Đánh giá trạng thái methyl hóa của gen socs1 trên mẫu mô ung thư gan

TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC BÁO CÁO THỰC TẬP TỐT NGHIỆP ĐỀ TÀI ĐÁNH GIÁ TRẠNG THÁI METHYL HÓA CỦA GEN SOCS1 TRÊN MẪU MÔ UNG THƯ GAN GVHD: Thạc sĩ Lương Bắc An Thành phố Hồ Chí Minh– Tháng năm 2022 LỜI CẢM ƠN Tám tuần thực tập Trung tâm Y sinh học phân tử hội để em hệ thống lại kiến thức chuyên ngành, đồng thời kết hợp với thực tiễn thông qua kĩ thuật sinh học tử em học từ anh chị nghiên cứu viên trung tâm Tuy có tuần thực tập, qua q trình thực tập, em mở rộng tầm nhìn tiếp thu nhiều kiến thức thực tế, đặc biệt văn hóa làm việc Từ đó, em nhận thấy việc cọ xát thực tế vô quan trọng giúp sinh viên hiểu tảng lý thuyết tiền đề giúp em có kinh nghiệm cho sau làm Trong suốt giời gian thực tập đây, em biết cịn thiếu sót bỡ ngỡ cơng việc thực tập, nhờ bảo tận tình kiên nhẫn anh chị trung tâm giúp em hồn thành tập em với tinh thần học tập tích cực vui vẻ Đầu tiên, em xin gửi lời cảm ơn đặc biệt đến thạc sĩ Lương Bắc An, người hướng dẫn, dạy em đề tài thực tập tốt nghiệp Thầy người dạy em cách giải vấn đề gặp khó khăn, kiên trì, khả tư cách lên kế hoạch giúp em hồn thiện đề tài thực tập tốt nghiệp tốt Bên cạnh đó, thầy ln nhẹ nhàng bảo em mắc lỗi sai Em xin chân thành cảm ơn ban lãnh đạo cô chú, anh chị trung tâm Y sinh học phân tử tiếp nhận nhiệt tình tạo điều kiện thuận lợi cho em tiếp cận thực tế nắm bắt qui trình cơng việc Ngoài ra, em xin cảm trung tâm hỗ trợ thiết bị vật liệu nghiên cứu giúp em hồn thành đề tài tập tốt nghiệp Cuối cùng, em xin gửi lời cảm ơn đến thầy cô khoa công nghệ sinh học đại học Mở thành phố Hồ Chí Minh giảng dạy em suốt thời gian qua giúp em có sở lý thuyết vững để thực đề tài thực tập Em chân thành cảm ơn ban lãnh đạo khoa công nghệ sinh học đại học Mở thành phố Hồ Chí Minh tạo điều kiện thuận lợi cho em thực tập ngoài, nhờ giới thực tập trường với trung tâm Y sinh học phân tử giúp em có hội thực tập DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT U Unmethyl M Methyl SAM S-adenosyl-L-methionine DNMTs DNA methyltranfarase CT Cycle threshold TM Primer Melting Temperature MSP Methylation-Specific Polymerase chain reaction CpG Cystosine phosphate Guanine HBV Hepatitis B Virus HCV Hepatitis C virus DNA Deoxyribo Nucleic Acid Kb Kilo base pair OD Optical Density MSP Methylation-specific polymerase chain reaction WHO Tổ chức Y tế Thế giới NIH Viện Y tế Quốc gia Mỹ PCR Polymerase Chain Reaction HCC Ung thư biểu mô tế bào gan DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1 Chuẩn bị hóa chất để biến đổi bisulfite 20 Bảng 2.2 Trình tự mồi sử dụng nghiên cứu 21 Bảng 2.3 Thành phần phản ứng MSP 21 Bảng 3.1 Nồng độ chất lượng DNA tách chiết từ mẫu mô gan 23 Bảng 3.2 Dữ liệu kết phản ứng MSP 24 Bảng 3.3 Bảng kết phản ứng MSP .27 DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Biểu đồ thể tỷ lệ ca mắc tử vong ung thư chuẩn hóa theo độ tuổi giới 10 bệnh ung thư phổ biến Hình 1.2 Biểu đồ thể tình trạng ung thư Việt Nam năm 2020 .5 Hình 1.3 Quá trình methyl hóa khử methyl DNA .6 Hình 1.4 Cấu trúc DNA Methyltransferases (DNMTs) Hình 1.5 Nucleotide Cytosine bị methyl hóa Hình 1.6 Sự methyl hóa DNA ung thư Hình 2.1 Cơ chế chuyển đổi nucleotide từ cytosine thành uracil với xử lý natri sulfite [20] 14 Hình 2.2 Một chu kì nhiệt PCR .15 Hình 2.3 Cặp mồi methyl bắt cặp với trình tự SOCS1 biến đổi dự đốn phần mềm CLC Main Workbench 16 Hình 2.4 Khảo sát trình tự DNA chuyển đổi bisulfite chương trình MethPrimer 2.0 17 Hình 2.5 Phương pháp điện di gel agarose 18 Hình 2.6 Qui trình thực thí nghiệm 18 Hình 2.7 Chu trình nhiệt cho phản ứng MSP 22 Hình 3.1 Đường cong nóng chảy sản phẩm MSP với cặp mồi unmethyl 25 Hình 3.2 Đường cong biểu diễn khuếch đại sản phẩm MSP với cặp mồi unmethyl 26 Hình 3.3 Đường cong nóng chảy sản phẩm MSP với cặp mồi methyl 26 Hình 3.4.Đường biểu diễn khuếch đại sản phẩm MSP với cặp mồi methyl 26 Hình 3.5 Kết điện di sản phẩm MSP phát methyl hóa gen SOCS1 với cặp mồi methyl 27 Hình 3.6 Kết điện di sản phẩm MSP phát gen SOCS1 khơng bị methyl hóa với cặp mồi unmethyl .27 MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ PHẦN TỔNG QUAN TÀI LIỆU .3 1.1 TỔNG QUAN VỀ UNG THƯ 1.1.1 Định nghĩa ung thư .3 1.1.2 Phân loại ung thư 1.1.3 Tình hình ung thư giới nước ta 1.2 Methyl hóa DNA ung thư gan 1.2.1 Methyl hóa DNA 1.2.2 Methyl hóa DNA tế bào ung thư: .8 1.3 TỔNG QUAN UNG THƯ GAN VÀ METHYL HÓA DNA 1.3.1 Định nghĩa phân loại ung thư gan 1.3.2 Tác nhân gây bệnh ung thư gan 10 1.3.3 Giới thiệu gen SCOS1 methyl hóa gen SOCS1 dẫn đến ung thư gan 10 1.3.4 Tình hình nghiên cứu ung thư gan giới Việt Nam 11 PHẦN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 13 2.1 VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU .13 2.1.1 Công cụ khai thác liệu 13 2.1.2 Đối tượng nghiên cứu .13 2.1.3 Dụng cụ, tr thiết bị hóa chất .13 2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 14 2.2.1 Phương pháp biến đổi bisulfite .14 2.2.2 Phương pháp sinh học phân tử phát methyl hóa gen SOCS1 .14 2.2.3 Phương pháp điện di gel agarose 18 2.3 QUI TRÌNH THỰC HIỆN 18 2.3.1 Qui trình tách chiết DNA cho mẫu mô gan 18 2.3.2 Qui trình xử lí Bisulfite 19 2.3.3 Kỹ thuật MSP phát methyl hóa gen SOCS1 21 2.3.4 Điện di gel Aragrose 22 PHẦN KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 23 3.1 KẾT QUẢ TÁCH CHIẾT DNA .23 3.2 KẾT QUẢ PHẢN ỨNG MSP 24 PHẦN KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 29 4.1 KẾT LUẬN .29 4.2 KIẾN NGHỊ 29 TÀI LIỆU THAM KHẢO 30 ĐẶT VẤN ĐỀ Ung thư gan loại ung thư có tỷ lệ mắc tử vong cao thứ ba giới Theo thống kê Globocan, năm 2020 có đến 906000 trường hợp mắc 830000 người chết ung thư gan [5] Trong đó, số ca mắc tử vong Việt Nam 26418 25272 người Ung thư gan có tiên lượng mức độ đáp ứng điều trị thấp Hiện nay, phương pháp điều trị ung thư gan khuyến nghị phẫu thuật cắt bỏ, ghép gan phá hủy u gan chỗ Theo nghiên cứu khảo sát