Nghiên cứu khoa học công nghệ NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA LỒI TRÙNG CHÂN GIẢ CĨ VỎ Arcella gibbosa TRONG CÁC MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY QUY MƠ PHỊNG THÍ NGHIỆM NGUYỄN THỊ CHINH (1), TRẦN QUỐC HOÀN (1), ĐỖ TẤT THỊNH (1) TRẦN THỊ NHÀN (1), NGUYỄN THỊ KIM OANH (1) ĐẶT VẤN ĐỀ Động vật nguyên sinh nói chung nhóm trùng chân giả có vỏ (testate amoebae) nói riêng thành phần “vịng vi sinh” (“microbial loop”) có vai trị quan trọng hệ sinh thái, thành phần lưới thức ăn chu trình chuyển hóa vật chất lượng [1, 2] Trong năm gần đây, trùng chân giả có vỏ ngày quan tâm nghiên cứu tầm quan trọng mặt sinh thái khả ứng dụng thực tế chúng cổ sinh thái học, cổ môi trường học [3, 4], thị sinh học môi trường [5, 6] nghiên cứu pháp y [7-9] Loài trùng chân giả có vỏ Arcella gibbosa thuộc giống Arcella Ehrenberg, 1832 Các đơn vị phân loại loài mô tả trước đây, bao gồm Arcella gibbosa Penard, 1890; A gibbosa levis Deflandre, 1928; A gibbosa mitriformis Deflandre, 1928; A.gibbosa aplanata Van Oye, 1956 [10] Năm 2006, loài mô tả lại chi tiết Tsyganov Mazei [11] Hai tác giả mơ tả hình thái sinh thái học lồi trùng chân giả có vỏ Arcella gibbosa phân lập từ quần thể thuộc sinh cảnh khác vùng Nga [11] Trong nghiên cứu Ogden Hedley, Arcella gibbosa loài phân bố rộng, bắt gặp châu Úc, Tây Phi, Bắc Nam Mỹ, châu Âu [12] Trùng chân giả có vỏ (testate amoebae) có lịch sử nghiên cứu lâu đời, nhiên hạn chế khả nuôi cấy nên nghiên cứu sinh thái học, độc học môi trường, thị sinh học môi trường chưa nhiều Cũng bối cảnh đó, có nghiên cứu đề cập đến nhân ni lồi Arcella gibbosa phịng thí nghiệm, khơng trình bày cụ thể, cịn thơng tin Volkova Smirnov [13] nghiên cứu tồn tại, khả sinh sản số loài thuộc chi Arcella sau loại bỏ vỏ tế bào lồi đó, có lồi Arcella gibbosa Kết nghiên cứu cho thấy, sau loại bỏ vỏ, tế bào có khả sống nhiều tuần mơi trường ni cấy khơng trải qua q trình phân chia tế bào Tác giả ni cấy lồi Arcella gibbosa phịng thí nghiệm phân lập từ môi trường tự nhiên Tuy nhiên, phương pháp nuôi cấy trình bày sơ lược, sinh trưởng phát triển lồi Arcella gibbosa điều kiện ni cấy phịng thí nghiệm khơng hay đề cập đến Trên sở đó, chúng tơi thực nghiên cứu nhằm đánh giá sinh trưởng hình thái lồi Arcella gibbosa mơi trường ni cấy khác điều kiện phịng thí nghiệm, từ lựa chọn mơi trường ni cấy phù hợp với loài Đây sở bước đầu để tiến hành nghiên cứu xây dựng sưu tập giống, chủng sinh vật (khó ni cấy) phịng thí nghiệm nghiên cứu liên quan đến lồi thời gian tới Tạp chí Khoa học Công nghệ nhiệt đới, Số 30, 12-2022 147 Nghiên cứu khoa học công nghệ ĐỐI TƯỢNG, PHẠM VI VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng nghiên cứu Lồi trùng chân giả có vỏ Arcella gibbosa phân lập từ nước