314 TÌM MÔI T Ư NG THAY THẾ MRS BROTH ĐỂ TĂNG SINH LACTOBACILLUS PLANTARUM L5 ỨNG DỤNG SẢN XUẤT BÁNH MÌ BỘT CHUA Huỳnh Thị Yến*, Võ Ngọc Huy n, Hồ Lý Hải Vân, Nguyễn Thị Thúy Hằng, Lê Nguyễn Bích Hi n[.]
TÌM MƠI T Ư NG THAY THẾ MRS BROTH ĐỂ TĂNG SINH LACTOBACILLUS PLANTARUM L5 ỨNG DỤNG SẢN XUẤT BÁNH MÌ BỘT CHUA Huỳnh Thị Yến*, Võ Ngọc Huy n, Hồ Lý Hải Vân, Nguyễn Thị Thúy Hằng, Lê Nguyễn Bích Hi n Viện Khoa học Ứng dụng HUTECH, Trường Đại học Cơng nghệ TP Hồ Chí Minh GVHD: TS Nguyễn Hồi Hương TĨM TẮT Chủng Lactobacillus plantarum L5 phân lập từ nem chua có hoạt tính protease lên men đường lactose, kháng nấm Aspergillus in vitro sử dụng để sản xuất giống khởi động Lactobacillus plantarum L5 đồng lên men với nấm men để sản xuất bánh mì bột chua Sinh khối tạo thành mơi trường sữa gầy hoàn nguyên bổ sung glucose, K2HPO4 MnSO4 cao hẳn nuôi cấy môi trường MRS Tăng nồng độ glucose từ 2,0 đến 20,0g/l không làm tăng sinh khối làm tăng nồng độ acid tổng sau lên men 24 48 Hoạt tính protease khả kháng nấm Aspergillus sp nuôi cấy môi trường sữa gầy cao so với nuôi cấy MRS sau 24 Sử dụng dịch nuôi cấy L plantarum L5 đồng lên men nấm men thu bánh mì có thời gian bảo quản ngày dài bảo quản Canxi propionate Natri benzoate ngày Sau nướng mật độ vi khuẩn Lactobacillus plantarum L5 bánh mì 109 cfu/g tăng lên 1010 cfu/g sau ngày bảo quản Từ khóa: Acid tổng, bánh mì bột chua, lactic acid bacteria (Lactobacillus plantarum L5), sinh khối, ức chế nấm ĐẶT VẤN ĐỀ Nấm mốc ngun nhân gây hư hỏng bánh mì Thơng thường, công ty sản xuất bổ sung chất bảo quản để kéo dài thời gian bảo quản benzoate natri canxi propionate Các chất thể nguy gây tính kháng ảnh hưởng xấu sức khỏe [1] Bánh mì làm từ bột chua phương pháp cải thiện cảm quan kéo dài thời gian bảo quản truyền thống châu Âu, tác nhân vi khuẩn lên men Lactobacillus plantarum L5 [2] Lactobacillus plantarum L5 có lịch sử lâu dài việc bảo quản thực phẩm khỏi vi sinh vật gây hư hỏng - chúng thường sử dụng q trình lên men thực phẩm, sản sinh số chất chuyển hóa mang lại lợi ích cho sức khỏe thường coi an toàn (GRAS) [1] Phân lập, tuyển chọn Lactobacillus plantarum L5 từ bột chua thực phẩm lên men truyền thống dựa vào hoạt tính kháng nấm [2], [3], [4] ước đầu để sản xuất giống khởi động Lactobacillus plantarum L5 đồng lên men với nấm men nhằm kéo dài thời gian bảo quản bánh mì Tuy nhiên mơi trường lên men thu sinh khối vi khuẩn Lactobacillus plantarum L5 cịn phụ thuộc vào chủng, nội dung nghiên cứu 314 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1 Vật liệu Chủng Lactobacillus plantarum L5 phân lập từ nem chua PTN Viện Khoa học Ứng dụng Hutech cung cấp Nấm men bánh mì Saccharomyces cerevisiae mua nhà sản xuất SafInstant, natri benzoate mua từ nhà sản xuất Guangdong Guanghua Sci-tech Co., Ltd canxi propionate từ nhà sản xuất Melbourne Food Ingredient Depot bột mì số 11 bột mì thơng dụng 2.2 Phương pháp 2.2.1 Tăng sinh vi khuẩn Lactobacillus plantarum L5 Giữ giống vi khuẩn MRS Agar Nhân giống vi khuẩn cách nuôi cấy L plantarum L5 MRS Broth 37oC, 24 2.2.2 Chọn môi trường thu sinh