎ SỮA LÁ LỚN (Euphorbia hirta L.) Nguyễn Mạnh Thắng1, Nguyễn Công Khẩn2, Trương Tuyết Mai3 Lê Thị Hồng Hảo4, Nguyễn Thị Hồng Ngọc4, Trần Hùng Sơn4 Cỏ sữa lớn (Euphorbia hirta L.) dược liệu có tác dụng giảm số đường huyết, sử dụng phòng chữa bệnh đái tháo đường nhờ khả ức chế hoạt tính hai enzyme thuỷ phân tinh bột thể người α-amylase α-glucosidase Hoạt tính ức chế enzyme α-amylase α-glucosidase in vitro cao chiết nước cỏ sữa lớn xác định phương pháp quang phổ hấp thụ phân tử UV – VIS Kết quả: Cao chiết nước cỏ sữa lớn có khả ức chế enzyme α-amylase (IC50 = 967 µg/mL) ức chế enzyme α-glucosidase (IC50 = 53,96 µg/mL) Đồng thời, khả ức chế enzyme α-amylase α-glucosidase có mối quan hệ tương quan với hàm lượng flavonoid tổng cao chiết nước cỏ sữa lớn, với giá trị IC50 tương ứng 17,6 µg/mL 0,982 µg/ml Từ khóa: Cỏ sữa lớn, Đái tháo đường, Flavonoid, Ức chế α-amylase; Ức chế α-glucosidase I ĐẶT VẤN ĐỀ Cỏ sữa lớn (CSLL) có tên khoa học Euphorbia hirta L., thuộc họ thầu dầu (Euphorbiaceae) Thành phần CSLL gồm có: flavonoids; polyphenol; tannins triterpenes phytosterol [1] Theo kinh nghiệm dân gian, CSLL sử dụng để chữa bệnh đường tiêu hóa tiêu chảy, kiết lỵ, viêm ruột, nhiễm khuẩn ruột; bệnh đường hô hấp ho, hen, viêm phế quản; bệnh đường niệu sinh dục bệnh lậu, viêm thận, viêm bể thận Nhiều cơng trình giới chứng minh CSLL phòng chữa bệnh đái tháo đường tác dụng chống oxy hóa chuột đái tháo đường [2, 3, 4] Tuy nhiên, Việt Nam chưa có sở khoa học chứng minh tác dụng cỏ CSLL việc giảm làm giảm số đường huyết chuột bị gây đái tháo đường qui mô thực nghiệm Do vậy, với mục đích nhằm cung cấp thêm chứng khoa học giá trị sử dụng loài thuốc này, chúng tơi tiến hành khảo sát hoạt tính ức chế enzyme α-amylase α-glucosidase cao chiết CSLL Vụ KHCN – Bộ Công thương Email: thangngm@moit.gov.vn Cục KHCN – Bộ Y tế Viện Dinh dưỡng Viện KNATVSTP quốc gia Ngày gửi bài: 1/9/2020 Ngày phản biện đánh giá: 1/102020 Ngày đăng bài: 20/11/2020 99 TC.DD & TP 16 (6) - 2020 II ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng nghiên cứu Sau trực tiếp khảo sát thực tế nguồn cỏ sữa lớn phát triển tự nhiên Bình Dương, tác giả thu hái cỏ sữa lớn tươi (nguyên rễ), rửa vận chuyển Hà Nội để tiến hành thí nghiệm Tác giả thực điều chế cao chiết nước khoa hóa Thực vật thuộc Viện Dược liệu, mơ tả tóm tắt sau: kg dược liệu (độ ẩm %), xay nhỏ, chiết lần nước với tỷ lệ: 12 lít: 10 lít : 10 lít nhiệt độ 90-95oC Thời gian chiết h; 1,5 h h Các dịch chiết lọc sau cách thủy đến cạn Tiếp tục sấy tủ sấy chân không đến cao khô Hiệu suất chiết 19,4 % 2.2 Hóa chất dụng cụ thí nghiệm Hóa chất: Cơ chất Blocked p-nitrophenyl