hồ Suối Hai (Ba Vì, Hà Nội) 2.2 Phạm vi nghiên cứu Thời gian nghiên cứu: Thời gian tiến hành nghiên cứu từ tháng năm 2022 đến tháng năm 2022 Địa điểm nghiên cứu: Các thí nghiệm bố trí, thực phịng thí nghiệm Viện Sinh thái nhiệt đới 2.3 Phương pháp nghiên cứu 2.3.1 Phương pháp thực nghiệm Phân lập thử nghiệm nuôi cấy Phân lập, tăng sinh số lượng Loài Arcella gibbosa phân lập từ mẫu nước hồ Suối Hai (Ba Vì, Hà Nội) Tiến hành phân lập khoảng 100 tế bào Arcella gibbosa vào đĩa petri có đường kính 60 mm Sau đó, làm mẫu cách tiếp tục cấy chuyền tế bào Arcella gibbosa qua đĩa petri khác có chứa nước devanda Mẫu sau làm sạch, cấy vào đĩa petri 60 mm bổ sung 10 ml nước cất hạt gạo Các đĩa petri đặt nhiệt độ phòng ánh sáng đèn led tủ cấy sinh học Sau 10-15 ngày số lượng tế bào Arcella gibbosa đạt đỉnh, tiến hành phân lập, nuôi cấy thêm đĩa petri để tăng sinh số lượng Sử dụng pipet đầu nhọn phân lập tế bào đơn lẻ, cấy chuyền qua đĩa petri đường kính 60 mm có chứa nước devanda để làm mẫu thêm lần Khi đó, mơi trường đơn lồi Arcella gibbosa ni cấy đĩa petri, chúng ăn vi khuẩn kèm Sau thời gian tế bào chọn sử dụng cho nghiên cứu Khảo sát mơi trường ni cấy lồi Arcella gibbosa Thí nghiệm ni lồi Arcella gibbosa tiến hành điều kiện với loại môi trường khác nhau: Modified WC Medium (MWC) [14] có thành phần bảng môi trường nước cất với gạo Gạo sau tiệt trùng nồi hấp tiệt trùng dùng để ni cấy Hút xác 10 ml nước cất hai lần cho vào đĩa petri 60 mm, thêm hạt gạo tiệt trùng (gạo để nguyên hạt không nghiền nhỏ) ta môi trường nước cất với gạo Cùng với trình hoạt động loại vi khuẩn gạo dần phân hủy tạo mơi trường sống cho lồi Arcella gibbosa Mỗi loại mơi trường tiến hành nuôi lặp lại lần bình tam giác 100 ml Tiến hành cấy 100 tế bào lồi Arcella gibbosa vào bình tam giác bổ sung 25 ml dung dịch nuôi cấy, mật độ ban đầu đạt 4tb/ml dung dịch nuôi Khảo sát, đánh giá môi trường nuôi cấy tiến hành tủ cấy sinh học Sử dụng đèn chiếu sáng có cường độ 380 - 400 lux cài đặt chế độ chiếu sáng 12h sáng, 12h tối công tắc hẹn giờ, nhiệt độ phịng trì 28 ± 0,5oC (Hình 1) Các dụng cụ, mơi trường ni cấy, gạo hấp khử trùng nồi hấp nhiệt độ 121oC, áp suất 200 kPa vòng 15 phút 148 Tạp chí Khoa học Cơng nghệ nhiệt đới, Số 30, 12-2022 Nghiên cứu khoa học công nghệ Bảng Thành phần môi trường nuôi cấy WC Medium (MWC) Vi lượng MWC (*) Môi trường MWC Na2EDTA.2H2O 4,36 g NaNO3 (85,01 g/l) 1,0 ml FeCl3.6H2O 3,15 g MgSO4.7H2O (36,97 g/l) 1,0 ml CuSO4.5H2O (10g/l) 1,0 ml NaSiO3 (12,60 g/l) 1,0 ml ZnSO4.7H2O (22g/l) 1,0 ml K2HPO4 (8,71 g/l) 1,0 ml CoCl2.6H2O (10g/l) 1,0 ml NaHCO3 (12,60 g/l) 1,0 ml MnCl2.4H2O (180g/l) 1,0 ml CaCl2.2H2O (36,67 g/l) 1,0 ml Na2MoO4.2H2O (6g/l) 1,0 ml Vi lượng (*) 1,0 ml H3BO3 1,0 g Nước cất 1,0 lít Nước cất 1,0 lít Hình Thí