Luận văn thạc sĩ công nghệ thực phẩm nghiên cứu thu nhận chế phẩm ficin từ nhựa quả vả (ficus auriculata lour) và bước đầu khảo sát khả năng làm mềm thịt bò

ĐẠI HỌC HUẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM NGUYỄN THÀNH TRUNG NGHIÊN CỨU THU NHẬN CHẾ PHẨM FICIN TỪ NHỰA QUẢ VẢ (FICUS AURICULATA LOUR) VÀ BƯỚC ĐẦU KHẢO SÁT KHẢ NĂNG LÀM MỀM THỊT BÒ LUẬN VĂN THẠC SĨ CHẾ BIẾN LƯƠNG THỰC, THỰC PHẨM VÀ ĐỒ UỐNG Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM HUẾ 2017 PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma ĐẠI HỌC HUẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM NGUYỄN THÀNH TRUNG NGHIÊN CỨU THU NHẬN CHẾ PHẨM FICIN TỪ NHỰA QUẢ VẢ (FICUS AURICULATA LOUR) VÀ BƯỚC ĐẦU KHẢO SÁT KHẢ NĂNG LÀM MỀM THỊT BÒ LUẬN VĂN THẠC SĨ CHẾ BIẾN LƯƠNG THỰC, THỰC PHẨM VÀ ĐỒ UỐNG Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM Mã số: 60540101 NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC TS VÕ VĂN QUỐC BẢO HUẾ 2017 PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu riêng tơi Các số liệu kết nghiên cứu nêu Luận văn trung thực, đồng tác giả cho phép sử dụng chưa công bố tài liệu khác Tác giả luận văn Nguyễn Thành Trung PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma ii LỜI CẢM ƠN Để thực hoàn thành Luận văn với cố gắng nỗ lực thân, nhận nhiều giúp đỡ cá nhân tập thể Đầu tiên, xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến người hướng dẫn khoa học Thầy giáo TS Võ Văn Quốc Bảo tận tình hướng dẫn, dạy bảo tạo điều kiện thuận lợi tơi hồn thành tốt Luận văn tốt nghiệp Tôi xin chân thành cảm ơn đến Quý Thầy, Cô giáo Khoa Cơ khí - Cơng nghệ, Phịng Đào tạo Sau đại học Quý Thầy, Cô Trường Đại học Nông Lâm, Viện Công nghệ Sinh học, Đại học Huế truyền đạt kiến thức lý luận thực tiễn thời gian qua Cuối xin gửi lời cảm ơn đến gia đình bạn bè tạo điều kiện thuận lợi, giúp đỡ ủng hộ khuyến khích suốt thời gian học tập thực đề tài luận văn tốt nghiệp Trong q trình thực Luận văn có sai sót mong Q Thầy, Cơ bạn đóng góp ý kiến để Luận văn hồn thiện Huế, ngày… tháng… năm 2017 Học viên cao học Nguyễn Thành Trung PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma iii TÓM TẮT Protease chiết xuất từ nhựa vả, chứa chủ yếu enzyme ficin; loại men tiêu hủy protein (proteolytic enzymes) Trong cơng trình này, chúng tơi nghiên cứu yếu tố ảnh hưởng đến trình thu nhận chế phẩm ficin từ dịch nhựa vả khảo sát số tính chất đặc trưng chế phẩm enzyme ficin, nhằm nâng cao giá trị sử dụng vả Thừa Thiên Huế để từ nghiên cứu bước đầu khả làm mềm thịt chế phẩm ficin Để tách enzyme có kết tốt cần phải tiến hành thí nghiệm để lựa chọn thơng số kỹ thuật thích hợp Kết cho thấy, vả đạt độ chín thu hoạch cho hàm lượng protein hoạt độ protease cao nhất, tương ứng 2,212 (mg/ml) 1,015 (Hp/ml) tỷ lệ dịch nhựa vả/ethanol 96% 1/4 nhiệt độ chiết 3°C Thời gian thu nhận enzyme thích hợp 60 phút Chế phẩm protease hoạt động thích hợp nhiệt độ 45ºC, pH = 6, bền nhiệt từ 35ºC đến 50ºC Ngồi ra, chúng tơi nghiên cứu khả làm mềm thịt chế phẩm khảo sát độ dai thịt bò sau 20 phút 50,60 N tỷ lệ nước giảm 17,33% so