Đánh giá đa dạng di truyền và tính gây bệnh của nấm corynespora cassiicola trên cây cao su (hevea brasiliensis) ở việt nam

BỘGIÁODỤCVÀĐÀOTẠO TRƯỜNGĐẠIHỌCNƠNGLÂMTP.HỒCHÍMINH ************************* NGUYỄNĐƠNHIỆU ĐÁNHGIÁ ĐADẠNG DI TRUYỀNVÀTÍNHGÂYBỆNH CỦA NẤMCorynespora cassiicolaTRÊN CÂY CAO SU(Heveabrasiliensis) ỞVIỆTNAM Chuyên ngành:Bảovệ thựcvật Mã số :9.62.01.12 LUẬNÁNTIẾNSĨNƠNGNGHIỆP HướngdẫnKhoahọc: TS.NGUYỄNANHNGHĨAPGS.TS NGUYỄNBẢOQUỐC Thành phố Hồ ChíMinh,năm2020 NGUYỄNĐƠNHIỆU ĐÁNHGIÁ ĐADẠNG DI TRUYỀNVÀTÍNHGÂYBỆNH CỦA NẤMCorynespora cassiicolaTRÊN CÂY CAO SU(Heveabrasiliensis) ỞVIỆTNAM Chuyên ngành:Bảovệ thựcvật Mã số :9.62.01.12 LUẬNÁNTIẾNSĨNÔNGNGHIỆP HướngdẫnKhoahọc: TS.NGUYỄNANHNGHĨAPGS.T S.NGUYỄNBẢOQUỐC Thành phố Hồ ChíMinh,năm2020 LỜICẢMƠN Tơixinbàytỏlịngbiếtơnchânthànhđến: TS Nguyễn Anh Nghĩa, PGS.TS Nguyễn Bảo Quốc tận tình hướng dẫnvà truyền đạt cho tơi nhiều kiến thức q báu suốt q trình thực đề tài,giúptơihồnthànhluậnánnày; TS Võ Thị Thu Oanh, TS Phạm Đức Tồn, TS Phan Cơng Kiên lnquantâm,gópýxâydựngtrongsuốtqtrìnhthựchiệnđềtài; Ban Giám hiệu, Thầy Cơ Khoa Nơng học Phịng Sau Đại học TrườngĐại học Nơng Lâm TP Hồ Chí Minh tạo điều kiện thuận lợi cho tơi qtrìnhhọctập; Ban lãnh đạo Viện Nghiên cứu Cao su Việt Nam Phịng Nghiên cứu BảovệThựcvậtđãtạođiềukiệnthuậnlợichotơithamgiakhóahọcvàthựchiệnluậnánnghiêncứunày; ThS Nguyễn Thị Kim Uyên, KS Nguyễn Ngọc Mai, KS Bùi Thanh Tuấn,ThS Nguyễn Thị Thanh Trang (Phòng Nghiên cứu Bảo vệ Thực Vật), KS HuỳnhĐức Định (Phòng Nghiên cứu Di truyềnGiống) -Viện Nghiên cứu Cao suV i ệ t Namđãtíchcựcgiúpđỡtrongviệcthựchiệncácthínghiệmthuộcđềtài; Các bạn đồng nghiệp gia đình động viên khuyến khích, giúp đỡ tơitrongsuốtthờigianhọctậptạiTrường Tácgiả luận án NguyễnĐơnHiệu LỜICAMĐOAN Tơi cam đoan cơng trình nghiên cứu thực sựhướng dẫn TS Nguyễn Anh Nghĩa PGS.TS Nguyễn Bảo Quốc ViệnNghiên cứu Cao su Việt Nam Trường Đại học Nông Lâm TP Hồ Chí Minh Sốliệu, kết nêu luận án trung thực công bố tạp chí, hộinghịkhoahọcbởitácgiả,nhómtácgiảvàchưađượcaicơngbố Tácgiả luận án NguyễnĐơnHiệu TĨMTẮT NGUYỄN ĐƠN HIỆU– “Đánh giá đa dạng di truyền tính gây bệnhcủanấmCorynespora cassiicolatrên câycao su (Hevea brasiliensis) ViệtNam” Chuyênngành:BảovệThựcvật Mã số: 9.62.01.12.TrườngĐạihọcNơngLâmTP.HồChíMinh, 2016– 2020 Nghiên cứu thực nhằm đánh giá đa dạng di truyền 76 mẫunấmC cassiicolaphân lập từ 16 dịng vơ tính (DVT) cao su tính gây bệnh 6mẫu nấm đại diện cho phân nhóm di truyền vùng địa lý khác ViệtNam Đặc điểm hình thái tản nấm 76 mẫu phân lập (MPL)C cassiicolacó sựbiến thiên màu sắc, cấu trúc sợi nấm tốc độ sinh trưởng Một số MPL tạo sắctố hồng môi trường dinh dưỡng PSA Hình thái bào tử có biến thiên lớnvề hìnhdạngvàkích thướckhơngchỉgiữacácMPL mà cịn trongcùng mộtMPL Trìnht ự v ù n g r D N A ITS(ribosomal DNAinternaltranscribed space r) 76MPLC.cassiicolacócùng kíchthước559bpvàgiống nhaungoạitrừ2nucleotide khác biệt phát vị trí 135 vị trí 474 Trình tự vùng rDNA-ITS phân chia 76 MPL thành nhóm di truyền riêng biệt, nhóm gồm 38 MPLcó