nghiệm nhân ni lồi Arcella gibbosa hai loại mơi trường Quan sát, đo tiêu hình thái, mật độ xác định loài Arcella gibbosa Các tiêu theo dõi: mật độ lồi, tiêu hình thái lồi (đường kính vỏ, chiều cao vỏ, đường kính miệng) Tiến hành so sánh mật độ, đánh giá tiêu hình thái lồi mơi trường ni cấy Mật độ lồi đếm sau 2, 5, 8, 12, 15, 20 ngày nuôi cấy; bình tam giác đếm lặp lần, trước đếm lắc bình tam giác sau hút 1ml dung dịch ni cho vào buồng đếm Chỉ tiêu hình thái đo lần mật độ quần thể lồi đạt đỉnh, bình tam giác tiến hành đo tiêu hình thái ngẫu nhiên 10 tế bào Thời gian nuôi cấy tiến hành đánh giá: 20 ngày Tạp chí Khoa học Cơng nghệ nhiệt đới, Số 30, 12-2022 149 Nghiên cứu khoa học công nghệ Việc quan sát, chụp ảnh, đo tiêu hình thái lồi Arcella gibbosa thực kính hiển vi Olympus BX 53 (Nhật Bản) độ phóng đại 80-1000 lần Mẫu vật chụp camera Olympus SC180 (Nhật Bản) Sử dụng phần mềm CellSene Standard để xác định tiêu hình thái trùng chân giả có vỏ Muốn dịch chuyển mẫu vật đĩa petri quan sát kính hiển vi quang học, sử dụng glycerin nhỏ vào dung dịch mẫu Xử lý hình ảnh phần mềm Adobe Photoshop CC2018 Mật độ loài Arcella gibbosa mẫu nước xác định phương pháp đếm trực tiếp buồng đếm động vật phù du Sedgewick Rafter Các tế bào phân lập xác định Arcella gibbosa dựa hình thái đặc trưng chúng [11] 2.3.2 Phương pháp xử lý số liệu Số liệu thống kê xử lý phần mềm Microsoft excel phần mềm thống kê SPSS Số liệu thống kê trình bày dạng trung bình ± độ lệch chuẩn Mức ý nghĩa thống kê 0,05 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Mơ tả hình thái lồi Arcella gibbosa ni cấy phịng thí nghiệm Lồi Arcella gibbosa Penard, 1890 mà chúng tơi phân lập từ hồ Suối Hai, Ba Vì, Hà Nội có vỏ khơng màu, vàng nhạt nâu Đối với tế bào phân chia vỏ khơng màu vàng nhạt, cịn tế bào già vỏ có màu nâu Vỏ lồi Arcella gibbosa tạo từ chất tiết tế bào, có hình bán cầu, mặt vỏ có chỗ lồi lõm Tỷ lệ chiều cao vỏ/đường kính vỏ ghi nhận từ 100 tế bào nuôi cấy hai môi trường nằm khoảng 0,55 - 0,77; kết tương đồng với kết (0,49 - 0,88) Tsyganov Mazei [11] Nhìn từ xuống, tế bào có dạng hình trịn với viền lồi lõm, bên khối nguyên sinh chất màu lục nhạt, nhìn thấy rõ khơng bào co bóp, nhân (Hình 2) Nhìn từ mặt bên, từ lên Arcella gibbosa có lỗ miệng hình trịn, có cổ miệng Trong nghiên cứu này, ghi nhận tế bào Arcella gibbosa ni cấy phịng thí nghiệm từ hai loại mơi trường nhân ni có đường kính vỏ (42,12 - 59,10 µm), chiều cao vỏ (27,14 - 37,14 µm) nhỏ nhiều khơng nằm khoảng phép đo đường kính vỏ, chiều cao vỏ loài nghiên cứu trước [10 - 12] Đường kính miệng (8,12 - 21,01 µm) nhỏ đường kính miệng lồi nghiên cứu khác (Bảng 2) Các tiêu hình thái lồi Arcella gibbosa điều kiện tự nhiên hồ Suối Hai nhỏ so với công bố trước (đường kính vỏ 60,71 - 