với mẫu đối chứng 25,13% PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma iv MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN .i LỜI CẢM ƠN ii TÓM TẮT iii MỤC LỤC iv DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT vii DANH MỤC BẢNG viii DANH MỤC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ ix MỞ ĐẦU 1 Đặt vấn đề Mục đích luận văn Ý nghĩa khoa học thực tiển luận văn CHƯƠNG TỔNG QUAN CÁC VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU .3 1.1 TỔNG QUAN VỀ ENZYME 1.2 TỔNG QUAN PROTEASE .5 1.2.1 Giới thiệu protease 1.2.2 Phân loại protease 1.2.3 Nguồn thu nhận protease .7 1.2.4 Sản xuất protease từ nguồn thực vật khác 1.3 TỔNG QUAN VỀ NGUYÊN LIỆU 13 1.3.1 Giới thiệu chung vả 13 1.3.2 Đặc điểm hình thái .14 1.3.3 Đặc điểm sinh học .15 1.3.4 Thành phần hóa học nhựa vả 15 1.3.5 Enzyme ficin 15 1.4 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRONG VÀ NGOÀI NƯỚC 20 1.4.1 Tình hình nghiên cứu ngồi nước 20 1.4.2 Tình hình nghiên cứu nước 21 PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma v CHƯƠNG NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .23 2.1 PHẠM VI, ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU .23 2.1.1 Phạm vi nghiên cứu .23 2.1.2 Đối tượng nghiên cứu 23 2.1.3 Hóa chất .24 2.1.4 Một số thiết bị 24 2.2 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 24 2.2.1 Nghiên cứu thu nhận chế phẩm ficin từ nhựa vả 24 2.2.3 Bước đầu khảo sát khả làm mềm thịt bò 25 2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25 2.3.1 Phương pháp tách chế phẩm ficin từ nhựa vả .25 2.3.2 Phương pháp xác định hàm lượng protein 27 2.3.3 Phương pháp xác định hoạt độ protease 28 2.3.4 Phương pháp vật lý 28 2.3.5 Phương pháp học 28 2.3.6 Phương pháp xác định độ mềm thịt bò 28 2.3.7 Phương pháp toán học 29 2.3.8 Phương pháp bố trí thí nghiệm 30 CHƯƠNG KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 32 3.1 HÀM LƯỢNG PROTEIN VÀ HOẠT ĐỘ PROTEASE Ở BA GIAI ĐOẠN THU HOẠCH KHÁC NHAU CỦA QUẢ VẢ 32 3.2 KHẢO SÁT DUNG MÔI KẾT TỦA .33 3.3 KHẢO SÁT TỶ LỆ DỊCH NHỰA/ETHANOL 34 3.4 KHẢO SÁT THỜI GIAN KẾT TỦA PROTEASE .35 3.5 KHẢO SÁT NHIỆT ĐỘ KẾT TỦA PROTEASE 35 3.6 KHẢO SÁT MỘT SỐ TÍNH CHẤT CỦA CHẾ PHẨM FICIN TỪ NHỰA QUẢ VẢ 38 3.6.1 Ảnh hưởng nhiệt độ đến hoạt độ chế phẩm ficin 38 3.6.2 Ảnh hưởng pH đến hoạt độ chế phẩm ficin 39 3.6.3 Khảo sát độ bền nhiệt chế phẩm ficin 39 PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma vi 3.7 KHẢO SÁT KHẢ NĂNG LÀM MỀM THỊT BÒ 40 3.7.1 Khảo sát độ dai thịt .40 3.7.2 Khảo sát tỷ lệ nước thịt 41 CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 42 4.1 KẾT LUẬN 42 4.2 KIẾN NGHỊ 42 TÀI LIỆU THAM KHẢO .43 PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma vii DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT CBB Phẩm màu Coomasie Brilliant Blue Cys – EP Cystein – proteinase N Newton ĐC Đối chứng FC Thuốc thử folin – clocalteau TCA Acid trichloroacetic Ser-EP Serin – proteinase OD Mật độ quang kD Khối lượng phân tử kilo Dalton CT1 Công thức CT2 Công thức PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma viii DANH MỤC BẢNG Bảng 3.1 Hàm lượng protein hoạt độ protease theo loại dung môi .33 Bảng 3.2 Ảnh hưởng chế phẩm ficin đến độ dai thịt bò 40 Bảng 3.3 Ảnh hưởng chế phẩm ficin đến tỷ lệ nước thịt bò 41 PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma ix DANH MỤC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Hình 1.1 Quá trình tổng quát thu nhận Enzyme từ thực vật 12 Hình 1.2 Quả vả 13 Hình 1.3 Nhựa vả 15 Hình 1.4 Chế phẩm Enzyme Wied N 20 Hình 1.5 Chế phẩm Enzyme-Mix 20 Hình 1.6 Chế phẩm ficin 20 Hình 2.1 Dịch nhựa thu nhận từ ba giai đoạn thu hoạch vả 23 Hình 2.2 Thu mua thịt bị lò giết mổ gia súc 23 Hình 2.3 Sơ đồ quy trình thu nhận dịch nhựa từ vả [6], [18] 25 Hình 3.1 Hàm lượng protein hoạt độ protease theo độ chín 32 Hình 3.2 Hàm lượng protein hoạt độ protease biến thiên theo tỷ lệ dịch nhựa/ethanol 96% 34 Hình 3.3 Hàm lượng protein hoạt độ protease biến thiên theo thời gian 35 Hình 3.4 Hàm lượng protein hoạt độ protease biến thiên theo nhiệt độ 36 Hình 3.5 Quy trình thu nhận chế phẩm enzyme ficin từ dịch nhựa vả 37 Hình 3.6 Ảnh hưởng nhiệt độ đến hoạt độ chế phẩm ficin 38 Hình 3.7 Ảnh hưởng pH đến hoạt độ chế phẩm ficin 39 Hình 3.8 Khả bền nhiệt chế phẩm ficin 40 PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma MỞ ĐẦU Đặt vấn đề Protease enzyme công nghiệp quan trọng, ứng dụng rộng rãi công nghiệp chế biến thực phẩm phát triển mạnh mẽ công nghệ sinh học – thực phẩm, chế phẩm enzyme sản xuất ngày nhiều.Trên giới nhiều nhà khoa học tiến hành nghiên cứu, đưa vào ứng dụng chế phẩm protease cơng nghiệp chế biến thực phẩm thương mại hóa chế phẩm Ở Việt Nam, có nhiều nghiên cứu enzyme, nhiên nghiên cứu ứng dụng cịn hạn chế chưa có sở sản xuất chế phẩm enzyme nói chung protease nói riêng để sử dụng ngành cơng nghiệp Nước ta hoàn toàn phụ thuộc vào nguồn enzyme từ nước ngồi nên giá thành cao Vì vậy, việc hiểu biết, nghiên cứu phát triển sản xuất enzyme nước việc cần thiết ngành công nghiệp đầy tiềm [2], [3] So với protease động vật vi sinh vật, protease thực vật nghiên cứu ứng dụng phổ biến Bên cạnh hai loại enzyme bromelain papain ficin enzyme có nhiều tiềm ứng dụng ngành cơng nghệ thực phẩm [6] Ficin, có nhiều loại họ sung (vả), sử dụng nhiều số ngành sản xuất như: chế biến thực phẩm (làm formage, làm mềm thịt, bổ sung để chống lại tượng kết tủa protein q trình làm bia, ngăn cản hóa nâu rau củ, xử lí phế phụ phẩm chế biến phế thực phẩm…), y học như: làm thuốc hỗ trợ tiêu hóa, tẩy giun Ngồi ra, có nhiều ứng dụng nghiên cứu như: sản xuất thuốc làm tan máu bầm, trị bệnh da, mụn nhọt [10], [33] Nước ta nằm vùng khí hậu nhiệt đới nên loại họ sung nói chung loại vả nói riêng phát triển thích hợp Tuy nhiên, sản phẩm từ vả biết đến qua thực phẩm dùng ngày như: vả trộn, vả kho thịt, hay dùng làm rau mà chưa có nhiều nghiên cứu protease loại Lá vả chứa lượng lớn protease chủ yếu ficin, nguồn nguyên liệu để sản xuất enzyme tự nhiên Từ ý nghĩa thực tiễn trên, chọn đề tài "Nghiên cứu thu nhận chế phẩm ficin từ nhựa vả (ficus auriculata Lour) bước đầu khảo sát khả làm mềm thịt bò" để thực nhằm tạo sở