17 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC TCNCYH 157 (9) 2022 Tác giả liên hệ Nguyễn Thị Hà Trường Đại học Y Hà Nội Email nguyenha1994 hmu@gmail com Ngày nhận 21/07/2022 Ngày được chấp nhận 26/08/2022 I ĐẶT VẤN ĐỀ[.]
TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC ĐỊNH DANH ĐẾN CẤP ĐỘ LOÀI MỘT SỐ CHỦNG MYCOBACTERIA BẰNG PHƯƠNG PHÁP GIẢI TRÌNH TỰ GEN Nguyễn Thị Hà1,, Nguyễn Văn Hưng2 Trần Minh Châu1, Phạm Hồng Nhung1 Trường Đại học Y Hà Nội Bệnh viện Phổi Trung ương Mặc dù có liên quan gần gũi mặt di truyền, lồi chi Mycobacterium lại có khác biệt lớn hình thái, tính chất, phân bố khả gây bệnh cho người Thử nghiệm sắc ký miễn dịch định danh vi khuẩn lao (TBc ID hãng Becton Dickinson, Sparks, MD) không phát số chủng Mycobacterium tuberculosis complex (MTBC) không phân biệt đến loài chủng non-tuberculous mycobacteria (NTM) Phương pháp phân tích trình tự đoạn gen đích (16S rRNA, gyrB, rpoB, hsp65 ITS) chủng mycobacteria có thử nghiệm TBc ID âm tính khơng khắc phục nhược điểm nêu mà cho phép định danh đến lồi chủng NTM khơng phổ biến Trong số 105 chủng có TBc ID âm tính quan sát 56 chủng (53,3%) MTBC 49 chủng (46,7%) NTM Trong số 56 chủng MTBC, chiếm đa số lồi M tuberculosis, có chủng thuộc loài M bovis Trong số 49 chủng NTM, chiếm đa số phức hợp M abscessus/ M chelonae tiếp đến phức hợp M avium 13 lồi NTM khác chiếm tỉ lệ nhỏ Từ khóa: Mycobacteria, TBc ID, giải trình tự I ĐẶT VẤN ĐỀ Thử nghiệm sắc ký miễn dịch định danh vi 4/12 loài MTBC M tuberculosis, khuẩn lao (TBc ID hãng Becton Dickinson, M africanum, M bovis (một số chủng) M Sparks, MD) phát phức hợp MTBC dựa microti không phân biệt loài vào khả tiết kháng nguyên MPT64 đặc với dẫn đến việc khó phân biệt hiệu mơi trường ni cấy TBc ID có giá trường hợp lao lây truyền từ người thành rẻ, thời gian thực nhanh chóng, sang người trường hợp lây truyền từ công cụ hữu hiệu phòng xét nghiệm động vật sang người lao, nhiều nghiên cứu đánh giá có độ Cùng chi Mycobacterium, loài NTM nhạy, độ đặc hiệu cao (97,9%; 99,5%) Tuy nhắc đến nhiều nghiên cứu gần nhiên, bối cảnh Việt Nam nằm nước phát triển, gióng lên hồi chng nhóm 30 nước có gánh nặng bệnh lao cao cảnh báo phổ biến nhóm lồi giới, tỉ lệ nhỏ chủng MTBC không phát Hầu hết nghiên cứu đưa báo cáo thông qua thử nghiệm TBc ID trở gia tăng tỉ lệ mắc bệnh liên quan thành số có ý nghĩa đáng kể nước ta đến NTM vòng thập kỷ qua.2 Việc định Thêm vào đó, thử nghiệm TBc ID phát danh đến loài chủng NTM không yêu cầu bắt buộc chẩn đốn, mà cịn cung Tác giả liên hệ: Nguyễn Thị Hà cấp nhiều thông tin phục vụ trình điều trị Trường Đại học Y Hà Nội tiên lượng cho người bệnh Tuy nhiên, phân Email: nguyenha1994.hmu@gmail.com loại phức tạp mycobacteria với 200 loài Ngày nhận: 21/07/2022 lồi, với liên quan chặt Ngày chấp nhận: 26/08/2022 chẽ mặt di truyền loài, TCNCYH 157 (9) - 2022 17 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC phân tích trình tự đoạn gen đích khơng đủ để định danh đến lồi NTM chưa có chiến lược cụ thể tối ưu việc giải trình tự nhiều gen house-keeping (thường gọi gen giữ nhà), phương pháp phân tích