khối Môi trường lên men: Đối chứng môi trường MRS, môi trường SG0, SG1, SG2, SG3, SG4, SG5, SG6, SG7: Môi trường pha từ sữa gầy hoàn nguyên, bổ sung: K2HPO4 0,3%, MnSO4 0,014% Glucose 2,0 g/L; 2,5; 5,0; 7,5; 10; 12,5; 15; 17,5 20 g/L Môi trường lên men sau tiệt trùng cấy mật độ giống 106 cfu/ml điều chỉnh dựa vào đường chuẩn tế bào Lên men nhiệt độ phòng, lắc 150 vòng/ phút Sau 24-48 mang huyền phù đo OD 600 nm, so với đường chuẩn để tính mật độ tế bào 2.2.3 Xác định sinh khối Xây dựng đường chuẩn tế bào môi trường MRS môi trường sữa gầy SG0 Chủng Lactobacillus plantarum L5 nuôi cấy môi trường MRS SG0 trên, đo OD 600 nm trải đ a MRS Agar đồng thời từ huyền phù vi khuẩn, ủ 37 oC, ngày, đếm khuẩn lạc Đường chuẩn đồ thị biểu diễn OD 600 nm phụ thuộc vào mật độ vi khuẩn cfu/ml 2.2.4 Xác định acid tổng Dịch lên men sau 24 48 hút 10 ml, ly tâm 4000 vòng/phút x 15 phút thu dịch, chuẩn độ NaOH 0.1N với thuốc thử phenolphthalein đến dung dịch có màu hồng nhạt, pH = 8,2 – 8,3 Acid tổng tính quy % acid Lactobacillus plantarum L5 2.2.5 Khảo sát hoạt tính ức chế nấm A.niger in vitro Cách phân lập nấm mốc Aspergillus niger từ bánh mì: Mua bánh mì tiệm bánh xịt phun nước tạo độ ấm, bỏ bánh mì vào bọc hũ nhựa 5-7 ngày Thu mẫu mốc có tơ trắng bào tử đen Sau dùng que cấy vịng lấy trực tiếp mẫu mốc cấy vào mơi trường PDA để ni mốc Bằng phương pháp phịng ẩm soi nấm kính hiển vi Mơi trường sử dụng MRS Agar cải tiến Chủng nấm Aspergillus niger đục từ mơi trường PDA cấy trước ngày đặt vào tâm đ a, ủ 37 oC 24 Dùng que cấy vòng cấy vạch vi khuẩn Lactobacillus plantarum L5 tăng sinh 24 MRS Broth cách mép đ a 1,5 cm (2 315 vạch chủng vi khuẩn phải nằm đối diện qua tâm đ a đường kính) Đ a đối chứng âm khơng ria vi khuẩn Mỗi thí nghiệm lặp lại lần ủ 37 oC 72 Sau đo đường kính vịng nấm tính tỷ lệ kháng nấm 2.2.6 Làm bánh mì bột chua Mỗi mẻ bột nhào chuẩn bị từ 250 g bột mì số 11, 35 g Sucrose, 2.5g NaCl, 25 g trứng, 135 ml huyền phù vi khuẩn Lactobacillus planterum L5 nuôi môi trường sữa gầy, 15g động vật g nấm men bánh mì (107 cfu/g bột) Bột nhào khuấy trộn máy trộn bột vận tốc 1000 vòng/phút 13 phút, sau để bột nghỉ 30 phút nhiệt độ phịng, sau chia thành phần khối lượng 50 g dạng hình cầu, lên men thời gian định 40 oC Nướng thực lò với nhiệt độ điều chỉnh kiểm sốt 13 phút, sau bánh mì làm nguội nhiệt độ phịng đem phân tích 2.2.7 Khảo sát vi khuẩn lên men Lactobacillus plantarum L5 bánh mì bột chua sản xuất đồng lên men vi khuẩn Lactobacillus plantarum L5 với nấm men Xử lý mẫu bánh mì phân tích vi sinh Cân 10 g bánh mì sau nướng bảo quản sau ngày (bảo quản bánh mì túi polyethylene xử lý cồn) Đồng mẫu 90ml môi trường Buffered pepton water Pha loãng theo dãy thập phân 10-6, 10-7, 10-8 môi trường Buffered pepton water Sử dụng môi trường PCA áp dụng phương pháp đỗ đ a cấy trang cho tiêu TPC Hút 0.1ml nồng độ 10-6, 10-7, 10-8 trang môi trường PCA Ủ nhiệt độ 30 oC 72 Khảo sát tổng nấm mốc phân tích sau ngày Sử dụng mơi trường DG 18 bổ sung Acid Tartric chuẩn pH 3.5 Đồng 10g bánh mì sau nướng cách bổ sung 90ml Buffered pepton water (sử dụng