cytosine (C) nucleotide vị trí 135, nhóm gồm 35 MPL có thymine (T) cùngvịtrívànhóm3gồm3MPLcóadenine(A)ởvịtrí474 Mối quan hệ di truyền 76 MPL nấmC.c a s s i i c o l a phân tích dựatrênchỉthịphântửSRAP(SequenceRelatedAmplifiedPolymorphism).Bamươi (30) cặp primer SRAP sử dụng để khuếch đại DNA vùng ORFs (OpenReading Frames), thu 223 băng DNA với tỷ lệ đa hình 93,3% Cây phânnhóm di truyền tạo từ phân tích UPGMA dựa hệ số Nei Li’s chia 76MPLthành2nhómchính.Nhóm1baogồm54MPL,trongđónhómphụ1Acó51MPL nhóm phụ1 B có MPL Nhóm bao gồm 22 MPL, nhóm p h ụ 2Acó20MPLvànhómphụ2Bcó2MPL.GiátrịBootstrapchonhóm1và2lần lượt 61% 100% Hệ số tương đồng nhóm 67% Sự phân nhómtheo vùng địa lý mức cao kiểu di truyền MPL nấmC cassiicoladườngnhưphụthuộcvàovùngđịalýhơnlànguồngốckýchủ(DVTcaosu) Sử dụng kỹ thuật PCR khuếch đại gen mã hóa độc tố cassiicolin (genCas)với cặp primer chuyên biệt phát 40/76 MPL nấm có diện củagenCas2và 36 mẫu nấm cịn lại khơng phát genCas, xếp vào nhómCas0.Dựavào genCas,76 MPLđược phân chia thành 2nhómditruyền riêngbiệt Bảy mươi sáu (76) MPLC cassiicolanghiên cứu khảo sát khả nănggây bệnh hai dịng vơ tính cao su, RRIV (DVT mẫn cảm) PB 260 (DVTchống chịu bệnh) phương pháp cắt rời Tất 76 MPL lây nhiễmlá DVT cao su Mức độ lây nhiễm MPL DVT RRIV nghiêmtrọnghơnrõrệtsovớitrênDVTPB260,tươngứngchỉsốbệnh(CSB)biếnthi êntừ25,7%đến100%sovới9,7%đến76,7% Sáu (6) MPL đại diện cho phân nhóm di truyền vùng địa lý khác nhaugồm CoryLK02, CoryDP03, CoryDN39, CoryKT04, CoryBT17, CorySL02 đượcchọn để đánh giá mức độ gây bệnh 12 DVT cao su.Trong điều kiện phịng thínghiệm, tất MPL gây bệnh nặng DVT RRIV (CSB trung bình94,6%),gâybệnhnặngtrênRRIV1,RRIV106,RRIV206,RRIV114,PB260,PB 255, RRIV 209 (CSB trung bình 52,5% – 75,6%), gây bệnh trung bình RRIV109,RRIV124,PB312,RRIV230(CSBtrungbình31,7%– 44,8%).Trongđiều kiện nhà lưới, tất MPL gây bệnh nặng DVT RRIV (CSB trungbình 95,4%), trung bình RRIV 106, RRIV (CSB trung bình 32,6% – 33,7%),gâybệnhnhẹtrêncácDVTkhác(CSBtrungbình6,4%–19,2%) SUMMARY NGUYEND O N H I E U – “ Geneticd i v e r s i t y a n d p a t h o g e n i c i t y o f t h e f u n g u s Corynesporacassiicolaonr u b b e r tree (Heveabrasiliensis)inVietnam” Major:PlantProtection Code: 9.62.01.12NongLamUniversity HoChiMinhCity,2016–2020 Thestudywascarriedouttoassessthegeneticdiversityamong76C.cassiicolaisola tes collected from 16 rubber clones and pathogenicity of isolatesrepresentdifferent distinctgeneticgroups andgeographicregionsinVietnam The morphological characteristics of 76C cassiicolaisolates vary in colour,hyphae texture and growth speed Some isolates produced pink pigment Conidialmorphology was found greatly different in shape and size not only among isolatesbutalsowithineachisolate DNA sequences confirmed the DNA fragments generated from 76 isolateswere equal in length with 559 bp and the rDNA-ITS regions of all these isolateswere identical with the exception two different nucleotide detected at base pair 135thand474th The rDNA-ITS sequences segregated the 76 studied isolates into