gần đây, bệnh nhân ung thư gan phát giai đoạn đầu điều trị tốt có tỉ lệ sống lên đến 80% Tuy nhiên, nước phát triển nước ta, bệnh thường chẩn đoán giai đoạn cuối nên việc điều trị thường không đạt kết tốt Điều nhấn mạnh nhu cầu cấp thiết việc nghiên cứu dấu ấn sinh học tiềm chẩn đoán sớm ung thư gan Đã có nhiều nghiên cứu cho thay đổi epigenetic góp phần vào sinh carcinom gan, q trình methyl hóa DNA coi dấu ấn sinh học đầy hứa hẹn [6] Trong năm gần đây, nghiên cứu bệnh ung thư gan bắt nguồn từ tượng biến đổi di truyền epigenetics ngày quan tâm Sự methyl hóa vượt mức đảo CpG vùng promoter thuộc gen ức chế khối biến đổi di truyền liên quan đến epigenetics Sự methyl hóa vượt mức bất thường làm bất hoạt chức gen ức chế khối u dẫn đến tăng sinh vượt mức tế bào sinh u Ở người, gen SOCS1 (Suppressor of Cytokine Signaling 1) mã hóa thành viên thuộc họ STAT-induced STAT inhibitor gen ức chế khối u ung thư gan [7] Trước đây, nghiên cứu Chiar Raggi Pietro Invernizzi cho thấy việc methyl hóa DNA dẫn đến giảm hoạt động phiên mã im lặng gen SOCS1 [8] Vậy nên việc phân tích methyl hóa DNA phương pháp MSP sử dụng phổ biến, đồng thời phân tích nhanh tình trạng methyl hóa đảo CpG thành phương pháp nghiên cứu thường xuyên, thay đổi quan trọng trạng thái methyl hóa gen sinh ung thư, phân tử tín hiệu gen ức chế Thêm vào đó, tình trạng methyl hóa gen ức chế khối u SOCS1 dẫn đến tiên lượng xấu cho bệnh nhân xem marker ung thư gan Hiện nay, việc nghiên cứu trạng thái methyl hóa gen SOCS1 ảnh hưởng đến biểu gen ung thư gan chưa tiến hành Việt Nam Vậy nên việc "Đánh giá trạng thái methyl hóa gen SOCS1 mẫu mô ung thư gan" cần thiết với mục tiêu đánh giá tình trạng methyl hóa gen SOCS1 để xác định ảnh hưởng methyl hóa gen SOCS1 đảo CpG vùng promoter đến hình thành, phát triển khối u kích thước khối u ung thư gan PHẦN TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 TỔNG QUAN VỀ UNG THƯ 1.1.1 Định nghĩa ung thư Ung thư tăng trưởng bất thường tế bào nhiều thay đổi biểu gen dẫn đến cân điều khiển tăng sinh tế bào chết tế bào, cuối phát triển thành quần thể tế bào xâm lấn mơ di đến vị trí khác [3] 1.1.2 Phân loại ung thư Theo viện y tế quốc gia Mỹ (NIH), ung thư phân loại dựa loại mô học: theo loại mô mà ung thư bắt nguồn theo vị trí nguyên phát Tiêu chuẩn phân loại dựa phân loại quốc tế bệnh ung thư, ấn thử (ICD-O-3) Từ hàng trăm loại ung thư chia thành nhóm gồm:  Ung thư biểu mơ (Carcinoma): khối u ác tính có nguồn gốc biểu mô ung thư bắt đầu tế bào biểu mơ tạo thành mơ lốt bề mặt thể Ngoài ra, ung thư biểu mơ cịn chia thành nhóm nhỏ: ung thư biểu mô tế bào đáy ung thư biểu mô tế bào vảy  Sarcoma: loại ung thư có nguồn gốc từ mơ hỗ trợ liên kết xương, gân, sụn, mỡ Độ tuổi mắc ung thư Sarcoma phổ biến người trẻ tuổi người mắc bệnh thường có khối u đau xương  U tủy (Myeloma): loại ung thư bắt nguồn từ tế bào huyết tương tủy xương  Ung thư mô tạo máu thể (Leukemias): loại ung thư tủy xương nơi sản xuất tế bào