cho nghiên cứu sau Mục đích luận văn - Thiết lập quy trình thu nhận chế phẩm ficin quy mơ phịng thí nghiệm - Khảo sát số tính chất chế phẩm ficin - Bước đầu ứng dụng chế phẩm ficin thu để làm mềm thịt bò PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma Ý nghĩa khoa học thực tiển luận văn - Nâng cao giá trị sử dụng vả, nguồn thực vật phổ biến Huế - Góp phần bổ sung liệu nghiên cứu nguồn protease từ thực vật - Sử dụng thuốc nhuộm Coomasie Brilliant Blue liên kết với protein dung dịch acid để xác định hàm lượng protein Bên cạnh xác định hoạt độ protease theo phương pháp Amano PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma CHƯƠNG TỔNG QUAN CÁC VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1.1 TỔNG QUAN VỀ ENZYME Enzyme chất xúc tác sinh học ứng dụng nhiều lĩnh vực đời sống, đặc biệt đóng vai trị quan trọng quy trình chế biến thực phẩm Enzyme xúc tác cho hầu hết phản ứng xảy thể sống, đảm bảo cho q trình chuyển hóa chất thể sống tiến hành với tốc độ nhẹ nhàng, cân đối theo chiều hướng xác định [2], [14] Enzyme có tất thể động vật, thực vật vi sinh vật Nó tiết dịch tế bào, tồn dịch thể, dịch môi trường (gọi enzyme ngoại bào) giữ lại bên tế bào (enzyme nội bào) Hiện nguồn nguyên liệu trên, vi sinh vật nguồn sản xuất enzyme quy mô lớn cho công nghiệp Tuy nhiên, ứng dụng ngành công nghệ thực phẩm, nguồn nguyên liệu cần phải lưu ý số vi sinh vật có khả sinh độc tố ảnh hưởng đến sức khỏe người Chính thế, số ngành sản xuất thực phẩm, nguồn enzyme khai thác từ động vật thực vật [10], [16] Để tách enzyme có kết tốt cần phải tiến hành thí nghiệm để lựa chọn loại nguyên liệu giàu enzyme dễ dàng tinh chế enzyme Cho đến nay, biết nhiều loại cấu trúc hóa học nhiều loại enzyme quan trọng Đáng ý nhóm ngoại đa số enzyme hai cấu tử có chứa vitamin: piruvatdecacbonxylase chứa B1 (thiamin), aminotransferase chứa B6 (piridoxan), Ngoài ra, số hợp chất khác glutation dạng khử, nucleotid dẫn xuất, estephosphat số monosacharid tham gia vào thành phần coenzyme enzyme [3], [17] Enzyme chất xúc tác sinh học, có đầy đủ tính chất chất xúc tác Tuy nhiên, enzyme có cường lực xúc tác mạnh nhiều so với chất xúc tác thông thường Bên cạnh đó, tính chất đặc trưng enzyme tính đặc hiệu Đó khác biệt enzyme chất xúc tác khác [3] Người ta phân biệt hai kiểu đặc hiệu đặc hiệu chất đặc hiệu kiểu phản ứng: - Đặc hiệu kiểu phản ứng: thể chỗ, enzyme xúc tác cho phản ứng chuyển hóa định Ví dụ: phản ứng oxy hóa khử, phản ứng chuyển vị, phản ứng thủy phân - Đặc hiệu chất: chất chất có phản ứng kết hợp vào trung tâm hoạt động enzyme bị chuyển hóa tác dụng enzyme Mức độ đặc hiệu enzyme không giống Có enzyme có tính đặc hiệu tuyệt đối, nghĩa enzyme tác dụng lên chất định khơng có tác dụng với chất khác Nhưng có enzyme có tác dụng lên kiểu liên kết hóa PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma học phân tử chất mà không phụ thuộc vào cấu tạo thành phần tham gia tạo thành mối liên kết đó, chúng thể tính đặc hiệu tương đối Có enzyme tác dụng với hai dạng đồng phân quang học chất, thể đặc hiệu quang học Ngồi ra, enzyme cịn có