maltoheptaoside (BPNPG7) (Hãng Megazyme); Cơ chất p-nitrophenyl- α-D-glucopyranoside (PNPG) (Sigma); Natri cacbonat (Merck); Tri-natri photphat (Megazyme); Natri đihiđrophotphat (Merck); Axit clohiđric (Merck); Methanol (Merck); Nước cất hai lần Dụng cụ: Ống ly tâm dung tích 15 ml, 50 ml; Bình định mức 100 ml; Micropipet 200 µl, 500 µl, 1000 µl Thiết bị: Máy quang phổ UV-VIS, đặt bước sóng 400 nm; Cuvet thạch anh, cm; Bể ổn nhiệt, 40  0,1oC; Máy đo pH; Máy ly tâm; Cân phân tích, độ xác 0,001 g; Đồng hồ bấm 2.3 Phương pháp nghiên cứu 100 2.3.1 Khảo sát hoạt tính ức chế enzyme α-amylase phòng thí nghiệm [5] - Chuẩn bị mẫu thử: Cân xác khoảng 0.5 g cao cỏ sữa lớn vào ống ly tâm dung tích 50 ml Thêm 30 ml dung mơi chiết (Methanol: Nước = 75 : 25) vào ống ly tâm, lắc nhiệt độ phòng 30 phút Ly tâm tốc độ 6000 vòng/phút phút Gạn dịch chiết vào bình định mức dung tích 100 ml Tiến hành chiết lặp lại tương tự hai lần, sau gộp dịch chiết Định mức đến vạch dung môi chiết (Methanol : Nước = 75 : 25) Lọc, thu lấy dịch Tiến hành pha loãng mẫu thử độ pha loãng khác (5; 10; 20; 50; 100; 200) tiến hành đánh giá hoạt tính ức chế enzyme - Hoạt tính ức chế α-Amylase xác định dựa phương pháp sử dụng chất Blocked p-nitrophenyl maltoheptaoside (BPNPG7) - Cách tiến hành: Cho 200 µl mẫu dịch chiết cao cỏ sữa lớn vào ống nghiệm chứa 200 µl enzyme α-Amylase (1.0 U/ml) đệm photphat 0,1M pH 6,9 Ống nghiệm ủ 40oC phút Thêm 200 µl chất Blocked p-nitrophenyl maltoheptaoside (BPNPG7) Ủ 40oC xác 10 phút Thêm 3,0 mL dung dịch Tri-natri photphat pH 11,0 vào ống nghiệm để dừng phản ứng Đo độ hấp thụ mẫu thử bước sóng 400 nm máy quang phổ UV-VIS Tiến hành song song với mẫu kiểm sốt mẫu trắng Trong mẫu kiểm sốt chứa 200 µl dung dịch đệm thay cho mẫu thử, mẫu trắng chứa 200 µl dung dịch đệm thay cho enzyme - Tính kết quả: TC.DD & TP 16 (6) - 2020 Hoạt tính ức chế enzyme tính theo cơng thức sau: Hoạt tính ức chế (%) = (AControl – [ATest - ABlank])/AControl x 100 Trong đó: AControl: Độ hấp thụ mẫu kiểm soát ATest: Độ hấp thụ mẫu thử ABlank: Độ hấp thụ mẫu trắng - Khả ức chế enzyme xác định thông qua số IC50 IC50 định nghĩa nồng độ (µg/mL) mẫu khảo sát ức chế 50% hoạt tính enzyme 2.3.2 Khảo sát hoạt tính ức chế enzyme α-glucosidase phòng thí nghiệm [6] - Chuẩn bị mẫu thử: Cân xác khoảng 0.5 g cao cỏ sữa lớn vào ống ly tâm dung tích 50 ml Thêm 30 ml dung mơi chiết (Methanol : Nước = 75 : 25) vào ống ly tâm, lắc nhiệt độ phòng 30 phút Ly tâm tốc độ 6000 vòng/phút phút Gạn dịch chiết vào bình định mức dung tích 100 ml Tiến hành chiết lặp lại tương tự hai lần, sau gộp dịch chiết Định mức đến vạch dung môi chiết (Methanol : Nước = 75 : 25) Lọc, thu lấy dịch Tiến hành pha loãng mẫu thử độ pha loãng khác (5; 10; 20; 50; 100; 200) tiến hành đánh giá hoạt tính ức chế enzyme - Hoạt tính ức chế α-glucosidase xác định dựa phương pháp sử dụng chất p-nitrophenyl- α-D-glucopyranoside (PNPG) - Cách tiến hành: Cho 500 µl mẫu dịch chiết cao cỏ sữa lớn vào ống nghiệm chứa 500 µl enzyme α-glucosidase (0,1 U/ml) đệm photphat 0,1M pH 6,8 Ống nghiệm ủ 37oC 10 phút Thêm 500 µl chất p-nitrophenyl- α-D-glucopyranoside (PNPG) 2,5mM Ủ 37oC xác 20 phút Thêm 1,0 ml dung dịch Na2CO3 0,2M vào ống nghiệm để dừng phản ứng Đo độ hấp thụ mẫu thử bước sóng 405 nm máy quang phổ UV-VIS Tiến hành song song với mẫu kiểm soát mẫu trắng Trong mẫu kiểm sốt chứa 500 µL dung dịch đệm thay cho mẫu thử, mẫu trắng chứa 500 µL dung dịch đệm thay cho enzyme - Tính kết quả: Hoạt tính ức chế enzyme tính theo cơng thức sau: Hoạt tính ức chế (%) = (AControl – [ATest - ABlank])/AControl x 100 Trong đó: AControl: Độ hấp thụ mẫu kiểm soát ATest: Độ hấp thụ mẫu thử ABlank: Độ hấp thụ mẫu trắng Khả ức chế enzyme xác định thông qua số IC50 IC50 định nghĩa nồng độ (µg/ml) mẫu khảo sát ức chế 50% hoạt tính enzyme III KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1 Khảo sát hoạt tính ức chế enzyme α-amylase phịng thí nghiệm Tiến hành đánh giá thử hoạt tính mẫu cao CSLL độ pha lỗng khác nhau, kết thu bảng 101 TC.DD & TP 16 (6) - 2020 Bảng Hoạt tính ức chế enzyme α-amylase cao CSLL độ pha lỗng khác C (µg/ml) C-Fla (µg/ml) Abs (Control) 5000 91,00 1,214 1000 18,20 1,214 500 9,10 1,214 250 4,55 1,214 100 1,82 1,214 50 0,91 1,214 Abs (Test) 0,836 0,842 0,833 0,744 0,747 0,750 0,938 0,944 0,948 0,984 0,985 0,978 0,984 0,997 0,990 1,066 1,045 TB 0,837 0,747 0,943 0,982 0,990 1,066 1,086 Abs (Blank) 0,633 0,630 0,629 0,152 0,160 0,152 0,131 0,120 0,135 0,103 0,097 0,107 0,094 0,089 0,097 0,093 0,089 TB % Inh 0,631 83,00 0,155 51,21 0,129 32,89 0,102 27,51 0,093 26,11 0,094 19,93 0,099 Chú thích: C (µg/ml): Nồng độ cao cỏ sữa lớn C-Fla (µg/ml): Nồng độ flavonoid tương ứng cao Abs (Control): Độ hấp thụ quang ống kiểm soát Abs (Test): Độ hấp thụ quang ống thử Abs (Blank): Độ hấp thụ quang ống trắng Inh (%): Hoạt tính ức chế enzyme α-Amylase Hình Hoạt tính ức chế enzyme α-amylase cao CSLL độ pha loãng khác 102 TC.DD & TP 16 (6) - 2020 Các nồng độ khác dịch chiết cao cỏ sữa lớn thêm vào phản ứng enzyme chất Blocked p-nitrophenyl maltoheptaoside (BPNPG7) Đối với mẫu thử khơng pha lỗng, hoạt tính ức chế đạt 83,0%, khi pha lỗng mẫu thử 200 lần, hoạt tính ức chế 19,9% Kết thực nghiệm cho thấy, nồng độ dịch chiết cao lớn, lượng PNP tự tạo thành nhỏ, điều cho