đồng thời trình tự gen 16S rRNA, gyrB, rpoB, hsp65, ITS áp dụng thường xuyên Do vậy, nhằm phân biệt MTBC NTM nhóm chủng mycobacteria âm tính II ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP Đối tượng: 105 chủng Mycobacterium nuôi cấy MGIT dương tính có TBc ID âm tính phân lập Bệnh viện Phổi Trung ương từ tháng 8/2019 đến tháng 8/2020 Phương pháp nghiên cứu Thiết kế nghiên cứu: Nghiên cứu mô tả cắt ngang Tiêu chuẩn lựa chọn: Các chủng với thử nghiệm TBc ID, với xác định Mycobacterium có ni cấy MGIT dương tính, tỉ lệ loài thuộc MTBC (lây truyền từ người nhuộm soi cặn có AFB làm thử nghiệm TBc sang người, từ động vật sang người) ID âm tính tỷ lệ lồi NTM Việt Nam, Tiêu chuẩn loại trừ: Các chủng phân lập từ tiến hành nghiên cứu "Định danh đến loài một bệnh nhân, chủng từ bệnh nhân số chủng mycobacteria phương pháp giải nghi NTM cấy mẫu bệnh phẩm đờm trình tự gen" với mục tiêu: Định danh đến Kỹ thuật sử dụng nghiên cứu: Quy loài chủng Mycobacterium ni cấy MGIT trình tách chiết DNA sử dụng kít LytestarTM dương tính có TBc ID âm nghi ngờ MTBC; TB/NTM PCR kit 3.0 (CE-IVD) Phản ứng PCR Định danh đến loài chủng Mycobacterium thực kit BioFACTTM H-Star ni cấy MGIT dương tính nghi ngờ NTM Taq DNA Polymerase (BioFACT) Bảng Các cặp mồi sử dụng nghiên cứu Gen đích Trình tự mồi 16S rRNA 5’GAG AGT TTG ATC CTG GCT CAG 16S rRNA 5’TGC ACA CAG GCC ACA AGG GA ITS 5’GAT TGG GAC GAA GTC GTA AC ITS 5’AGC CTC CCA CGT CCT TCA TC hsp65 5’ACCAACGATGGTGTGTCCAT hsp65 5’CTCGTCGAACCGCATACCCT gyrB 5’TCG GAC GCG TAT GCG ATA TC gyrB 5’ACA TAC AGT TCG GAC TTG CG rpoB 5’GGCAAGGTCACCCCGAAGGG rpoB 5’AGCGGCTGCTGGGTGATCATC Giải trình tự phương pháp Sanger với kit BigDye® Terminatorv3.1 máy ABI 3500 Genetic Analyzer Quy trình giải trình tự thực Viện Cơng nghệ Sinh học trực 18 Kích thước Ta ~ 1000bp3 68 ~ 400bp4 57 441bp5 60 1020bp6 72 723bp7 64 thuộc Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam Sử dụng phần mềm BioEdit so sánh với sở liệu GenBank Xử lý phân tích số liệu phần mềm TCNCYH 157 (9) - 2022 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC SPSS 20, thuật tốn tính so sánh tỉ lệ Đạo đức nghiên cứu: Nghiên cứu cho phép Ban lãnh đạo Bệnh viện Phổi Trung ương Nghiên cứu tiến hành chủng vi khuẩn phân lập từ bệnh phẩm bệnh nhân, không can thiệp hay tác động đến người bệnh Đảm bảo thơng tin cá nhân bệnh nhân giữ bí mật, thông tin hồ sơ phục vụ mục đích nghiên cứu III KẾT QUẢ Hình Ví dụ đoạn trình tự kết BLAST GenBank Trong 105 chủng (Hình 2) có 56 chủng (53,3%) MTBC 49 chủng NTM (46,7%) Định danh đến lồi phát 2/12 lồi nằm nhóm MTBC 15/ >200 lồi nằm nhóm NTM Đối với MTBC, số 56 chủng có 55 chủng (98,2%) M tuberculosis thuộc nhóm lây truyền từ người sang người, chủng (1,8%) M bovis thuộc nhóm lây truyền từ động vật sang người Đối với NTM, số 49 chủng phân lập có 30 chủng (61,2%) thuộc nhóm mycobacteria phát triển nhanh (RGM) 19 chủng (38,8%) thuộc nhóm danh đến lồi cho thấy phức hợp M abscessus/ mycobacteria phát triển chậm (SGM) Định lại (55,1%) khơng có bệnh liên quan đến NTM TCNCYH 157 (9) - 2022 M chelonae có tần suất xuất cao với 27 chủng (55,1%), tiếp đến phức hợp MAC với chủng (16,3%) Các loài khác phân lập với tỉ lệ nhỏ Khi xem xét mối liên quan với bệnh gây NTM 49 chủng phân lập 49 bệnh nhân khác Trong số bệnh nhân có 19 người (38,8%) chẩn đoán mắc bệnh phổi NTM (NTM PD) theo tiêu chuẩn ATS 2007 người (6,1%) mắc bệnh da, niêm mạc NTM, 27 người cịn 19 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC M bovis 1,8% NTM 46,7% MTBC 53,3% SGM 38,8% RGM 61,2% M.tuberculosis 98,2% NTM PD 38,8% Khác 55,1% Da, mơ mềm 6,1% Hình Tỉ lệ nhóm lồi phân lập Bảng Các loài NTM phân lập Tên loài/ phức hợp Gây bệnh Tổng M abscessus/ M chelonae 10 (46,0%) 27 (55,2%) MAC (22,5%) (16,4%) M angelicum (0%) (2,0%) M farcinogenes (0%) (2,0%) M fortuitum (0%) (4,1%) M interjectrum (4,5%) (4,1%) M kansasii (13,5%) (6,1%) M marinum (4,5%) (2,0%) M mucogenicum (0%) (2,0%) M scrofulaceum (4,5%) (4,1%) M stomatopiae (4,5%) (2,0%) 22 (100%) 49 (100%) Tổng Định danh đến loài cho thấy phức hợp M abscessus/ M chelonae có tần suất xuất cao với 27 chủng (55,1%), tiếp đến phức hợp MAC với chủng (16,3%) Các loài khác phân lập với tỉ lệ nhỏ 20 TCNCYH 157 (9) - 2022 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC Trong số 22 bệnh nhân mắc bệnh liên quan đến NTM, số người nhiễm phức hợp M abscessus/ M chelonae chiếm tỉ lệ cao với 10 bệnh nhân (46%), đứng thứ hai người (22,5%) nhiễm phức hợp MAC, đứng thứ ba M kansasii với người (13,5%), loài khác chiếm tỉ lệ nhỏ Hình So sánh trình tự đoạn gyrB loài M tuberculosis M bovis (Dịng trình tự M tuberculosis, dịng trình tự M bovis, dấu "." thể Nu giống Trình tự đoạn gyrB lồi có khác biệt nhỏ, ví dụ: vị trí 142 M bovis thay G A) TCNCYH 157 (9) - 2022 21 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC Hình So sánh trình tự đoạn rpoB M.a.massiliense M.a.abscessus IV BÀN LUẬN Phức hợp MTBC bao gồm 12 thành viên M tuberculosis, M bovis, M bovis BCG, M africanum, M caprae, M pinnipedii, M microti, M canettii, M mungi, M orygis, M dassie chimpanzee bacillus, loài M tuberculosis M africanum gây bệnh bắt buộc người, loài khác gây bệnh động vật có khả lây cho người Trong nghiên cứu này, quan sát thấy 56 chủng MTBC 105 chủng có TBc ID âm tính Khi định danh đến lồi, đa số chủng (55 chủng) thuộc M tuberculosis 22 chủng thuộc M bovis Như vậy, chủng MTBC âm tính với TBc ID khơng thuộc lồi nằm hướng dẫn sử dụng nhà sản xuất Khi chủng có TBc ID âm tính chủ yếu M tuberculosis nguyên nhân chủ yếu nghĩ đến trường hợp M tuberculosis bị đoạn đột biến gen mpb64 dẫn đến không phát MPT64 chủng Ngoài tỷ lệ nhỏ trường hợp âm tính giả khác nồng độ thấp MPT64 ống MGIT báo dương sớm MTBC bị lấn át vi khuẩn khác ống MGIT TCNCYH 157 (9) - 2022 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC bội nhiễm Đối với chủng cần tiến hành định danh thêm phương pháp khác thử nghiệm niacin GeneXpert Việc phát chủng MTBC (M bovis) gây bệnh lao lây truyền từ động vật sang người có ý nghĩa điều trị phịng bệnh M bovis đề kháng tự nhiên với pyrazinamide việc quản lý đàn gia súc sản phẩm từ gia súc biện pháp có ý nghĩa so với cách ly bệnh nhân Như vậy, việc sử dụng đơn độc phương