threedistinct genetic groups Group 1, includes 38 isolates, contained cytosin (C); group2, includes 35 isolates, contained thymin (T) at base pair 135; and group 3, includes3isolates,containedadenine(A)atbasepair474 The genetic relationship of76 isolates ofC.c a s s i i c o l a was analysed usingthe SRAP (Sequence-Related Amplified Polymorphism) markers Thirty (30) SRAPprimerswereusedto amplify DNAinORFs(OpenReadingFrames).ThetotalDNA band obtained was 223 in which 93.3% were polymorphic A dendrogramproducedfromUPGMAanalysisba sed onNei andLi’s coefficientdi videdthe76 C cassiicolaisolates into two main clusters Cluster one included 54 fungal isolatesofwhich51and3wereobservedinsubgroup1Aand1Brespectively.There were 22C.cassiicolaisolatesbelongingtoclustertwowithsubgroups2Aand2Bconsisted of20 and fungal isolates, respectively Bootstrap values for groups oneandtwowere 61%and100%.Similaritycoefficientbetween thetwomaingroupsat 67% SRAP markers divided the studied isolates into two distinct groups whichcorrelated withgeographicalenvironmentrather than hostsource(rubber clone) Casgenes were amplified using PCR technique with specific primer pairsin order to detect cassiicolin encoding genes in 76C cassiicola Cassiicolin proteinisoformCas2encoding gene was detected in 40 out of 76 isolates, meanwhile noCasgenes was detected in the remaining 36 isolates, which were subsequentlyclassified toCas0group Based onCasgen, the 76C cassiicolaisolates have beendividedintotwodistinctgeneticgroups A total of 76C cassiicolaisolates were tested their pathogenicity on tworubberclones,RRIV4(susceptibleclone)andPB260(tolerantclone),usingdetached leaf assay.All of the 76 isolates could infect leavesof 2r u b b e r c l o n e s The infection levels of 76 isolates on rubber clone RRIV were markedly moreserioust h a n t h a t o n r u b b e r c l o n e P B w i t h p e r c e n t d i s e a s e i n t e n s i t y ( P D I ) rangingfrom25.7%to100%incomparisonto9.7%to76.7%,respec tively Sixofthesestudiedisolatesrepresentingdifferentgeneticgroupsandgeographicre gionsincludingCoryLK02,CoryDP03,CoryDN39,CoryKT04,CoryBT17, CorySL02 wereselected toassess their pathogenicity on 12 rubberclones In laboratory condition, all of six isolates caused very severe disease onRRIV (average PDI = 94.6%), severe disease on RRIV 1, RRIV 106, RRIV 206,RRIV 114, PB 260, PB 255, RRIV 209 with average PDI values ranging from52.5% to 75.6%, moderate disease on RRIV 109, RRIV 124, PB 312, RRIV 230with average PDI ranging from 31.7% to 44.8% In greenhouse condition, all of sixisolates caused very severe disease on RRIV (average PDI = 95.4%), moderatedisease on RRIV 106, RRIV with average PDI values ranging from 32.6% andmildonotherswithaveragePDIvaluesrangingfrom6.4%to19.2% to33.7%, MỤC LỤC Lờicảmơn…………………………………………………………………… i Lờicamđoan………………………………………………………………… ii Tómtắt……………………………………………………………………… iii Mụclục vii Danhsách chữviếttắt xi Danhsáchcácbảng xiii Danhsáchcáchình xiv MỞĐẦU 1.Tínhcấpthiếtcủađềtài 2.