thấy khả ức chế enzyme α-Amylase cao Giá trị IC50 xác định: Hàm lượng cao Hàm lượng Flavonoid toàn phần a= b= 0,037 14,580 2,013 14,580 IC50 (µg/ml) 967,016 17,600 y = ax + b Dựa đồ thị biểu diễn phụ thuộc nồng độ mẫu thử hoạt tính ức chế enzyme α-amylase, giá trị IC50 xác định 967 µg/ml 3.2 Khảo sát hoạt tính ức chế enzyme α-glucosidase phịng thí nghiệm Tiến hành đánh giá thử hoạt tính mẫu cao CSLL độ pha lỗng khác Bảng Hoạt tính ức chế enzyme α-glucosidase cao CSLL độ pha lỗng khác C (µg/ml) C-Fla (µg/ml) Abs (Control) 5000 91,00 1,803 1000 18,20 1,803 500 9,10 1,803 250 4,55 1,803 100 1,82 1,803 50 0,91 1,803 25 0,46 1,803 Abs (Test) 2,061 2,004 2,012 0,494 0,501 0,485 0,443 0,452 0,422 0,528 0,517 0,520 0,730 0,714 0,722 0,973 0,955 0,958 1,206 1,194 1,232 TB 2,026 0,493 0,439 0,522 0,722 0,962 1,211 Abs (Blank) 1,924 1,905 1,911 0,407 0,406 0,410 0,212 0,210 0,217 0,085 0,087 0,089 0,058 0,063 0,067 0,038 0,039 0,042 0,023 0,022 0,019 TB % Inh 1,913 93,77 0,408 95,25 0,213 87,47 0,087 75,89 0,063 63,43 0,040 48,84 0,021 34,04 103 TC.DD & TP 16 (6) - 2020 Chú thích: C (µg/ml): C-Fla (µg/ml): Abs (Control): Abs (Test): Abs (Blank): Inh (%): Nồng độ cao cỏ sữa lớn Nồng độ flavonoid tương ứng cao Độ hấp thụ quang ống kiểm soát Độ hấp thụ quang ống thử Độ hấp thụ quang ống trắng Hoạt tính ức chế enzyme α-Glucosidase Hình Hoạt tính ức chế enzyme α-glucosidase cao CSLL độ pha loãng khác Các nồng độ khác dịch chiết cao Cỏ sữa lớn thêm vào phản ứng enzyme chất PNPG Đối với mẫu thử khơng pha lỗng, hoạt tính ức chế đạt 93,8%, khi pha lỗng mẫu thử 200 lần, hoạt tính ức chế cịn 34,0% Kết thực nghiệm cho thấy, nồng độ dịch chiết cao lớn, lượng PNP tự tạo thành nhỏ, điều cho thấy khả ức chế enzyme α-Glucosidase mạnh Hàm lượng cao Hàm lượng Flavonoid toàn phần a= 0,292 16,029 b= 34,258 34,258 IC50 (µg/ml) 53,961 0,982 y = ax + b Dựa đồ thị biểu diễn phụ thuộc nồng độ mẫu thử hoạt tính ức chế enzyme α-glucosidase, giá trị IC50 xác định 53,96 µg/ml 104 TC.DD & TP 16 (6) - 2020 IV KẾT LUẬN IC50 định nghĩa nồng độ (µg/ ml) mẫu thử khảo sát ức chế 50% hoạt tính enzyme, mẫu có hoạt tính ức chế cao giá trị IC50 thấp Dựa đồ thị biểu diễn phụ thuộc nồng độ mẫu thử hoạt tính ức chế, khả ức chế hoạt động enzyme α-amylase và α-glucosidase với giá trị IC50 tương ứng xác định 967 µg/ml 53,96 µg/ml Kết cho thấy khả ức chế enzyme α-amylase α-glucosidase cao chiết CSLL rõ rệt, đặc biệt α-glucosidase Điều mở triển vọng sản xuất sản phẩm từ cỏ sữa lớn Việt Nam TÀI LIỆU THAM KHẢO Hollman PCH and Arts ICW (2000) Flavonols, flavones and flavanols: nature, occurrence and dietary burden J Sci Food Agric 80: 