khả phân biệt hai gốc đối xứng phân tử giống hoàn toàn mặt hóa học [10], [14] Để thu nhận enzyme nội bào, người ta phải phá vỡ tế bào nhiều phương pháp vật lí, học, hóa học Có ba khó khăn tách enzyme khỏi tế bào cần lưu ý [10]: - Enzyme có tế bào sinh vật với lượng không lớn so với thành phần khác Do đó, việc tách để thu nhận thành phần nhỏ điều khó - Enzyme chất hữu khơng bền, chúng dễ bị biến tính tác động yếu tố bên - Enzyme protein Protein enzyme luôn loại protein khơng phải enzyme lại có tính chất lý hóa giống protein enzyme Do đó, việc tách protein – enzyme khỏi loại protein lúc đạt kết tốt khơng gặp khó khăn định Sau phá vỡ tế bào, người ta thường sử dụng nước, dung dịch đệm, dung dịch muối trung tính để tách enzyme khỏi sinh khối xử lí theo phương pháp Dịch chiết thu được, người ta gọi chế phẩm enzyme thơ chế phẩm này, ngồi enzyme cịn có nước, protein khơng phải enzyme thành phần tế bào Như vậy, việc làm enzyme việc loại protein khơng phải enzyme (đôi loại bỏ protein – enzyme không mong muốn), nước, thành phần khác tế bào khỏi enzyme Cơng việc hồn tồn khơng dễ dàng Do việc làm enzyme địi hỏi người làm nghiên cứu enzyme, ngồi hiểu biết enzyme phải nắm vững nhiều thao tác kỹ thuật khác để tránh gây hoạt tính hoạt động enzyme [4] Để loại bỏ thành phần enzyme ta cần, người ta thực phương pháp như: gây biến tính chọn lọc dựa tác động nhiệt độ, pH, phương pháp kết tủa phân đoạn muối dung môi hữu cơ, phương pháp hấp thụ chọn lọc cho chúng vào cột chất hấp thụ, phương pháp sắc ký dựa sở phản ứng trao đổi ion protien tan nước tác nhân trao đổi ion Để xác định khả xúc tác enzyme thông qua việc xác định hoạt độ hoạt động enzyme, người ta định lượng enzyme trực tiếp mà phải xác định gián tiếp thông qua hoạt độ hoạt động chúng thông qua khả làm giảm chất sau thời gian phản ứng PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma 1.2 TỔNG QUAN PROTEASE 1.2.1 Giới thiệu protease Protease nhóm enzyme xúc tác cho trình thủy phân liên kết peptid (CO – NH) phân tử protein cấu tương tự Quá trình thủy phân liên kết peptid biểu diễn qua chuỗi phản ứng sau: Protein ―> Pepton ―> Polypeptid ―> Acid amin Đây trình thủy phân tương đối phức tạp, có tham gia nhiều protease khác [12], [14] Trong protease, protease hệ tiêu hóa phát sớm Từ lâu người ta tách protease từ dày từ dịch tụy tạng động vật Bên cạnh đó, số nghiên cứu protease thực vật nghiên cứu Năm 1874, người ta công bố nhận protease từ hạt họ đậu, nhiều tác giả thấy rằng, dịch chiết từ đại mạch, bơng lau, đu đủ có khả phân giải protein [17] Ở Việt Nam có nhiều nhà khoa học nghiên cứu, thăm dò, phát khảo sát tính chất enzyme chưa có sở sản xuất chế phẩm enzyme nói chung protease nói riêng Hầu hết chế phẩm enzyme dùng nghiên cứu ứng dụng vào sản xuất phải nhập ngoại Chính việc nghiên cứu tìm quy trình thu nhận chế phẩm enzyme ứng dụng vấn đề cần thiết mang ý nghĩa thực tiễn [15] 1.2.2 Phân loại protease Theo phân loại quốc tế, protease chia làm hai phân nhóm (exo – peptidase, endopeptidase) [10], [12] 1.2.2.1 Exopeptidase Là nhóm enzyme xúc tác thủy phân mối liên kết