80,08 µm; chiều cao vỏ 34,09 - 50,83 µm; đường kính miệng 15,87 - 27,60 µm) Nguyên nhân khác nghiên cứu chúng tơi tiến hành lấy mẫu loài Arcella gibbosa hồ nên tính đại diện khơng cao, cịn nghiên cứu trước phạm vi nghiên cứu rộng với quy mơ thu mẫu lớn, tính đại diện cao Cũng không loại trừ ảnh hưởng yếu tố địa lý, mơi trường ni cấy ảnh hưởng đến hình thái lồi Arcella gibbosa 150 Tạp chí Khoa học Cơng nghệ nhiệt đới, Số 30, 12-2022 Nghiên cứu khoa học công nghệ A Cấu trúc bề mặt vỏ B Nguyên sinh chất tế bào già C Tế bào Arcella gibbosa nhìn từ mặt bên D Nguyên sinh chất tế bào non Hình Hình thái lồi Arcella gibbosa Penard, 1890 quan sát kinh hiển vi Khi xem xét hình thái lồi Arcella gibbosa điều kiện phịng thí nghiệm, có khác hình thái tế bào Arcella gibbosa nuôi cấy môi trường MWC môi trường nước cất với gạo Bề mặt vỏ tế bào nuôi môi trường MWC có khối lồi lõm rõ nét hơn, cấu trúc bề mặt vỏ rõ ràng Tế bào ni mơi trường nước cất với gạo có vỏ thay đổi từ không màu đến vàng nhạt, vàng nâu ghi nhận tế bào có màu nâu già, cịn tế bào ni dung dịch MWC có màu sắc vỏ thay đổi từ khơng màu, vàng nhạt, vàng nâu ghi nhận tế bào có màu nâu già Các tiêu hình thái đo cho thấy khác kích thước tế bào ni hai loại mơi trường Có khác biệt có ý nghĩa thống kê (p < 0,001; n = 100) đường kính vỏ, đường kính miệng tế bào nuôi hai loại môi trường Đường kính vỏ tế bào ni mơi trường nước cất với gạo (42,12 - 59,10 µm) nhỏ mơi trường MWC (50,12 - 58,92 µm) đường kính miệng tế bào ni Tạp chí Khoa học Cơng nghệ nhiệt đới, Số 30, 12-2022 151 Nghiên cứu khoa học công nghệ môi trường nước cất với gạo (8,12 - 19,78 µm) nhỏ mơi trường MWC (12,53 - 21,01 µm) Chiều cao vỏ tế bào nuôi dung dịch nước cất với gạo (27,14 - 36,31 µm) thấp có ý nghĩa thống kê (P = 0,04; n = 100) với chiều cao vỏ tế bào ni mơi trường MWC (29,03 - 37,14 µm) Bảng Một số tiêu hình thái lồi Arcella gibbosa Penard, 1890 theo nghiên cứu tác giả khác [11] Đơn vị đo: µm Đường kính vỏ Chiều cao vỏ Penard, 1890 Bartos, 1954 80 - 90 80 - 90 50 - 60 50 - 60 Đường kính miệng - Deflandre, 1928 70 - 125 49 - 74 21 - 32 90 61 19 Alekperov, Snegovaya, 2000 85 - 100 50 - 65 20 - 35 Tsyganov Mazei, 2006 79 - 111 48,6 - 76,5 17 - 36,6 60,71 - 80,08 34,09 - 50,83 15,87 - 27,60 50,12 - 58,92 29,03 - 37,14 12,53 - 21,01 42,12 - 59,10 27,14 - 36,31 8,12 - 19,78 Các tác giả Ogden, Hedley, 1980 Môi trường hồ Suối Hai (n=50) Nghiên Môi trường MWC cứu (n=50) Môi trường nước cất với gạo (n=50) Phân tích mối tương quan tiêu hình thái 100 cá thể từ hai mơi trường ni cấy, nhìn chung tiêu đường kính vỏ, chiều cao vỏ, đường kính miệng có mối tương quan trung bình đến mạnh với Đường kính vỏ có mối tương quan dương trung bình với chiều cao vỏ (r = 0,64; P < 0,001; n = 100), đường kính vỏ có