máu Bệnh thường liên quan đến tăng sinh mức tế bào bạch cầu chưa trưởng thành Các tế bào bạch cầu chưa trưởng thành không hoạt động chế bình thường, bệnh nhân thường dễ bị nhiễm trùng ảnh hưởng đến tế bào hồng cầu, ngồi cịn gây khó đơng máu mệt mỏi thiếu máu 2.2.3 Phương pháp điện di gel agarose Nguyên tắc: Điện di gel agarose phương pháp thường sử dụng để tách protein, DNA RNA Các phân tử nucleic acid có kích thước khác phân tách hỗ trợ điện trường phân tử mang điện tích âm di chuyển phía cực dương Dòng di chuyển xác định trọng lượng phân tử phân tử có trọng lượng nhỏ di chuyển nhanh phân tử lớn [19] Hình 2.5 Phương pháp điện di gel agarose [21] 2.3 QUI TRÌNH THỰC HIỆN Hình 2.6 Qui trình thực thí nghiệm 2.3.1 Qui trình tách chiết DNA cho mẫu mô gan  Bước 1: Xử lí mẫu: + 15 mẫu mơ gan rã đơng cắt nhỏ với trọng lượng khoảng 5-25 mg đựng 1,5 ml tube Rửa mẫu với 1000 µl PBS 18 + Loại bỏ PBS dùng dao nghiền nhỏ mẫu DNA từ mẫu mô gan tiến hành tách chiết kit QIAmp® Fast DNA Tissue Kit  Bước 2: Tiến hành tách DNA gen hóa chất QIAamp® Fast DNA Tissue Kit: + Đối với 1.5 ml tube chứa mẫu gan, thêm vào dung dịch đệm enzyme gồm: 200 μl AVE, 40 μl VXL, μl DX Reagent, 20 μl proteinase K, μl RNase A + Đồng hóa mẫu với hóa chất 10 phút + Ủ mẫu nhiệt độ 56C, 1000rpm, + Sau mẫu hoàn toàn tan, thêm 265 MVL vortex + Hút hoàn toàn hỗn hợp vào cột QIAamp Mini Spin ly tâm phút Loại bỏ dịch lọc thay vỏ cột + Thêm 500 μl Buffer AW1 vào cột spin, ly tâm phút thay vỏ cột + Thêm 500 μl Buffer AW2 vào spin column, ly tâm phút thay vỏ cột + Ly tâm phút di chuyển cột spin vào 1.5 ml microcentrifuge tube mới, loại bỏ vỏ cột + Thêm 50 μl ATE trực tiếp vào cột spin membrane, ủ phút nhiệt độ phòng ly tâm phút để thu nhận DNA + Kiểm tra độ tinh nồng độ DNA có mẫu  Bước 3: Xác định nồng độ DNA sau tách chiết máy quang phổ định lượng acid nuleic/protein Nanodrop 2000 dựa hấp thụ ánh sáng tử ngoại với bước sóng 260 nm base purine pyrimidine, độ hấp thụ tỷ lệ thuận với nồng độ DNA 2.3.2 Qui trình xử lí Bisulfite Sử dụng kit biến đổi bisulfite EZ DNA Methylation Zymo Research để biến đổi DNA: 19 Bảng 2.1 Chuẩn bị hóa chất để biến đổi bisulfite Cách tiến hành Bước Thêm 750 µl water 210 µl M-Dilution Buffer vào ống CT Conversion Reagent Trộn hỗn hợp, nhiệt độ phòng Bước Thêm 24 ml of 100% ethanol vào ml M-Wash Buffer Các bước thực biến đổi bisulfite:  Bước 1: 250 ng DNA sử dụng cho phản ứng bisulfite (bổ sung H2O cho đủ 45 μl), thêm vào tube µl M-Dilution Buffer trộn  Bước 2: Ủ mẫu 37 ° C 15 phút, bổ sung 100 µl CT Conversion chuẩn bị vào mẫu  Bước 3: Ủ mẫu bóng tối với nhiệt độ 50° C, sau 16 mẫu tiếp tục ủ 0- 4° C 10 phút , hết thời gian ủ mẫu bảo đá để sử dụng cho bước  Bước 4: Chuẩn bị cho mẫu cột Zymo-Spin™ IC đặt vào vỏ cột tương ứng bổ sung 400 µl đệm M-Binding Buffer vào cột Zymo-Spin™ IC  Bước 5: Nạp mẫu ủ vào cột Zymo-Spin ™ IC có chứa M-Binding Buffer Đóng nắp trộn vài lần pipet  Bước 6: Ly tâm tốc độ tối đa (> 10.000 