peptid đầu mạch, gồm có loại: + Amynopeptidase: xúc tác thủy phân liên kết peptid nằm kề nhóm amin tự chuỗi polypeptid H2N – CH – CO – NH – CH – CO – – NH – CH – COOH R1 R2 R3 + Cacboxypeptidase: xúc tác thủy phân liên kết peptid mà có nhóm cacboxyl (-COOH) nằm gần kề chuỗi polypeptid PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma H2N–CH –CO –NH –CH –CO – –NH – CH – CO – NH – CH – COOH R1 R2 R3 R4 + Dipeptid hydrolase: xúc tác thủy phân liên kết dipeptid 1.2.2.2 Endopeptidase (proteinase) Là nhóm enzyme xúc tác cho q trình thủy phân liên kết peptid bên phân tử protein Endopeptidase phân loại dựa vào chế xúc tác chúng Trong thực vật, endopeptidase chia làm loại: serin-proteinase, cystienproteinase, asparticproteinase metallo-proteinase + Serin – proteinase (Ser-EP) enzyme trung tính, có nhóm –OH, có phân tử Ser hoạt động vị trí xúc tác, vị trí có tác dụng tương hỗ với chất protein Các Ser – EP tìm thấy có liên quan tới q trình sinh lý lão hóa, chết tế bào, tạo gỗ, nảy mầm + Cystein – proteinase (Cys – EP): enzyme có nhóm –SH trung tâm hoạt động; nhóm proteinases thực vật nghiên cứu nhiều Cơ chế xúc tác enzyme có liên quan đến nhóm cystein tham gia nhiều q trình sinh học q trình lão hóa tạo gỗ, cố định protein trình nảy mầm Cys – EP biết đến nhiều protein giống caspase, peptid giống papain, bromelain, ficin chứa protein loại cathepsin +Aspartic – proteinase gồm liên kết peptid có nhóm bên aminoacid kỵ nước hoạt động pH acid (pH < 7) Mặc dù, enzyme tìm thấy nhiều loại thực vật, nấm mốc Tuy nhiên quan tâm đến nhóm ít, chủ yếu gồm protein cardosin cathepsin Cardosin chiết từ hoa Cynara cardunculus khô sử dụng sản xuất phomat từ sữa cừu Bồ Đào Nha Tây Ban Nha Cathepsin tìm thấy hạt chưa nảy mầm, suốt thời gian nảy mầm mô sống đại mạch bao gồm chồi rễ + Metallo – proteinase: chủ yếu tìm thấy vi khuẩn, nấm mốc loại vi sinh vật bậc cao Hầu hết loại enzyme chứa Zn, lượng chứa Co Mn Một metallo – proteinase tồn đậu nành, có nhiều giai đoạn sau trình phát triển PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma 1.2.3 Nguồn thu nhận protease Protease enzyme cần thiết cho trình sinh lý thể sống ứng dụng nhiều lĩnh vực khác Chính vậy, chúng phân bố phổ biến vi sinh vật, động vật thực vật Tuy nhiên, phân bố chúng có tính khơng đồng lồi, cá thể mơ, phận thể sinh vật [6], [15], [17] 1.2.3.1 Protease vi sinh vật Thu nhận enzyme từ vi sinh vật nghiên cứu triển khai rộng rãi Các enzyme thu nhận từ nguồn thường có tính đặc hiệu cao, cho sản phẩm thủy phân triệt để đa dạng Nguồn protease chủ yếu vi khuẩn, nấm mốc, xạ khuẩn Trong số vi khuẩn, chủng có khả tổng hợp protease mạnh Bacillus subtilis, Bacillus menseneterisus, Bacillus thermoproteoliticus số thuộc giống Clostridium [16] Các chế phẩm proteinase sản xuất từ vi sinh vật đa dạng, phong phú chủng loại tính chất Đặc biệt, proteinase vi khuẩn có nhiều ưu điểm so với proteinase nấm mốc tốc độ phản ứng nhanh, độ bền nhiệt lớn Trên giới, chế phẩm proteinase sản xuất quy mô công nghiệp thương mại hóa Tuy nhiên, nhà khoa học khơng ngừng tìm kiếm nguồn ngun liệu