PowerPoint Presentation Sử dụng enzyme laccase tái tổ hợp để khử màu và khử độc thuốc nhuộm vải GVHD T S Đỗ Biên Cương Tổng quan 1 Laccase Là 1 enzyme có tính OXH mạnh, phân hủy các hợp chất thơm đa v[.]
Sử dụng enzyme laccase tái tổ hợp để khử màu khử độc thuốc nhuộm vải GVHD: T.S Đỗ Biên Cương Tổng quan Laccase - Là enzyme có tính OXH mạnh, phân hủy hợp chất thơm đa vòng Nguồn thu: nấm mốc , thực vật, vi khuẩn, trùng Liên quan đến q trình phân hủy tổng hợp lignin Ứng dụng nhiều lĩnh vực: tẩy trắng bột giấy tẩy màu thuốc nhuộm vải,chế biến thực phẩm Ngành thuốc nhuộm dệt vải - Có 1000 loại thuốc nhuộm tổng hợp - Do sai số hệ thống, 90% thuốc nhuộm lại nhà máy nước thải thải ngồi mơi trường - Sử dụng quy trình: xử lí nhiễm + thiếu khí Þ Khơng hiệu quả: tạo hợp chất gây ung thư Þ Laccase quan trọng ngành dệt Đặc biệt loại laccse từ nấm vi khuẩn Sử dụng chủng vi khuẩn sinh laccase tái tổ hợp khử màu khử độc cho thuốc nhuộm(Streptomyces ipomoeae CECT 3341 ) Nội dung 1.Sản xuất enzyme laccase tái tổ hợp ( SilA) - chủng : Streptomyces ipomoeae CECT 3341 - Mơi trường ni cấy: LB bổ sung Kanamycin 50µg/ml - Dùng Ecoli BL21 biến nạp với plasmid pET28 - Ly tâm phá vỡ tế bào thu dịch - Tinh eyme sắc kí cột HisTrap HP + Cột: đệm phosphat 20 mM+ NaCl 5M+ imidazole 10 mM + Mẫu trộn với thể tích tương đương pha động + Protein rửa giải dung dịch đệm có bổ sung imidazole 0,75 M - Xác định hoạt tính SilA: đo độ OXH mM 2,2 ′-azino-bis (3 azino-bis (3ethylbenzothiazoline-6-sulphonic acid) (ABTS) đệm axetat 50 mM (pH 4,5) mM 2, 6-dimethoxyphenol (DMP) dung dịch đệm phosphat 100 mM (pH 8) Thử nghiệm tính ổn định Enzyme - Độ ổn định nhiệt: xác định huỳnh quang + Kích thích: 280 nm 296 nm + Phát xạ : 340 nm - Độ ổn định hóa học: Kết hợp tăng nồng độ GdnHCl ( tạo protein)+ đo huỳnh quang - Thực hiện: + ủ enzyme 95oC dung dịch đệm phosphate 10mM, pH=7 + Ở thời gian cố định, phần mẫu lấy để hoạt động 25oC + Xác định hoạt tính phương pháp Bradford dung abumin làm mẫu chuẩn ABTS làm chất - Tính ổn định nhiệt động học: laccase enzyme ổn định nhiệt vừa phải với Tm = 60± oC - Tính ổn định hóa học: Cấu trúc bậc ba mở khoảng GdnHCl 2,2 M - SilA điều chỉnh nhiệt - Và giá trị bán hủy 95 oC kéo dài 1,3 h Chuẩn độ OXH-K - Điều kiện: 25oC, pH 7, kỵ khí Hỗn hợp gồm: E chất trung gian Các chất trung gian: + dimethyl- p -phenylenediamine 10 µM + natri ferrocyanide + monocarboxylic acid ferrocene + 1,1′-azino-bis (3 đicacboxylic axit ferrocene + Fe (II / III) tris- (1,10-phenantrolin) Chất OXH: Kali hexachloroiridat Chất khử : natri dithionite Dụng cụ đo: máy đo quang phổ với độ quang phổ khả kiến 300700nm - Đo : 600 nm Laccase Vi khuẩn có khả OXH-K thấp so với laccase nấm Khảo sát thấy điện khử màu tốt 337mV Khử màu thuốc nhuộm Khử màu thuốc nhuộm Sử dụng kết hợp với sản phẩm chất trung gian để tăng khả OXH E: + 3,5-dimethoxy-4-hydroxyacetophenone (acetosyringone, AS) + 3,5-dimethoxy-4-hydroxybenzaldehyde (syringaldehyde, SA) + methyl 4-hydroxy-3,5 -dimethoxybenzoate (methyl syringate, MeS) Cách thực hiện: - Kết hợp : Laccase 0,4 U/ml + thuốc nhuộm 50 µM ủ photphat 50 mM - Điều kiện: pH = , T= 35oC, t= 24h - Đo độ hấp thu máy đo quang phổ Shimadzu UV- 160A Kiểm tra điều kiện khử màu loại thuốc nhuộm: Acid Orange 63 ( AO63) tartrazine (TART) - Sử dụng thêm chất trung gian : 0,1 0,5 mM - Nhiệt độ 35oC 60 oC - Bước sóng: 418 425 nm Đánh giá độc tính thuốc nhuộm - Phương thức thực hiện: Xét nghiệm Pseudokirchneriella subcapitata, theo hướng dẫn OECD số 201 - Vật liệu: tảo inoula ( nuôi cấy t =24oC, chiếu sáng), mật độ 106 tế bào/ml - Phương pháp: + Cấy mẫu thuốc nhuộm pha loãng vào huyền phù tảo + thực 72h, V= 25ml + Kiểm tra phát triển tảo : sử dụng giá trị độ hấp thụ liên quan đến đường cong chuẩn Microbiotests BE cung cấp Kết tính khử màu khử độc Decolorization percentages of the dyes y the laccase SilA in the presence or absence of the three mediators Kết tính khử màu khử độc Phân tích thống kê khử màu tartrazine (TART) Axit Orange 63 (AO63) liên quan đến nhiệt độ (35 60 ° C), loại chất trung gian (acetosyringone, AS; syringaldehyde, SA; methyl syringate, MeS) nồng độ chất trung gian (0,1 0,5 mM) Kết tính khử màu khử độc Toxicity of the degradation products of AO63 (A) and TART (B) before (grey bars) and after 24 h of SilA-mediator (0.1 mM acetosyringone, AS or methyl syringate, MeS) system treatment at 35 °C (white bars) and 60 °C (striped bars) Kết luận - Các loại thuốc nhuộm có pH trung tính axit=> dùng laccase vi khuẩn ( pH kiềm) - Với loại thuốc nhuộm khác khả khử màu khử động SilA khác - Cần kết hợp thêm chất trung gian có mức oxy hóa khử cao / hợp chất phenolic - Mức độ khử màu cao phạm vi pH trung tính đến kiềm nhiệt độ cao (60 ° C) thuận lợi cho xử lí nước thải có chứa thuốc nhuộm tránh gây biến tính enzyme( ảnh hưởng đến tính thương mại Ngành CNSH) tính ổn định với nhiệt độ cao, pH kiềm tính kháng muối cao, khả tăng cường hoạt động oxy hóa thơng qua việc sử dụng chất trung gian tự nhiên, làm cho enzyme trở thành ứng cử viên tốt cho trình xử lý sinh học ứng dụng Tài liệu tham khảo ... tẩy màu thuốc nhuộm vải, chế biến thực phẩm Ngành thuốc nhuộm dệt vải - Có 1000 loại thuốc nhuộm tổng hợp - Do sai số hệ thống, 90% thuốc nhuộm lại nhà máy nước thải thải ngồi mơi trường - Sử dụng. .. hiệu quả: tạo hợp chất gây ung thư Þ Laccase quan trọng ngành dệt Đặc biệt loại laccse từ nấm vi khuẩn Sử dụng chủng vi khuẩn sinh laccase tái tổ hợp khử màu khử độc cho thuốc nhuộm( Streptomyces... với laccase nấm Khảo sát thấy điện khử màu tốt 337mV Khử màu thuốc nhuộm Khử màu thuốc nhuộm Sử dụng kết hợp với sản phẩm chất trung gian để tăng khả OXH E: + 3,5-dimethoxy-4-hydroxyacetophenone