x g) 30 giây loại bỏ dịch  Bước 7: Thêm 100 µl M-Wash Buffer vào cột Ly tâm tốc độ tối đa 30 giây  Bước 8: Thêm 200 µl M-Desulphonation Buffer vào cột để yên nhiệt độ phòng (20-30° C) 20 phút Sau ủ, ly tâm với tốc độ tối đa 30 giây  Bước 9: Thêm 200 µl M-Wash Buffer vào cột Ly tâm tốc độ tối đa 30 giây Tiếp tục thêm 200 µl M-Wash Buffer ly tâm 30 giây  Bước 10: Đặt cột vào 1,5 ml microcentrifuge tube Thêm 10 µl M-Elution Buffer trực tiếp vào cột ly tâm 30 giây tốc độ tối đa để rửa giải DNA 20  Bước 11: Loại bỏ cột thu nhận DNA chuyển đổi bisulfite chứa 1,5 ml microcentrifuge tube Bảo quản DNA -20 ℃ đẻ sử dụng cho phản ứng MSP 2.3.3 Kỹ thuật MSP phát methyl hóa gen SOCS1 Tiến hành đặt phản ứng MSP với hai cặp mồi sau tham khảo từ nghiên cứu Loraine cộng [10]: Bảng 2.2 Trình tự mồi sử dụng nghiên cứu Mồi xi Mồi ngược Kí hiệu mồi Trình tự mồi (5’→3’) M-SOCS1-F ATGGTTTCGGGATTTACGAGT UM-SOCS1-F AGATGGTTTTGGGATTTATGAGT M- SOCS1-R TAACCACGATACGCTAACGAC UM-SOCS1-R AACCACAATACACTAACAACA Chú thích M: mồi methy, U: mồi unmethyl Phản ứng MSP tiến hành với thể tích 15 µl mồi SOCS1, thành phần khác với chu kì nhiệt phản ứng MSP mơ tả theo bảng sau: Bảng 2.3 Thành phần phản ứng MSP Nồng độ phản ứng Thể tích (µl) SBRY buffer (2X) 1X 7,5 Mồi xi F (10 µM) 250 nM 0,375 Mồi ngược R (10 µM) 250 nM 0,375 Thành phần H2 O 4,45 DNA ROX (50X) 1X 0,3 21 Hình 2.7 Chu trình nhiệt cho phản ứng MSP 2.3.4 Điện di gel Aragrose Sau chạy xong phản ứng MSR, sản phẩm khuếch đại điện di gel agarose (2%) hiệu điện 100V thời gian 30 phút Bản gel sau điện di đọc kết hệ thống UV geldoc-Biorad:  Bước 1: Lắp điện di  Bước 2: Chuẩn bị 2% gel agarose cách cân g agarose cho vào erlen thêm 100 ml TBE (0,5X) vào erlen, lắc  Bước 3: Sử dụng lò vi sóng đun hỗn hợp đến thấy agarose tan hồn tồn đổ vào khn, đợi gel khơ rút lược  Bước 4: Lần lượt trộn µl sản phẩm MS-MSP với µl gel red nạp vào giếng, µl gene ruler nạp vào giếng 22 PHẦN KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 KẾT QUẢ TÁCH CHIẾT DNA Độ tinh DNA tách chiết từ mẫu mô gan kiểm tra thơng qua đo mật độ quang học bước sóng 260 nm, 280 nm Kết thể bảng Bảng 3.1 Nồng độ chất lượng DNA tách chiết từ mẫu mô gan STT Mẫu Nồng độ DNA tinh (ng/μl) A260/280 63T 1125 1,88 63P 218 1,86 63D 236 1,90 64T 1388 1,88 64P 1205 1,86 64D 48 2,01 65T 937 1,87 65P 531 1,86 65D 326 1,87 10 66T 211 1,90 11 66P 874 1,89 12 66D 260 1,88 13 67T 250 1,87 14 67P 936 1,85 15 67D 247 1,90 Nhận xét: Giá trị tỉ số OD 260/280 đạt giá trị khoảng 1,8 - cho thấy độ tinh DNA đạt yêu cầu Với kết trên, cho thấy 15 mẫu DNA đảm bảo độ tinh 23 3.2 KẾT QUẢ PHẢN ỨNG MSP Sau tách chiết DNA biến đổi bisulfite, tiến hành thực phản ứng MSP để khảo sát mức độ methyl hóa mẫu mơ gan với cặp mồi đặc hiệu methyl unmethyl Kết sản phẩm khuếch đại với cặp mồi methyl có kích thước 200 bp Phân tích kết thu cho thấy phản ứng MSP với cặp mồi methyl sản phẩm phụ Tiến hành phân tích giá trị đỉnh nóng chảy sản phẩm khuếch đại, giá