mới, nghiên cứu tách chiết khảo sát tính chất chế phẩm enzyme thu Trong đó, nghiên cứu thăm dò thu nhận chế phẩm proteinsae từ nguồn vi khuẩn nước ta cịn q so với giới Vấn đề đặt cần phải tuyển chọn chủng vi khuẩn có khả sinh tổng hợp proteinase ngoại bào cao góp phần tạo tiền đề phát triển công nghiệp sản xuất enzyme từ vi khuẩn Việt Nam 1.2.3.2 Protease động vật Protease thu nhận từ động vật nghiên cứu ứng dụng lâu Tuy nhiên khả thu nhận không cao có phận định thể động vật chứa lượng khơng nhiều Enzyme thu nhận từ động vật có tính đặc hiệu rộng rãi so với enzyme từ thực vật vi sinh vật Do vậy, khả thủy phân enzyme thuộc nhóm thấp Hiện nay, người ta tách renin từ dày bê, trypsin từ tụy tạng bị [16] Trypsin: trypsin có khối lượng phân tử 23,3kD enzyme tiêu hóa đường ruột phù hợp với thủy phân protein thực phẩm Nó serine proteinase thủy phân mối liên kết peptide lysine arginine Chymotrypsin: chymotrypsin có khối lượng phân tử 23,8kD tìm thấy dịch tụy Nó đặc hiệu với mối liên kết peptide có nhóm carboxyl amino acid thơm phenylalanine, tyrosine tryptophan Pepsin: pepsin có khối lượng phân tử 24,5kD proteinase acid tìm PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma thấy dày hầu hết động vật có xương sống Dạng hoạt động giải phóng từ dạng zymogen pepsinogen trình tự phân có mặt acid HCl Enzyme thủy phân mối liên kết peptide hai amino acid ưa béo Rennin: rennin proteinase giống pepsin (rennin, chymosin: EC 3.4.23.4) sinh dạng tiền enzyme không hoạt động dày tất động vật có vú chuyển thành dạng rennin hoạt động hoạt động pepsin trình tự xúc tác chúng Do đa số nguồn proteinase động vật phải thu nhận từ nội tạng, không mang lại hiệu kinh tế cao nên gần nghiên cứu chúng hạn chế so với proteinase thực vật vi sinh vật 1.2.3.3 Protease thực vật Việc nghiên cứu protease thực vật bắt đầu vào kỷ XIX gắn liền với cơng trình nhà bác học Kiecgov người Nga, ông chứng minh nước chiết từ hạt lúa mạch nảy mầm có tác dụng chuyển hóa bột thành đường Và đến năm 1929, lần Summer tách protease từ thực vật dạng tinh thể (urease) Trong năm gần đây, nhiều tác giả nước nghiên cứu thu nhận số protease thực vật mức độ tinh khiết khác tùy theo mục đích sử dụng Protease thu nhận từ thực vật chiếm tỉ lệ quan trọng công nghệ enzyme Một số enzyme thu nhận từ thực vật ứng dụng nhiều y học, thực phẩm cơng nghiệp Trong đó, phải kể đến papain đu đủ, bromelain có dứa, ficin sung keratinase có họ đậu [6], [14] Papain: papain loại protease thực vật truyền thống, sử dụng lâu đời tách chiết từ trái đu đủ (Carica papapya) Chế phẩm thô enzyme có tính đặc hiệu rộng có chứa nhiều enzyme peptydase proteinase Papain đặc biệt bền nhiệt, chịu 100ºC giờ, nhiệt độ tối thích 60 - 70ºC pH tối thích thường (với gelatin) (với casein, hemoglobin, albumin trứng) Tính chất enzyme phụ thuộc vào nguồn thực vật, điều kiện khí hậu phương pháp tách, tinh chế [14] Ở Việt Nam, nhiều tác giả nghiên cứu tách chiết, điều chế khảo sát số tính chất papain từ nhựa đu đủ xanh Chế phẩm proteinase từ nhựa đu đủ hỗn hợp papain, chymopapain, peptidase III peptidase IV bị ức chế hoàn