BÁO CÁO KHOA HỌC VỀ NGHIÊN CỨU VÀ GIẢNG DẠY SINH HỌC Ở VIỆT NAM HỘI NGHỊ KHOA HỌC QUỐC GIA LẦN THỨ 5 DOI 10 15625/vap 2022 0034 PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN VI KHUẨN LACTIC CÓ KHẢ NĂNG LÊN MEN DỊCH CHIẾT CÂ[.]
BÁO CÁO KHOA HỌC VỀ NGHIÊN CỨU VÀ GIẢNG DẠY SINH HỌC Ở VIỆT NAM - HỘI NGHỊ KHOA HỌC QUỐC GIA LẦN THỨ DOI: 10.15625/vap.2022.0034 PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN VI KHUẨN LACTIC CÓ KHẢ NĂNG LÊN MEN DỊCH CHIẾT CÂY TÍA TƠ (Perilla frutescens (L.) Britton) Vũ Minh Châu1, Tống Thị Mơ1, Trần Thị Thuý1,* Tóm tắt Đồ uống lên men lactic (sữa chua uống, kefir, …) dùng phổ biến thị trường tác dụng kích thích tiêu hố bổ sung dinh dưỡng Vi khuẩn lactic (LAB – Lactic acid bacteria) tham gia lên men lactic sản phẩm lên men lactic truyền thống thường coi vi sinh vật an toàn (GRAS – Generally recognised as safe) Trong nghiên cứu này, báo cáo kết phân lập tuyển chọn LAB từ mẫu tía tơ dịch chiết tía tơ làm giàu lên men chua tự nhiên Trong số 92 chủng LAB phân lập được, chủng LAB 55 tuyển chọn đánh giá khả lên men lactic dịch chiết tía tơ để chế biến nước tía tơ lên men Chủng LAB 55 xác định thuộc chi Lactiplantibacillus, có trình tự đoạn gene 16S-rDNA tương đồng 97,5 % với loài Lactiplantibacillus plantarum, vi khuẩn xếp vào nhóm GRAS Chủng có khả sinh trưởng lên men dịch chiết tía tơ tỉ lệ 1:3 (100 g tía tơ : 300 mL nước) tốt Điều kiện thích hợp cho lên men dịch chiết tía tơ là: nhiệt độ 30 ᴼC, pH 5,5, hàm lượng đường sucrose 20 g/L, thời gian lên men 24 Với điểm cảm quan nước uống từ dịch chiết tía tơ lên men lactic đạt loại khá, chủng có tiềm sử dụng chế biến dịch chiết tía tơ cần tiếp tục nghiên cứu để hồn thiện quy trình lên men, đạt điểm cảm quan tốt Từ khóa: Cây tía tơ, lên men lactic, vi khuẩn lactic ĐẶT VẤN ĐỀ Tía tơ (Perilla frutescens L Britton) thuộc họ Hoa môi (Lamiaceae), thân thảo trồng phổ biến quốc gia vùng nhiệt đới có Việt Nam, dùng làm gia vị thảo dược Cho đến nay, 271 hoạt chất tự nhiên xác định quan tía tơ bao gồm acid phenolic, flavonoid, tinh dầu, carotenoids, phytosterol, acid béo, Trong có số chất báo cáo có hoạt tính dược lý, bao gồm hoạt tính kháng khuẩn, chống oxy hóa, chống viêm chống dị ứng (Arthitaya & Phisit, 2019) Tía tơ kê đơn để điều trị trầm cảm, lo lắng, hen suyễn, tức ngực, nơn mửa, táo bón,…; tía tơ sử dụng thuốc giảm đau thuốc an thần (Hiwa, 2019) Hiện nay, thị trường Nhật Bản, Hàn Quốc, Trung Quốc có nhiều sản phẩm thực phẩm chức làm từ tía tơ Các sản phẩm tập trung chủ yếu loại đồ uống, loại trà, bột tía tơ bổ sung vào bánh, kẹo, bột súp,… (Trần Hoàng Quyên, 2010) Tại thị trường Việt Nam, số đơn vị Công ty Lai Phú, công ty TNHH XNK Thiên nhiên Việt bắt đầu sản xuất số sản phẩm từ tía tơ bột tía tơ, trà tía tơ, nước giải khát tía tơ,… Nhìn chung, đồ uống từ tía tơ chế biến Việt Nam cịn tương đối ít, phần đa cách sử dụng thủ công