pháp định danh TBc ID dẫn đến nhóm lồi này, cao liệu Đặng Thị Nguyên (2018) tỉ lệ M abscessus/ M chelonae 36,6%.8 Khi so sánh tỷ lệ phức hợp M abscessus/ M chelonae khu vực khác nhau, chúng tơi thấy có tương tự với khu vực lưu hành phổ biến lao khu vực miền nam Đài Loan hay khu vực bang Para Bra-xin Nghiên cứu Simons năm 2011 gợi ý mối liên quan NTM PD với tiền sử lao phổi cũ nhiên cần thêm nhiều chứng để kết luận.9 Cũng thuộc khả bỏ sót số chủng MTBC, cần có chiến lược định danh phối hợp với phương pháp khác chủng có TBc ID âm tính Các phương pháp sinh học phân tử nên ưu tiên phương pháp xác định tính chất sinh vật hóa học cổ điển nhờ ưu vào thời gian quay vòng nhanh độ nhạy, độ đặc hiệu cao Đối với NTM, 49 chủng NTM có 30 chủng (61,2%) RGM 19 chủng (38,8%) SGM Tỉ lệ lồi SGM RGM có khác biệt đáng kể với khu vực châu Âu châu Mỹ mà nghiên cứu khu vực cho thấy tỉ lệ RGM tương đối thấp Các nghiên cứu khu vực Đông Á quan sát thấy tỉ lệ RGM cao nhiên lại có khác biệt lớn quốc gia khác nhau, việc so sánh tỉ lệ RGM khó khăn Nguyên nhân dẫn đến việc gia tăng tỉ lệ loài RGM gia tăng khu vực châu Á nói chung Việt Nam nói riêng chưa làm sáng tỏ, nhiên số nghiên cứu gợi ý khác biệt khí hậu, vật chủ (con người) lực phòng xét nghiệm khu vực Định danh đến loài chủng NTM cho thấy tỷ lệ phức hợp M abscessus/ M chelonae thuộc nhóm RGM đứng hàng đầu với 27 chủng (55,2%) Tỷ lệ cao nhiều so với liệu thu từ nghiên cứu khu vực Đông Á, nơi coi phổ biến phân lập RGM, nhóm M fortuitum thường có độ phổ biến cao nhiều quốc gia khu vực lại chiếm tỷ lệ tương đối thấp nghiên cứu (4,1%), lý giải nhóm M fortuitum thường gây bệnh da, mô mềm chủ yếu đối tượng đưa vào chủ yếu nhóm bệnh nhân có triệu chứng đường hơ hấp Nhóm M mucogenicum chiếm tỷ lệ nhỏ thành viên nhóm RGM quan trọng nhóm M smegmatis, nhóm RGM sinh sắc tố sớm nhóm M megeritense/ M wolinskyi khơng quan sát thấy chủng Có lẽ cỡ mẫu nghiên cứu cịn nhỏ nên nhóm phổ biến lồi RGM khơng thấy xuất Đối với nhóm SGM, phức hợp MAC (16,4%) lồi phổ biến nhất, tương đương với kết thu nghiên cứu Đặng Thị Nguyên (15,9%).8 Ở quốc gia khu vực khác, độ phổ biến MAC rộng rãi nhiều so với kết Xét riêng nhóm SGM, phức hợp MAC đóng vai trò quan trọng Các nghiên cứu phức hợp MAC thường có liên quan đến bệnh suy giảm miễn dich (HIV/ AIDS) mà đối tượng nghiên cứu này, nguyên nhân dẫn đến khác biệt Ngoài ra, M kansasii đứng thứ sáu tần suất phân lập giới, đặc trưng khả gây bệnh cao có tỉ lệ 6,1% nghiên cứu Đặc TCNCYH 157 (9) - 2022 23 ... HỌC phân tích trình tự đoạn gen đích khơng đủ để định danh đến lồi NTM chưa có chiến lược cụ thể tối ưu việc giải trình tự nhiều gen house-keeping (thường gọi gen giữ nhà), phương pháp phân tích... số chủng mycobacteria phương pháp giải nghi NTM cấy mẫu bệnh phẩm đờm trình tự gen" với mục tiêu: Định danh đến Kỹ thuật sử dụng nghiên cứu: Quy lồi chủng Mycobacterium ni cấy MGIT trình tách... thuộc khả bỏ sót số chủng MTBC, cần có chiến lược định danh phối hợp với phương pháp khác chủng có TBc ID âm tính Các phương pháp sinh học phân tử nên ưu tiên phương pháp xác định tính chất sinh