chung với test tiêu TPC) 10-1 Hút 0.3 ml mẫu bánh mì đồng 10-1 trang mơi trường DG 18 Sau ngày mẫu bánh mì đồng 90 ml Buffered pepton water Pha loãng theo dãy thập phân 10-2 Hút 0.1ml trang môi trường DG 18 Ủ nhiệt độ phòng 72 Định lượng vi khuẩn Lactobacillus plantarum L5 từ bánh mì bột chua Cân 10 g bánh mì sau nướng bảo quản sau ngày (bảo quản bánh mì túi polyethylene xử lý cồn (sử dụng chung với test tiêu TPC) Đồng mẫu 90 ml mơi trường Buffered pepton water Pha lỗng theo dãy thập phân 10-6, 10-7, 10-8 môi trường Buffered pepton water Sử dụng môi trường MRS Agar bổ sung Bromocresol Purple đỗ đ a Hút 0.1 ml nồng độ 10-6, 10-7, 10-8 trang môi trường MRS Agar bổ sung Bromocresol Purple Ủ nhiệt độ phòng 48 – 72 Các thí nghiệm lặp lại ba lần 316 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Khảo sát hình thái vi khuẩn Chủng L.plantarum L5 vi khuẩn lên men Lactobacillus plantarum L5 có khuẩn lạc MRS Agar: Trịn, to, nhẵn, lồi, bóng, màu trắng đục, rìa trịn Đây vi khuẩn hình que ngắn, gram dương, không sinh bào tử, không di động, catalase âm tính Hình 1: Hình thái khuẩn lạc (a), tế bào vi khuẩn (b) chủng Lactobacillus plantarum L5 3.2 Ảnh hưởng nồng độ đường lên mật độ Lactobacillus plantarum L5 acid tổng dịch lên men Bảng 1: Mật độ, Acid tổng khả phân giải protein Lactobacillus plantarum L5 nuôi cấy môi trường Mơi trường mật độ (cfu/ml ) %TA Đường kính vịng phân giải Protein (D-d), mm MRS 3,8 x 109 1,25 - SG0 1,3 x 1010 0,38 6,5 SG1 1,1 x 1010 0,36 8,5 SG2 1,4 x 1010 0,47 7,5 SG3 7,8 x 10 0,54 8,3 SG4 1,4 x 1010 0,74 12,0 SG5 1,1 x 1010 0,73 6,7 SG6 1,3 x 1010 0,82 13,3 SG7 1,4 x 1010 0,87 11,0 Mật độ tế bào môi trường MRS sau 24 tăng sinh x 109 cfu/ml, mơi trường sữa gầy SG0 1,31 x 1010 cfu/ml Khi tăng nồng độ đường glucose môi trường sữa gầy lên từ từ qua mức từ 2,0 g/L lên 2,5; 5,0; 7,5; 10; 12,5; 15; 17,5 20 g/L (bằng nồng độ đường môi trường MRS mật độ tế bào khơng tăng, chí giảm L plantarum L5 báo cáo trước có khả lên men đường lactose, nên sử dụng đường lactose môi trường sữa gầy xấp xỉ 48 g/L (Hình 2) 317 Hình 2: Mật độ tế bào mơi trường MRS SG có hàm lượng đường tăng dần Nồng độ đường thành phần SG tăng dẫn đến pH dịch lên men giảm dần đồng thời giá trị Acid tổng tăng (Hình 3) Hoạt tính kháng nấm đóng vai trị quan trọng giúp chọn môi trường lên men thu giống khởi động Lactobacillus plantarum L5 đồng lên me với nấm men làm bột nhào Hình 3: Acid tổng pH dịch lên men mơi trường Sữa Gầy có hàm lượng đường tăng dần 3.3 Phân lập nấm mốc từ bánh mì bị mốc Mốc có bào tử màu đen, hình thái kính hiển vi cho thấy bào tử đ nh đặc trưng cho chi Aspergillus, Aspergillus niger 3.4 Ảnh hưởng nồng độ đường lên khả ức chế nấm mốc Vi khuẩn Lactobacillus plantarum L5 nuôi cấy môi trường Sữa Gầy có khả kháng nấm cao mơi trường MRS (Hình 4) Cần khảo sát thêm hoạt tính kháng nấm mốc sử dụng môi trường lên men với nồng độ glucose khác Hình 4: Khả kháng nấm chủng L5 môi trường MRS SG0 318 3.5 Định lượng vi khuẩn Lactobacillus plantarum L5 bánh mì sau nướng sau bảo quản Vi khuẩn Lactobacillus plantarum L5 tác nhân