trị đỉnh nóng chảy sản phẩm đặc hiệu phản ứng MSP với cặp mồi unmethyl 80,414 C (hình 3.1), , sản phẩm đặc hiệu phản ứng MSP với cặp mồi methyl có đỉnh nhiệt độ nóng chảy 83.316 C (hình 3.3) ❖ Nhận xét: Kết 15 mẫu đặt phản ứng MSP ghi nhận nhiệt độ bắt cặp cho cặp mồi methyl khảo sát không tốt Nguyên nhân dẫn đến kết giá trị CT TM mẫu khác Ngoài ra, mẫu chứng âm khuếch đại cặp mồi unmethyl cho kết dương tính giả nhiệt độ nóng chảy có đỉnh khác với mẫu dương tính kết điện di cho thấy có kích thước khác với mẫu cịn lại (hình 3.6) Từ kết điện di hai cặp mồi cho kết kích thước sản phẩm gần với kích thước dự đốn kết điện di băng sản phẩm bị mờ Hiện tượng methyl SOCS1 xảy ba trường hợp: (1) Mẫu khơng methyl MSP khuếch đại trình tự SOCS1 khơng methyl hóa; (2) Mẫu methyl hồn tồn MSP khuếch đại trình tự SOCS1 methyl hóa (3) Mẫu methyl hóa khơng hồn tồn MSP khuếch đại đồng thời trình tự SOCS1 methyl hóa trình tự SOCS1 khơng methyl hóa Trong nghiên cứu, mẫu sử dụng mẫu bệnh phẩm mổ DNA tách chiết từ tế bào ung thư có DNA từ tế bào lành khơng mang gen SOCS1 methyl hóa Dẫn đến kết điện di sản phẩm MSP với cặp mồi unmethyl xuất băng SOCS1 khơng methyl hóa Bảng 3.2 Dữ liệu kết phản ứng MSP Mẫu TM(UM) CT (UM) TM (M) CT (M) FIF-HCMC-63D 80,248 25,049 83,469 28,052 FIF-HCMC-63P 80,441 24,265 83,976 29,135 24 FIF-HCMC-63T 80,281 24,359 86,426 24,316 FIF-HCMC-64D 80,248 27,817 83,469 26,316 FIF-HCMC-64P 80,441 25,162 83,669 27,52 FIF-HCMC-64T 80,281 24,391 86,580 29,15 FIF-HCMC-65D 80,248 25,381 83,316 28,619 FIF-HCMC-65P 80,441 24,866 84,130 29,476 FIF-HCMC-65T 80,127 23,999 81,510 33,596 FIF-HCMC-66D 80,26 23,767 83,623 29,942 FIF-HCMC-66P 80,414 24,102 86,281 26,653 FIF-HCMC-66T 80,567 24,669 85,965 24,954 FIF-HCMC-67D 80,260 24,321 83,623 27,609 FIF-HCMC-67P 80,260 24,339 82,747 32,702 FIF-HCMC-67T 80,260 25,747 86,426 24,838 Chứng âm 73,354 34,044 74,121 Chú giải TM: Nhiệt độ nóng chảy CT: Chu kì ngưỡng Hình 3.1 Đường cong nóng chảy sản phẩm MSP với cặp mồi unmethyl 25 Hình 3.2 Đường cong biểu diễn khuếch đại sản phẩm MSP với cặp mồi unmethyl Hình 3.3 Đường cong nóng chảy sản phẩm MSP với cặp mồi methyl Hình 3.4.Đường biểu diễn khuếch đại sản phẩm MSP với cặp mồi methyl 26 Hình 3.5 Kết điện di sản phẩm MSP phát methyl hóa gen SOCS1 với cặp mồi methyl Hình 3.6 Kết điện di sản phẩm MSP phát gen SOCS1 không bị methyl hóa với cặp mồi unmethyl Từ kết hình điện di sản phẩm MSP, tiến hành ghi nhận kết phương pháp MSP 15 mẫu mô gan: Bảng 3.3 Bảng kết phản ứng MSP Ký hiệu mẫu Methyl Unmethyl Mô khối u D + + Mô cận u P + + 27 Mô khối u T + + Chứng âm (-) + + Chú thích: (-): mẫu đối chứng âm, +: xuất vạch, -: khơng có vạch Tổng kết phần kết thực nghiệm MSP thực 15 mẫu ghi nhận 100% (15/15) mẫu bị methyl hóa Theo kết MSP thu được, sản phẩm điện di phát methyl hóa SOCS1 cho kích thước giống với kích thước sản phẩm với cặp mồi methyl hóa nhóm nghiên cứu Loraine Kay D Cabral Ngồi ra, diện trình tự SOCS1 methyl hóa