1081-1093 Kumar S, et al (2010) Antihyperglycemic, antihyperlipidemic and antioxy- dant activities of Euphorbia hirta stem extract International Research Journal of Pharmacy 1:150-156 Tamboli P, Patil P, Patil V,, Surana S (2008) Hypoglycemic and anti diabetic effect of ethanolic extract of Euphorbia hirta Linn R.C Patel Institute of Pharmaceutical Education and Research, 1:159 Subramanian SP, Bhuvaneshwari S, Prasath GS (2011) Antidiabetic and antioxidant potentials of Euphorbia hirta leaves extract studied in streptozotocin-induced experimental diabetes in rats Gen Physiol Biophys 30(3):278-285 AOAC (2002) AOAC Official Method 2002.01 Measurement of a-Amylase Activity in White Wheat Flour, Milled Malt, and Microbial Enzyme Preparations Manjur Ali Sheliya cộng (2016) In vitro α-glucosidase and α‑amylase inhibition by aqueous, hydroalcoholic, and alcoholic extract of Euphorbia hirta L Drug Development and Therapeutics 7(1), tr 26-30 Summary DETERMINING INHIBITORY ACTIVITY OF Α-AMYLASE AND Α-GLUCOSIDASE ENZYMES OF EUPHORBIA HIRTA L EXTRACT Euphorbia hirta L (Cỏ sữa lớn – CSLL) is a herbal medicine that could reduce the glycemic index It is used in the prevention and treatment of diabetes thanks to its ability to inhibit the activity of two starch hydrolyzate enzymes in human body, which are α-amylase and α-glucosidase The inhibitory activity of inhibiting enzymes (α-amylase and α-glucosidase) in vitro of CSLL extract was determined by UV-VIS molecular absorption spectroscopy The results of the study showed that extract of Euphorbia hirta L was able to inhibit α-amylase enzyme (IC50 = 967 µg / mL) and inhibit α-glucosidase enzyme (IC50 = 53.96 µg / mL) At the same time, the study results also showed that inhibition of α-amylase and α-glucosidase enzymes was correlated with total Flavonoid content in extract of Euphorbia hirta L., with IC50 value of 17.6 and 0.982 µg / Ml, respectively Keywords: Eucalyptus, Diabetes, Flavonoid, α-amylase inhibitor; α-glucosidase inhibitor 105 ... Inh ( %): Hoạt tính ức chế enzyme α- Amylase Hình Hoạt tính ức chế enzyme α- amylase cao CSLL độ pha loãng khác 102 TC.DD & TP 16 ( 6) - 2020 Các nồng độ khác dịch chiết cao cỏ sữa l? ??n thêm vào phản... quang ống trắng Hoạt tính ức chế enzyme α- Glucosidase Hình Hoạt tính ức chế enzyme α- glucosidase cao CSLL độ pha loãng khác Các nồng độ khác dịch chiết cao Cỏ sữa l? ??n thêm vào phản ứng enzyme chất... Tiến hành đánh giá thử hoạt tính mẫu cao CSLL độ pha loãng khác Bảng Hoạt tính ức chế enzyme α- glucosidase cao CSLL độ pha l? ??ng khác C (µg/ml) C-Fla (µg/ml) Abs (Control) 5000 91,00 1,803 1000