mối tương quan dương mạnh với đường kính miệng (r = 0,69; P < 0,001; n = 100), chiều cao vỏ có tương quan dương trung bình với đường kính miệng (r = 0,54; P < 0,001; n = 100) Trong nghiên cứu trước Tsyganov Mazei [11] ghi nhận phép đo vỏ có mối tương quan dương đáng kể với không mạnh (r < 0,55) 3.2 Khả tăng sinh số lượng tế bào lồi Arcella gibbosa mơi trường ni cấy Khảo sát ni cấy lồi Arcella gibbosa loại mơi trường nuôi cấy khác (MWC, nước cất với gạo), thời gian tiến hành thử nghiệm 20 ngày Kết sinh trưởng loài Arcella gibbosa thể qua tiêu mật độ theo mốc thời gian định (sau 2, 5, 8, 12, 15, 20 ngày) Trong thí nghiệm này, chúng tơi quan tâm đến tăng sinh số lượng loài Arcella gibbosa mơi trường ni cấy khác nên thời gian thí nghiệm kéo dài đến lúc quần thể Arcella gibbosa đạt đỉnh giữ ổn định 152 Tạp chí Khoa học Công nghệ nhiệt đới, Số 30, 12-2022 Nghiên cứu khoa học cơng nghệ Hình Sự thay đổi mật độ loài Arcella gibbosa theo thời gian hai loại môi trường Trong môi trường nuôi cấy không liên tục, hai loại môi trường từ 0-20 ngày thí nghiệm, đường cong sinh trưởng lồi Arcella gibbosa gồm pha: pha tiềm phát, pha lũy thừa, pha cân pha suy thối (Hình 3) Hai ngày sau nuôi cấy, mật độ quần thể Arcella gibbosa hai loại mơi trường ổn định, khơng có tăng lên nhiều số lượng Giai đoạn giai đoạn tiềm phát, tế bào Arcella gibbosa thích nghi với mơi trường mới, chúng tổng hợp ADN enzym cho trình phân bào giai đoạn Vào pha lũy thừa trình sinh trưởng, có khác biệt khoảng thời gian pha hai môi trường nuôi cấy khác Trong môi trường nước cất với gạo thời gian pha lũy thừa (13 ngày, từ ngày thứ đến ngày thứ 15) dài môi trường MWC (10 ngày, từ ngày thứ đến ngày thứ 12) Sau ngày thứ 15 thí nghiệm, mật độ quần thể Arcella gibbosa nuôi môi trường nước cất với gạo đạt đỉnh giữ ổn định pha cân ngày thứ 20 Còn môi trường MWC, pha cân quần thể Arcella gibbosa kéo dài không lâu, mật độ quần thể Arcella gibbosa môi trường MWC đạt đỉnh vào ngày thứ 12 thí nghiệm, đến ngày thứ 15 có dấu hiệu giảm nhẹ giảm tiếp vào ngày thứ 20, quần thể bước vào pha suy thoái Sở dĩ có khác biệt lồi sinh vật có phản ứng khác trước mơi trường sống khác lồi Arcella gibbosa khơng phải ngoại lệ So sánh mật độ loài Arcella gibbosa theo thời gian trình sinh trưởng (Hình 4) hay theo mật độ ngày thứ 15 thí nghiệm (Hình 4), kết cho thấy khác mật độ môi trường nuôi cấy Trong mơi trường nước cất với gạo mật độ trung bình ngày thứ 15 quần thể Arcella gibbosa (589±312 tb/ml) cao có ý nghĩa thống kê (n = 50; P < 0,001) so với môi trường MWC (249±139 tb/ml) Trong mơi trường nước cất với gạo, lồi Arcella gibbosa có tăng sinh số lượng tốt so với mơi trường MWC tính theo mốc thời gian q trình thí nghiệm Tạp chí Khoa học Công nghệ nhiệt đới, Số 30, 12-2022 153