phát mồi methyl unmethyl có đỉnh nhiệt độ nóng chảy khác với kết nhóm Loraine Kay D Cabral cộng (84,5 ◦C 78,5 ◦C ) Trong nghiên cứu Loraine Kay D Cabral cộng sự, tỷ lệ methyl hóa mơ u cao (44%), mô cận u (33%) mô xa khối u (24%) Tỷ lệ gen SOCS1 khơng bị methyl hóa mơ xa khối u cao (62%) mô cận u (53%) mơ u (33%) Trong đó, tỉ lệ methyl hóa khảo sát cho thấy mơ u cao nhất, mô cận u mô xa u giống với kết Loraine Kay D Cabral cộng sự, nhiên tỉ lệ gen SOCS1 khơng bị methyl hóa mơ u cao so với mô cận u mô xa khối u khác với kết Loraine Kay D Cabral cộng [15] 28 PHẦN KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1 KẾT LUẬN Cả hai cặp mồi methyl unmethyl cho kết quả, CpG khảo sát bị methyl hóa khơng hồn tồn Kỹ thuật MSP ứng dụng thành công việc phát methyl gen SOCS1 mẫu bệnh ung thư gan 4.2 KIẾN NGHỊ Từ kết trên, nên tiến hành MSP giải trình tự để đánh giá tốt trạng thái methyl hóa gen SOCS1 ung thư gan Cần nghiên cứu khảo sát methyl hóa gen SOCS1 với cỡ mẫu lớn Sự methyl hóa gen SOCS1 sử dụng dấu hiệu sinh học chẩn đoán ung thư gan 29 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt: Lê Huyền Ái Thúy, Phạm Minh Duy, Lao Đức Thuận, Trương Kim Phượng, NXB Đại học Quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh, tr 131-134 Võ Thị Thuý Quỳnh, Trần Thị Phương Thảo, Nguyễn Việt Phương, Phạm Văn Dũng, Nguyễn Lĩnh Toàn, & Hoàng Văn Tổng (2021) Đánh giá mức độ biểu gen SOCS1 bệnh nhân ung thư biểu mô tế bào gan liên quan đến nhiễm virus viêm gan B Bản B Tạp Chí Khoa học Và Cơng nghệ Việt Nam, 63(12) Nguyễn Thị Hồng Gấm, Nguyễn Thị Hải Yến, Nguyễn Văn Đơ, Nguyễn Thanh Bình (2019) Ứng dụng MSP đặc hiệu methyl hóa phát phát methyl hóa gen DAPK RASSF1A mẫu máu bệnh nhân ung thư vòm mũi họng TNU Journal of Science and Technology, 194(01), tr 75-80 Nguyễn Thị Hà, Lê Thành Đô, Ha Thi Nguyen, Thanh Do Le (2019) Thực trạng ung thư Việt Nam: Sự tương quan với nước Đơng Nam Á Tạp chí Khoa học cơng nghệ đại học Duy Tân, 01(32), tr 03-09 Tài liệu tiếng Anh: Sung, H., Ferlay, J., Siegel, R L., Laversanne, M., Soerjomataram, I., Jemal, A., & Bray, F (2021) Global cancer statistics 2020: Globocan estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries CA: a cancer journal for clinicians, 71(3), 209-249 Bai, Y., Tong, W., Xie, F., Zhu, L., Wu, H., Shi, R., & Zhang, Y (2021) DNA methylation biomarkers for diagnosis of primary liver cancer and distinguishing hepatocellular carcinoma from intrahepatic cholangiocarcinoma Aging (Albany NY), 13(13) Fitzpatrick, D R., & Wilson, C B (2003) Methylation and demethylation in the regulation of genes, cells, and responses in the immune system Clinical immunology, 109(1), 37-45 Raggi, C., & Invernizzi, P (2013) Methylation and liver cancer Clinics and research in hepatology and gastroenterology, 37(6), 564-571 30 Ruddon, R W (2007) Cancer biology Oxford University Press, 297-300 10 Wang, S., & Wu, W (2018) DNA methylation alterations in human cancers In