giã, xay nhà để chiết lấy nước uống Gần đây, số Trường Đại học Sư phạm Hà Nội Email: thuy_tt@hnue.edu.vn * PHẦN NGHIÊN CỨU CƠ BẢN TRONG SINH HỌC 303 nghiên cứu chế biến dịch chiết tía tô (Nguyễn Thị Thu Hà cộng sự, 2021) lên men rượu dịch chiết tía tơ (Trần Thị Th cộng sự, 2020) báo cáo Việt Nam Lên men lactic biết đến công cụ hiệu để bảo quản thực phẩm, kéo dài thời hạn sử dụng, làm tăng giá trị dinh dưỡng hoạt chất bảo vệ sức khỏe sản phẩm Trong trình lên men, LAB sinh tổng hợp chủ yếu acid lactic, số acid hữu rượu bậc cao khác, enzyme vitamin,… đóng góp vào hương vị tính chất đặc trưng sản phẩm lên men Lên men lactic dịch chiết tía tơ giúp tăng hương vị, giá trị dinh dưỡng đặc tính quý tía tơ, kéo dài thời gian bảo quản tạo đồ uống tiện lợi tốt cho sức khỏe người tiêu dùng Cho đến nay, nghiên cứu lên men lactic thực dịch chiết hạt tía tơ (Arthitaya & Phisit, 2019); chưa có nghiên cứu sản phẩm lên men lactic dịch chiết tía tơ Việt Nam Xuất phát từ lí trên, chúng tơi chọn đề tài nghiên cứu: “Phân lập tuyển chọn vi khuẩn lactic có khả lên men dịch chiết tía tô (Perilla frutescens L Britton)” PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu hố chất Mẫu tía tơ (loại bánh tẻ, chưa hoa) thu vườn huyện Giao Thủy, tỉnh Nam Định Dịch chiết tía tơ chế biến cách đun sơi tía tô (đã loại bỏ phần thân già, úa rửa sạch, để ráo) với nước theo tỷ lệ lựa chọn, sau bỏ bã, lọc cặn qua vải bơng thu dịch chiết Các hố chất dùng làm mơi trường mua Công ty Dược Hà Nội, Công ty Hoá chất Đức Giang (Việt Nam), Xilong Scientific Co (Trung Quốc) Các hố chất dùng phân tích đạt độ tinh mức phân tích, mua Merck (Đức) Scharlau (Tây Ban Nha) Môi trường MRS có bổ sung CaCO3 dùng phân lập LAB, có thành phần (g/L) gồm: KH2PO4 (2,0), CH3COONa (5,0), (NH4)3C6H5O7 (2,0), MgSO4.7H2O (0,1), MnSO4 (0,05), pepton (10,0), cao thịt (10,0), cao nấm men (5,0), glucose (20,0), Tween 80 (1,0), CaCO3 (5,0), agar (20,0), pH 6,5 Môi trường MRS lỏng (không có agar) mơi trường dịch chiết tía tơ có bổ sung glucose sucrose dùng cho nghiên cứu khác 2.2 Phương pháp nghiên cứu Làm giàu vi khuẩn lactic dịch chiết tía tơ lên men chua tự nhiên Cây tía tơ loại bỏ gốc úa ngâm ngập nước sạch, rửa bùn đất khơng vị dập lá, để nước trước đặt thí nghiệm làm giàu LAB 05 bình nón khác (Bảng 1); tất bình để tủ ấm 30 °C từ đến ngày Sau 24 đầu tiên, trộn chất bình gắp mẩu từ bình bổ sung vào bình lại BÁO CÁO KHOA HỌC VỀ NGHIÊN CỨU VÀ GIẢNG DẠY SINH HỌC Ở VIỆT NAM 304 Bảng Thí nghiệm làm giàu LAB dịch chiết lên men tía tơ Bình 50g tía tơ, thái nhỏ thêm 2g đường glucose hòa sẵn nước cất bổ sung thêm nước cho đạt tổng 100 mL (mẫu M1) Bình 100 mL dịch chiết tía tơ có bổ sung g đường glucose (mẫu M2) Bình 100 mL dịch chiết tía tơ có bổ sung g đường glucose, đồng thời chỉnh pH = 4,5 acid citric (mẫu M3) Bình 100 mL dịch chiết tía tơ có bổ sung 2g đường glucose, đồng thời chỉnh pH = 4,5 acid lactic (mẫu M4) Bình 100 mL dịch chiết tía tơ, khơng bổ sung đường, khơng chỉnh pH (mẫu M5) Phân lập vi khuẩn lactic Pha loãng mẫu làm giàu theo phương pháp pha loãng liên tục trải 100 µL dịch pha lỗng vi sinh vật mơi trường MRS thạch đĩa có bổ sung 1% CaCO3 (Mai Thị Hằng cs., 2011), gạt đầu que trang vơ trùng Thí nghiệm lặp lại lần cho độ pha loãng mẫu Các đĩa Petri để tủ ấm 30 ºC 24 - 48 trước tách khuẩn lạc Dựa vào khác hình thái khuẩn lạc (kích thước, màu sắc, vòng phân giải CaCO3) LAB mọc bề mặt môi trường phân lập đĩa Petri, tiến hành tách khuẩn lạc khỏi môi trường phân lập nuôi cấy môi trường MRS tủ ấm 30 ºC Sau 24-48 nuôi cấy, chuyển đĩa Petri mọc LAB vào giữ tủ lạnh ºC để tiếp tục nghiên cứu khác Bảo quản giống Giống LAB bảo quản ngắn hạn vòng tháng môi trường MRS thạch 4-10 ºC; bảo quản dài hạn glycerol 10 % -70 ºC Nghiên cứu đặc điể i i vi khuẩn lactic Dịch huyền phù chủng LAB sử dụng để tạo vết bơi vi khuẩn lam kính cố định lửa đ n cồn (3-5 lần) Vết bôi tiêu nhuộm Gram theo phương pháp tiêu chuẩn (Mai Thị Hằng cs., 2011) để xác định thành tế bào vi khuẩn Gram dương (G+) hay Gram âm (G-) Sinh khối tươi chủng LAB trải lên lam kính nhỏ 1-2 giọt H2O2 % lên Sau khoảng 10 giây, có tượng sủi bọt catalase dương tính; khơng có tượng sủi bọt catalase âm tính Các chủng LAB ni ống nghiệm nút xốy bên có ống Durham nằm ngập hồn tồn 10 mL mơi trường MRS dịch thể Sau 48 nuôi cấy, quan sát ống Durham để xác định ống có bóng khí khơng Nếu ống Durham có xuất bóng khí lên bề mặt mơi trường chứng tỏ chủng vi khuẩn sinh CO2 (lên men lactic dị hình); ống Durham chìm, khơng xuất bóng khí chứng tỏ chủng vi khuẩn khơng sinh khí CO2 (lên men lactic đồng hình) PHẦN NGHIÊN CỨU CƠ BẢN TRONG SINH HỌC 305 Định loại LAB trình tự đoạn 16S-rDNA DNA tổng số tách chiết kit tách chiết DNA gene (i-genomic BYF DNA extraction mini kit) iNtRON Biotechnology, Inc (Hàn Quốc) theo hướng dẫn nhà sản xuất DNA tổng số sử dụng để tiến hành phản ứng PCR Đoạn gen quy định trình tự gen 16S rRNA mẫu DNA tổng số khuếch đại cách sử dụng đoạn mồi 27F: 5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′ 1492R: 5’GGTTACCTTGTTACGCTT-3’ dung dịch Taq PCR Master Mix 2X (Intro, Hàn Quốc) Chu trình nhiệt phản ứng PCR có 30 chu kì (94 °C - 30 giây, 52 °C - 30 giây, 72 °C – 1,5 phút) 01 chu kì khởi động 94 °C phút, 01 chu kì kéo dài chuỗi bổ sung 72 °C phút Sản phẩm phản ứng PCR tinh kit MEGAquick-spinTM iNtRON Biotechnology, Inc (Hàn Quốc) gửi đọc trình tự phương pháp Sanger Cơng ty 1st BASE (Singapore) Trình tự 16S-rDNA thu so sánh với trình tự có sẵn ngân hàng gene NCBI sử dụng công cụ BLAST Đị ượ g ượng acid lactic Hàm lượng acid lactic định lượng theo phương pháp chuẩn độ xác định hàm lượng acid tổng số (Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 6836:2007) Hàm lượng acid tổng số mẫu tính g/100 mL, phân tích lặp lại lần giá trị