Ý nghĩakhoa học vàthựctiễn đề tài……………………………… 2.1.Ýnghĩakhoa học……………………………………………… …… 2.2.Ýnghĩa thựctiễn…………………………………………… ………… 3.Mụctiêunghiên cứucủa đề tài 4.Thờigian,đốitượngvà phạm vinghiên cứu 4.1.Thờigiannghiên cứu………………………………… ……………… 4.2.Đốitượngnghiên cứu………………………………………… ……… 4.3.Phạmvinghiên cứu………………………………………….……… 5.Nhữngđónggópmớicủaluận án………………………………………… Chương1 TỔNGQUAN TÀILIỆU 1.1.Sơlược tìnhhìnhsản xuấtvàvịtrícây cao suởViệtNam………… 1.2.BệnhrụngláCorynesporatrêncâycaosu…….………… …… …… 1.2.1.LịchsửvàtáchạicủabệnhrụngláCorynesporatạimộtsốquốcgia trênthế giới…….………………………………………………………… 1.2.2.L ị c h s v t c h i c ủ a b ệ n h r ụ n g C o r y n e s p o r a t r ê n c â y c a o s u ViệtNam……………………………………………… ………………… 1.2.3.Triệu chứngbệnh rụnglá Corynespora câycao su…… … …… 1.3.ĐặcđiểmcủanấmCorynesporacassiicolagâybệnhtrêncâycaosuvà mộtsốcâykýchủkhác 10 1.3.1 Vịtríphân loạivàđặc điểmhìnhthái nấmCorynesporacassiicola 10 1.3.2 Phânbố kýchủcủa nấmCorynesporacassiicola 12 1.4 ĐặcđiểmphátsinhvàpháttriểncủanấmCorynesporacassiicolatrên câycaosu…………………………………………………………………… 14 1.5 Đặcđiểms i n h l ý , s ự x â m n h i ễ m , l â y l a n v l u t n c ủ a n ấ m Corynespora cassiicola………………………………………………… 15 1.6 Nghiêncứuvềđadạng ditruyềncủanấmCorynesporacassiicolabằng chỉthịphântử……………………………………………………………… 16 1.6.1 Sựđadạngd i truyềnởmứcđộp h â n t c ủ a n ấ m C o r y n e s p o r a cass iicola 16 1.6.2 Cácchỉthịphântửđượcsửdụngtrongnghiêncứuđadạngditruyền nấmCorynesporacassiicola 18 1.6.2.1 ChỉthịphântửRFLP(RestrictionFragmentLengthPolymorphism) 19 1.6.2.2 ChỉthịphântửRAPD(RandomAmplified Polymorphic DNA) 19 1.6.2.3 Chỉthị phântửISSR(InterSimpleSequenceRepeat) 20 1.6.2.4 Phân tíchtrìnhtựvùngrDNA-ITS .21 1.6.2.5 ChỉthịphântửSRAP(Sequence-RelatedAmplified Polymorphism) 24 1.7 Độc tốcassiicolincủa nấmCorynespora cassiicola 25 1.7.1.Vaitròcủa độctốcassiicolin 25 1.7.2 Cấutrúcvàđặctínhcủađộctốcassiicolin 26 1.7.3 Mốiliênhệgiữacassiicolin,tínhgâybệnhcủan ấ m Corynesporacassiicolavà tínhkhángcủa ký chủ 27 1.8 Nghiênc ứ u v ề đ a d n g dit r u y ề n g e n m ã h ó a đ ộ c t ố c a s s i i c o l i n ( g e n Cas) củanấmCorynesporacassiicola… ………… …… ……………… 28 1.9 Nghiên cứuvề tínhgâybệnh nấmCorynespora cassiicola 30 1.10 Khái lượcvề tươngtác kýsinh–kýchủ trongbệnh 31 1.10.1.Thuyết “gen forgen”………… …………………………………… 31 1.10.2.Tínhkhángcủakýchủ 32 1.10.3.Phảnứngsiêu nhạycảm(HR:hypersensitivityresponse) 34 ...NGUYỄNĐƠNHIỆU ĐÁNHGIÁ ĐADẠNG DI TRUYỀNVÀTÍNHGÂYBỆNH CỦA NẤMCorynespora cassiicolaTRÊN CÂY CAO SU( Heveabrasiliensis) ỞVIỆTNAM Chuyên ngành:Bảovệ thựcvật Mã số :9.62.01.12... PhảnứngPCRnhậndiện genCas 50 2.4.5 Khảosáttínhgâybệnhcủa76MPLnấmCorynesporacassiicolatrênDVT cao suRRIV 4(mẫn cảmbệnh )và PB260(chốngchịu bệnh) … …… 51 2.4.6 Đánhgiátínhgâybệnhcủa6MPLnấmCorynesporacassiicolađại... chốngchịubệnh).Từnhữngcơsởnêutrên,đềtài? ?Đánh giá đa dạng di truyền tínhgây bệnh nấmCorynespora cassiicolatrên cao su (Hevea brasiliensis) ởViệtNam”đãđượcthựchiện ÝNGHĨAKHOAHỌCVÀ THỰCTIỄNCỦA ĐỀTÀI 2.1 Ýnghĩakhoahọc