Epigenetics in Human Disease Academic Press, 109-139 11 Zakhari, S (2013) Alcohol metabolism and epigenetics changes Alcohol research: current reviews, 35(1), 12 Fraga, M F., & Esteller, M (2005) Towards the human cancer epigenome: a first draft of histone modifications Cell Cycle, 4(10), 1377-1381 13 Grandjean, V., Yaman, R., Cuzin, F., & Rassoulzadegan, M (2007) Inheritance of an epigenetic mark: the CpG DNA methyltransferase is required for de novo establishment of a complex pattern of non-CpG methylation PLoS One, 2(11) 14 Cabral, L K D., Reyes, P A C., Crocè, L S., Tiribelli, C., & Sukowati, C H (2021) The Relevance of SOCS1 Methylation and Epigenetic Therapy in Diverse Cell Populations of Hepatocellular Carcinoma Diagnostics, 11(10) 15 Galm, O., Yoshikawa, H., Esteller, M., Osieka, R., & Herman, J G (2003) SOCS1, a negative regulator of cytokine signaling, is frequently silenced by methylation in multiple myeloma Blood, The Journal of the American Society of Hematology, 101(7), 2784-2788 16 Zhang, C., Li, J., Huang, T., Duan, S., Dai, D., Jiang, D., & Wang, K (2016) Meta-analysis of DNA methylation biomarkers in hepatocellular carcinoma Oncotarget, 7(49) 17 Li, Y., & Tollefsbol, T O (2011) DNA methylation detection: bisulfite genomic sequencing analysis In Epigenetics Protocols Humana Press, 11-21 18 Ku, J L., Jeon, Y K., & Park, J G (2011) Methylation-specific MSP In Epigenetics Protocols Humana Press, 23-32 19 Yılmaz, M., Ozic, C., & Gok, İ (2012) Principles of nucleic acid separation by agarose gel electrophoresis Gel Electrophoresis–Principles and Basics, 4, 33 20 Grandjean, V., Yaman, R., Cuzin, F., & Rassoulzadegan, M (2007) Inheritance of an epigenetic mark: the CpG DNA methyltransferase is required for de novo establishment of a complex pattern of non-CpG methylation PLoS One, 2(11) 31 21 Lou, C., Yang, B., Gao, Y T., Wang, Y J., Nie, F H., Yuan, Q., & Du, Z (2008) Aberrant methylation of multiple genes and its clinical implication in hepatocellular carcinoma Chinese Journal of Oncology, 30(11), 831-836 22 Yoshikawa, H., Matsubara, K., Qian, G S., Jackson, P., Groopman, J D., Manning, J E., & Herman, J G (2001) SOCS-1, a negative regulator of the JAK/STAT pathway, is silenced by methylation in human hepatocellular carcinoma and shows growth-suppression activity Nature genetics, 28(1), 2935 32 ... để đánh giá tốt trạng thái methyl hóa gen SOCS1 ung thư gan Cần nghiên cứu khảo sát methyl hóa gen SOCS1 với cỡ mẫu lớn Sự methyl hóa gen SOCS1 sử dụng dấu hiệu sinh học chẩn đoán ung thư gan. .. thái methyl hóa gen SOCS1 ảnh hưởng đến biểu gen ung thư gan chưa tiến hành Việt Nam Vậy nên việc "Đánh giá trạng thái methyl hóa gen SOCS1 mẫu mơ ung thư gan" cần thiết với mục tiêu đánh giá. .. nghĩa phân loại ung thư gan Ung thư gan khối u ban đầu hình thành mơ gan Các loại ung thư gan khác tồn tùy theo loại tế bào ung thư Ung thư biểu mô tế bào gan loại ung thư gan thư? ??ng gặp nhất,