trung bình báo cáo Nghiên cứu ả ưởng số yếu tố ôi trườ g di dưỡ g đế i lên men chủng LAB tuyển chọn mơi trường dịch chiết tía tơ trưởng Chủng LAB tuyển chọn hoạt hóa mơi trường MRS lỏng Sau 24 nuôi cấy, hút mL dịch giống xác định mật độ quang bước sóng 600 nm tính lượng giống bổ sung vào bình chứa 30 mL mơi trường dịch chiết tía tô cho OD600 ban đầu 0,1 Các yếu tố (tỷ lệ dịch chiết tía tơ, hàm lượng đường, pH ban đầu nhiệt độ) thay đổi để xác định điều kiện thích hợp cho lên men dịch chiết tía tơ chủng LAB tuyển chọn Tạo đồ uống lên men lactic từ chủng LAB tuyển chọn Chủng LAB tuyển chọn hoạt hóa mơi trường MRS dịch thể (giống cấp 1), sau chuyển sang mơi trường dịch chiết tía tơ có bổ sung 20 g/L sucrose (giống cấp 2) Bổ sung giống cấp vào bình lên men cho OD600 ban đầu 0,1 lên men tĩnh 24 Dịch lên men để lắng ᴼC 24 gạn lấy dịch trong, lọc qua vải trùng 105 ᴼC 10 phút để thu nước uống tía tơ lên men Đá giá cảm quan ước uống tía tơ lên men lactic Nước uống tía tơ đánh giá cảm quan theo Quy chuẩn kỹ thuật Quốc gia sản phẩm đồ uống không cồn (QCVN 6-2:2010/BYT) theo thang điểm với 03 tiêu chí: Màu sắc (trọng số 0,8), mùi (trọng số 1,2) vị (trọng số 2,0) Phiếu cảm quan 100 sinh viên Khoa Sinh học, Trường Đại học Sư phạm Hà Nội thu thập để xác định 306 BÁO CÁO KHOA HỌC VỀ NGHIÊN CỨU VÀ GIẢNG DẠY SINH HỌC Ở VIỆT NAM Tổng điểm trung bình tiêu chí xếp loại nước uống: Loại tốt (đạt điểm tổng số 18,6-20,0, điểm cho tiêu chí mùi vị đạt 4,8); loại (đạt điểm tổng số 15,218,5, điểm cho tiêu chí mùi vị đạt 3,8); loại trung bình (đạt điểm tổng số 11,215,1, điểm cho tiêu chí > 2,8); loại (đạt điểm tổng số 7,2-11,1, điểm cho tiêu chí > 1,8); loại (đạt điểm tổng số 4,0-7,1, điểm cho tiêu chí > 1,0); loại yếu (đạt điểm tổng số 0,0 – 3,9, điểm cho tiêu chí < 1,0) KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 3.1 Làm giàu phân lập vi khuẩn lactic từ dịch chiết tía tơ lên men chua tự nhiên Từ mẫu làm giàu LAB (mẫu M1 đến M5) thời điểm khác nhau, phân lập 92 khuẩn lạc có khả sinh acid tạo vòng phân giải CaCO3 Các khuẩn lạc khác kích thước, hình dạng, màu sắc nên tạm gọi 92 chủng LAB Cụ thể là: Mẫu M1 (26 chủng), mẫu M2 (7 chủng), mẫu M3 (32 chủng), mẫu M4 (23 chủng) mẫu M5 (4 chủng) Kết cho thấy: Các mẫu có bổ sung đường (gồm M1, M2, M3 M4) thu nhiều chủng LAB so với mẫu dịch chiết lên men tự nhiên không bổ sung đường (M5) Như vậy, hàm lượng đường có sẵn tía tơ thấp, không thuận lợi cho LAB sinh trưởng phát triển Cũng nhận thấy mơi trường dịch chiết tía tơ có acid (mẫu M3 M4), chủng LAB phân lập nhiều sinh trưởng tốt so với mơi trường khơng có acid (mẫu M2 M5) 3.2 Tuyển chọn chủng LAB có khả lên men dịch chiết tía tơ Dịch chiết tía tơ thơ có chứa anthocyanine hợp chất có vịng phenol (Nguyễn Thị Thu Hà, 2021) nên dễ bị oxi hóa chuyển màu Do vậy, nước uống tía tơ thường bổ sung acid citric đường để giữ màu, tạo vị bảo quản Dịch