toàn flavonoid tách từ bọ mẩy (Clorodendron cyrtophyllum Turez) nồng độ 200mg/l [14] Bromelain: bromelain thu từ thân dịch chiết dứa Enzyme có tính chất giống cystein protease Biên độ pH rộng từ – 10 pH tối thích tùy chất (5-6 với gelatin hemiglobin, 7-8 với casein), nhiệt độ tối thích 50 - 60ºC Nhiệt độ bất hoạt enzyme 70ºC Bromelain có phổ tác dụng PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma rộng papain nên ngày dùng thay cho papain papain đắt (làm mềm thịt, chế biến bia, bánh, chế biến dầu cá, nước mắm ) Bromelain sử dụng y học cơng nghiệp Chính vậy, nhiều nhà khoa học nước giới quan tâm nghiên cứu chế phẩm enzyme [10], [18] Các tác giả Nguyễn Đình Huyên, Trần Minh Tâm, Lê Thị Thanh Mai (1997) nghiên cứu hoạt tính promelain q trình phát triển dứa cho thấy hoạt tính promelain cao thời điểm 25 ngày trước chín Harrach cộng (1995) tinh sạch, xác định tính chất proteinase có chồi dứa phát chế phẩm có tám phân đoạn khác Trong có ba phân đoạn chính, hai phân đoạn số có pH thích hợp 4-4,5 phân đoạn hoạt động pH trung tính Ficin: mủ loại sung có màu vàng kem đến màu hồng pH biến động tương đối rộng (3-9) tùy thuộc vào chất gelatin, hemiglobin hay casein Ficin thương mại hỗn hợp số enzyme protease peroxydase cộng thêm chất độn (đường hay bột) [10] Keratinase: người ta sản xuất protease từ số nhóm thực vật, protease có khả thủy phân lơng, tóc Sự phân giải lơng, tóc có phần quan trọng để sản xuất acid amin thiết yếu – lysine để tránh tắc nghẽn hệ thống nước tiểu Từ việc tìm hiểu protease có nguồn gốc thực vật cho thấy enzyme có mặt nhiều lồi thực vật phân bố mơ khác Cho đến nay, Việt Nam tác giả tập trung nghiên cứu tách chiết khảo sát tính chất chế phẩm protease đối tượng đu đủ dứa Nghiên cứu thăm dò khả thu nhận chế phẩm loài thực vật khác loại họ sung (vả) hạn chế 1.2.4 Sản xuất protease từ nguồn thực vật khác 1.2.4.1 Nguyên tắc tách tinh chế enzyme Enzyme dễ bị giảm hoạt độ tác dụng tác nhân bên ngồi, tinh chế enzyme, để tránh biến tính protein gây ảnh hưởng xấu đến hoạt độ enzyme cần tiến hành nhanh trình tinh chế điều kiện nhiệt độ thấp, thời gian ngắn mơi trường có pH thích hợp [10], [15], [17] Khơng có quy trình cụ thể để chiết xuất tinh chế enzyme khác Do enzyme có mặt tế bào động vật, thực vật vi sinh vật nên trình tách tinh chế enzyme thực theo bước tổng quan sau [6]: - Thứ phá vỡ cấu trúc tế bào nhiều phương pháp khác như: PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma ... THÀNH TRUNG NGHIÊN CỨU THU NHẬN CHẾ PHẨM FICIN TỪ NHỰA QUẢ VẢ (FICUS AURICULATA LOUR) VÀ BƯỚC ĐẦU KHẢO SÁT KHẢ NĂNG LÀM MỀM THỊT BÒ LUẬN VĂN THẠC SĨ CHẾ BIẾN LƯƠNG THỰC, THỰC PHẨM VÀ ĐỒ UỐNG Chuyên... nhiên Từ ý nghĩa thực tiễn trên, chọn đề tài "Nghiên cứu thu nhận chế phẩm ficin từ nhựa vả (ficus auriculata Lour) bước đầu khảo sát khả làm mềm thịt bò" để thực nhằm tạo sở cho nghiên cứu sau... 24 2.2 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 24 2.2.1 Nghiên cứu thu nhận chế phẩm ficin từ nhựa vả 24 2.2.3 Bước đầu khảo sát khả làm mềm thịt bò 25 2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25