Ứng dụng của enzyme ache trong chế tạo cảm biến sinh học phát hiện chất độc cơ phốt pho

Ứng dụng enzyme AChE chế tạo cảm biến sinh học phát chất độc phốt MỤC LỤC Chất độc phốt Enzyme AChE & AChE biosensor Quy trình thu nhận enzyme Cố định enzyme biosensor Chất độc phốt - Nguồn gốc: hóa chất bảo vệ thực vật - Độc tính cao, tan nước - Ảnh hưởng xấu tới sức khỏe người → Cần xác định dư lượng chất phốt hữu nông sản, thực phẩm ⁻ Phương pháp xác định: sắc ký khí, khối phổ,… Nhược điểm: chuẩn bị mẫu công phu, thiết bị đắt tiền,… → Giải pháp: Biosensor Enzyme AChE: 2.1 Khái niệm: - Thuộc nhóm enzyme xúc tác phản ứng thủy phân ester carboxyl - Kí hiệu phân loại: E.C 3.1.1.7 - Phản ứng đặc hiệu: thủy phân acetylcholine thành choline acetate - Vai trò quan trọng dẫn truyền xung thần kinh từ màng trước màng sau synap 2.2 Vai trò phát chất độc phốt : - Enzyme AChE xúc tác phản ứng thủy phân acetylcholine: ACh + H2O - AChE Choline + acetic acid Khi có mặt chất độc phốt hữu (chất ức chế đặc hiệu), phức chất trung gian enzyme chất ức chế tạo thành: AChE + chất ức chế AChE-ức chế + ACh(tự do) → Xác định độ giảm hoạt độ AChE xác định mức độ nhiễm độc hợp chất phốt hữu 2.3 AChE biosensor: Nguyên tắc hoạt động: - Tín hiệu tạo tỷ lệ nghịch với nồng độ hợp chất phốt - Khơng có chất ức chế → acetylcholine chuyển thành thiocholine acetic Có chất ức chế → nồng độ thiocholine giảm khơng có thiocholine tạo thành - Dưới tác dụng dòng điện, thiocholine bị oxi hóa - Dịng điện hóa tạo thành tỷ lệ nghịch với nồng độ chất độc mẫu 2.3 AChE biosensor: Quy trình thu nhận enzyme: VD: Thu nhận Enzyme AChE tái tổ hợp [1] 3.1 Lựa chọn nguồn thu: Nhược điểm nguồn tự nhiên: hiệu suất thấp, không chủ động nguồn nguyên liệu,… → Sản xuất enzyme dạng tái tổ hợp hệ thống khác E coli, nấm men, tế bào côn trùng,… phổ biến E.coli → E.coli BL21 chứa AChE tái tổ hợp 3.2 Sinh tổng hợp enzyme: - Lên men chìm mơi trường LB có bổ sung kháng sinh - Khi OD600 đạt 0,6 – 0,8, bổ sung thêm chất cảm ứng IPTG 3.3 Tách tinh chế enzyme: - Yêu cầu độ tinh sạch: enzyme kỹ thuật - Phương pháp tinh thường sử dụng: sắc ký lực - Quy trình: Thu sinh khối tế bào Thu dịch chiết tế bào Cô dịch chiết tế bào Chạy sắc ký Thử hoạt tính phân đoạn thu Kiểm tra độ 3.3 Tách tinh chế enzyme: ⮚ Thu sinh khối tế bào: Ly tâm thu tủa → Hòa tan tủa đệm phosphate ⮚ Thu dịch chiết tế bào: Siêu âm phá tế bào → Ly tâm thu dịch chiết tế bào ⮚ Cô dịch chiết tế bào: Lọc qua màng lọc 30 kDa 10 ⮚ Sắc ký lực qua cột His-bind: ❑ Ngun tắc: • Protein đích có đuôi His-tag giữ lại cột nhờ liên kết Histidine với ion Ni2+ gắn gel agarose (Ni-NTA-Agarose) • Protein đích rửa chiết điều kiện pH thấp đệm sử dụng Imidazol ❑ Các bước tiến hành: Chuẩn bị mẫu → Hấp phụ → Rửa loại tạp chất đệm phosphate 0,02M; imidazole 100mM → Rửa giải thu protein đệm phosphate 0,02M; imidazole 250mM 11 ⮚ Sắc ký lực qua cột His-bind: 12 ⮚ Thử hoạt tính phân đoạn thu được: - Phương pháp Ellman cộng (1961) - Nguyên tắc: • Acetylthiocholine + H2O • Thiocholine + DTNB AChE Thiocholine + Acetate 5-thio-2-nitro benzoic acid + 2-nitrobenzoate-5-mercaptothiocholine (không màu) (màu vàng 412nm) ⮚ Kiểm tra độ SDS PAGE thẩm tách miễn dịch 13 KẾT QUẢ - Hoạt độ riêng 200U/mgpr - Cho băng với khối lượng phân tử khoảng 68 kDa SDS PAGE → quy trình tinh hiệu Điện di SDS – PAGE kiểm tra độ tinh enzyme AChE tái tổ hợp [1] 14 3.4 Tính chất enzyme thu được: - pH tối ưu: 7,4 - Nhiệt độ tối ưu: 30◦C Ảnh hưởng pH, nhiệt độ tới hoạt độ AChE tái tổ hợp [1] 15 3.4 Tính chất enzyme thu được: Ảnh hưởng số chất độc tới hoạt độ AChE tái tổ hợp [1] 16 Cố định enzyme biosensor: 17 Tài liệu tham khảo [1] Nghiêm Ngọc Hoa (2018), Nghiên cứu biểu enzyme acetylcholinesterase Escherichia coli phục vụ mục đích phân tích phát chất độc phốt pho, Luận án thạc sĩ 18 Tài liệu tham khảo 19 CẢM ƠN THẦY VÀ CÁC BẠN ĐÃ LẮNG NGHE 20 ... phát chất độc phốt : - Enzyme AChE xúc tác phản ứng thủy phân acetylcholine: ACh + H2O - AChE Choline + acetic acid Khi có mặt chất độc phốt hữu (chất ức chế đặc hiệu), phức chất trung gian enzyme. ..MỤC LỤC Chất độc phốt Enzyme AChE & AChE biosensor Quy trình thu nhận enzyme Cố định enzyme biosensor Chất độc phốt - Nguồn gốc: hóa chất bảo vệ thực vật - Độc tính cao, tan nước... chất trung gian enzyme chất ức chế tạo thành: AChE + chất ức chế AChE- ức chế + ACh(tự do) → Xác định độ giảm hoạt độ AChE xác định mức độ nhiễm độc hợp chất phốt hữu 2.3 AChE biosensor: Nguyên