bảo quản nhờ khả ức chế nấm mốc Bảng 2: Mật độ vi khuẩn Lactobacillus plantarum L5 bánh mì sau nướng sau bảo quản ngày nhiệt độ phòng bao polyethylene Chủng Lactobacillus sp.L5 sau nướng Lactobacillus sp.L5 sau ngày bảo quản 1,84×109 cfu/g Trung bình 41⨯1010 cfu/g Như vậy, vi khuẩn Lactobacillus plantarum L5 sống sót bánh mì tăng sinh khối từ 109 cfu/g lên 1010 cfu/g 3.6 Khảo sát thời gian bảo quản bánh mì Bảng 3: Thời gian bánh mì khơng mọc tơ nấm ật độ (cfu/g) Bánh mì Nhiễm nấm (ngày) BML5 106 5-6 ngày BMCaP - ngày BMNaB - ngày Chú thích: BML5: Bánh mì bổ sung L plantarum L5 – BMNaB: Bánh mì bổ sung Natri benzoate – BMCaP: Bánh mì bổ sung Canxi propionate Bánh mì có bổ sung khuẩn L plantarum L5 có thời gian bảo quản lâu so với bánh mì bổ sung chất bảo quản Natri benzoate Canxi propionate từ đến ngày KẾT LUẬN Chủng Lactobacillus sp.L5 thể hoạt tính kháng nấm in vitro ni cấy môi trường MRS sữa gầy Môi trường sữa gầy bổ sung glucose từ 2.0 – 20 g/L nồng độ glucose tăng nồng độ acid tổng giảm, tương đương pH cao acid tổng thấp nuôi cấy môi trường MRS Ngược lại, sinh khối thu môi trường MRS lại thấp nhiều (22%) so với sinh khối thu môi trường sữa gầy Tăng nồng độ đường glucose khơng làm tăng sinh khối Bánh mì sản xuất từ việc sử dụng dịch nuôi cấy L5 môi trường sữa gầy đồng thời lên men với nấm men chứa mật độ vi khuẩn Lactobacillus plantarum L5 cao 109 cfu/g sau nướng, tăng lên 1010 cfu/g sau ngày bảo quản lý kéo dài thời gian bảo quản bánh mì Lactobacillus plantarum L5 so với bánh mì bảo quản hóa chất 1-2 ngày Các nghiên cứu hoàn thiện 319 TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] Belal J Muhialdin, Zaiton Hassan and Nazamid Saari (2013) Chapter "Lactic Acid Bacteria in Biopreservation and the Enhancement of the Functional Quality of Bread" in Lactic Acid Bacteria - R & D for Food, Health and Livestock Purposes., pp: 155-172 [2] Hassan, Y I and Bullerman, L B (2008) Antifungal activity of Lactobacillus paracasei ssp tolerans isolated from a sourdough bread culture International Journal of Food Microbiology, 121: 112-115 [3] Magnusson, J., K Strom, S Roos, J Sjogren, and J Schnurer 2003 Broad and complex antifungal activity among environmental isolates of lactic acid bacteria Fems Microbiology Letters 219(1):129-135 [4] Sjogren, J., J Magnusson, A Broberg, J Schnurer, and L Kenne (2003) Antifungal 3-Hydrôxy Fatty Acids from Lactobacillus plantarum MiLAB 14 Appl Environ Microbiol 69(12):7554-755 320 ... Lactobacillus plantarum L5 Giữ giống vi khuẩn MRS Agar Nhân giống vi khuẩn cách nuôi cấy L plantarum L5 MRS Broth 37oC, 24 2.2.2 Chọn môi trường thu sinh khối Môi trường lên men: Đối chứng môi trường MRS, ... khối thu môi trường MRS lại thấp nhiều (22%) so với sinh khối thu môi trường sữa gầy Tăng nồng độ đường glucose không làm tăng sinh khối Bánh mì sản xuất từ việc sử dụng dịch ni cấy L5 môi trường. .. đường chuẩn để tính mật độ tế bào 2.2.3 Xác định sinh khối Xây dựng đường chuẩn tế bào môi trường MRS môi trường sữa gầy SG0 Chủng Lactobacillus plantarum L5 nuôi cấy môi trường MRS SG0 trên,