chiết tía tơ tỉ lệ 1:3 (100 g tía tơ : 300 mL nước) có bổ sung g/L acid citric, pH 2,5 (Nguyễn Thị Thu Hà, 2021) sử dụng làm đối chứng để đánh giá cảm quan màu sắc mùi hương cho thí nghiệm tuyển chọn vi khuẩn LAB lên men dịch chiết tía tơ Mẫu đối chứng có độ hấp phụ cao hai bước sóng 383 nm 536 nm quang phổ tử ngoại khả kiến (bước sóng 100 -1000 nm) Căn vào khả lên men lactic môi trường dịch chiết tía tơ tạo sản phẩm có cảm quan màu sắc mùi hương tốt (màu sắc gần so với mẫu dịch chiết đối chứng), sơ lựa chọn 19 chủng LAB Các chủng có khả lên men lactic đồng hình, catalase âm tính thành tế bào Gram dương, phù hợp với đặc tính nhóm LAB báo cáo (Lahtinen cộng sự, 2011) Đánh giá khả sinh trưởng mơi trường MRS dịch thể, có 4/19 chủng sinh trưởng mạnh (CDW > 2; OD600 >10), có 7/19 chủng sinh trưởng (CDW ≤ 1; OD600 < 2,5) 8/19 chủng sinh trưởng trung bình (Hình 1) PHẦN NGHIÊN CỨU CƠ BẢN TRONG SINH HỌC 307 Hình Khả sinh trưởng 19 chủng LAB tuyển chọn mơi trường MRS dịch thể Hình Khả sinh trưởng 19 chủng LAB tuyển chọn môi trường dịch chiết tía tơ Khi đánh giá khả sinh trưởng chủng lựa chọn mơi trường dịch chiết tía tơ (Hình 2), khơng có chủng sinh trưởng mạnh mơi trường MRS Chỉ có 5/19 chủng sinh trưởng trung bình (CDW > 1,2 g/L; OD600 > 2), chủng lại (14/19 chủng) sinh trưởng (OD600 < CDW < 1,2 g/L) Như vậy, việc hoạt hoá nhân giống chủng LAB nên tiến hành môi trường MRS dịch thể trước lên men dịch chiết tía tơ 308 BÁO CÁO KHOA HỌC VỀ NGHIÊN CỨU VÀ GIẢNG DẠY SINH HỌC Ở VIỆT NAM Hình Màu sắc dịch lên men tía tô 19 chủng LAB tuyển chọn so với mẫu dịch chiết tía tơ đối chứng Kết đánh giá màu sắc dịch tía tơ lên men (Hình 3) cho thấy: Ba chủng có màu sắc dịch lên men tốt nhất, gần với mẫu đối chứng (ĐC) chủng 55, 77 159 Đánh giá cảm quan mùi cho thấy: dịch lên men hai chủng 55 159 có mùi hài hịa dễ chịu so với dịch lên men chủng 77 Chủng 55 159 xếp vào nhóm sinh trưởng mạnh môi trường MRS dịch thể sinh trưởng trung bình mơi trường dịch chiết tía tô Bảng Kết định danh chủng 55 so sánh đoạn trình tự 16S-rDNA với trình tự gene tương đồng ngân hàng gene NCBI STT Tên khoa học Độ phủ trình tự Độ tương đồng Độ dài Mã số của vi sinh vật so sánh (%) (%) trình tự so sánh trình tự so sánh Lactiplantibacillus 99 97,73 1519 NR_115605.1 plantarum Lactiplantibacillus 99 97,62 1492 NR_113338.1 plantarum Lactiplantibacillus 99 97,62 1454 NR_112690.1 plantarum Lactiplantibacillus 99 97,62 1527 NR_104573.1 plantarum Lactiplantibacillus 99 97,62 1519 NR_029133.1 plantarum Lactiplantibacillus 99 97,62 1466 NR_117813.1 plantarum Lactiplantibacillus 99 97,62 1474 NR_042394.1 plantarum Các kết định danh chủng 55 159 trình tự 16S-rDNA xác định chủng 55 tương đồng 97,5 % so với trình tự 16S-rDNA chủng Lactiplantibacillus plantarum (trước gọi Lactobacillus plantarum) báo cáo ngân hàng gen NCBI (Bảng 2); chủng 159 khơng đạt kết đọc trình tự đầy đủ