Nghiên cứu khoa học công nghệ NGHIÊN CỨU BIỂU HIỆN ENDO-GLUCANASE TÁI TỔ HỢP NGUỒN GỐC TỪ DNA METAGENOM VI KHUẨN DẠ CỎ DÊ Ở QUY MƠ BÌNH LÊN MEN LÍT ĐÀO TRỌNG KHOA (1) , ĐỖ THỊ HUYỀN (1) , TRƯƠNG NAM HẢI (1) ĐẶT VẤN ĐỀ Cellulose vật liệu có cấu trúc đa phân nguồn gốc thực vật, thành phần polysaccharide phong phú Trái đất Cellulose có cơng thức cấu tạo (C6H10O5)n Khối lượng phân tử cellulose lớn (khoảng 000 000-2 400 000 đvC), tùy thuộc vào giá trị n Giá trị n thể số lượng đơn phân phụ thuộc vào loại nguyên liệu cellulose Thông thường, chuỗi cellulose thành tế bào thực vật nói chung có khoảng 5000-7000 đơn phân Các đơn phân β-D-glucose liên kết với liên kết β-1,4-glucoside tạo thành chuỗi thẳng Nhóm hydroxyl chuỗi tạo liên kết hydro với phân tử oxy chuỗi bên cạnh (liên kết hydro liên phân tử) chuỗi (liên kết hydro nội phân tử) hình thành cấu trúc vi sợi Cellulose dạng tinh thể tạo thành nhờ liên kết β-1,4-glycoside mạch polysaccharide, liên kết hydro lực Van der Waal mạch polysaccharide vi sợi gần Cấu trúc cellulose tinh thể không cho phép enzym hay chất hóa học tiếp cận với liên kết nội phân tử, bảo đảm tính bền tinh thể cellulose nói chung [2] Để chuyển hóa cellulose thành đường đơn glucose cần có phối hợp nhiều loại enzym gọi chung cellulase, bao gồm ba loại endo-glucanase (endo-1,4-β-glucanase, EC 3.2.1.4), exo-glucanase (exo-1,4-βglucanase, EC 3.2.1.91) β-glucosidase (cellobiase, EC 3.2.1.21) Trong ba loại trên, endo-glucanase coi enzym quan trọng enzym xúc tác phản ứng phân cắt ngẫu nhiên mạch dài cellulose tạo oligo-saccharide với đầu không khử mới, tiền đề cho enzym exo-glucanase β-glucosidase hoạt động [1] Trong khu hệ sinh thái thủy phân cellulose nói riêng lignocellulose nói chung, nhiều lồi vi khuẩn nấm có khả thủy phân lignocellulose hoạt động tương hỗ lẫn để chuyển hóa phân tử cấu trúc bậc cao dạng tinh thể không tan thành phân tử đơn giản hòa tan, cụ thể cellobiose, glucose đường đơn khác, sử dụng làm nguyên liệu tế bào Hầu hết vi sinh vật có khả phân giải cellulose vi khuẩn nấm, có số nghiên cứu phát số lồi động vật ngun sinh yếm khí nấm nhầy có khả phân hủy cellulose [14] Vi sinh vật phân hủy cellulose thiết lập mối quan hệ hữu với lồi khơng có khả phân hủy cellulose khu trú môi trường Mối tương tác lẫn quần xã sinh vật sở để quần xã phân giải hồn tồn cellulose, giải phóng carbon dioxit nước điều kiện hiếu khí, carbon dioxit, methan nước điều kiện yếm khí [5] Ở Việt Nam, endo-glucanase nghiên cứu tách dòng hầu hết từ nguồn gốc nấm từ Trichoderma asperellum [13], Aspergillus niger [10], Aspergillus awamori [8], bên cạnh số nghiên cứu biểu endo-glucanase có nguồn gốc vi khuẩn Clostridium thermocellum [9], hay từ DNA metagenom hệ Tạp chí Khoa học Công nghệ nhiệt đới, Số 26, 12 - 2022 125 Nghiên cứu khoa học công nghệ vi khuẩn ruột mối [7] Trong khuôn khổ đề tài Nghị định thư Việt Nam - CHLB Đức “Nghiên cứu sản xuất số enzym phân hủy lignocellulose sở khai thác liệu metagenom”, mã số: NĐT.50.GER/18, tách dòng gen endoglucanase khai thác từ liệu DNA metagenom hệ vi khuẩn cỏ dê Việt Nam biểu thành công dạng tái tổ hợp vi khuẩn E coli điều kiện bình tam giác Để nâng cao hiệu sản xuất làm tiền đề cho sản xuất quy mô lớn, tiến hành nghiên cứu biểu endo-glucanase hệ thống lên men lít Nghiên cứu mở đường cho việc mở rộng quy mô sản xuất endo-glucanase tái tổ hợp quy mơ cơng nghiệp, góp phần chuyển giao sản phẩm từ nghiên cứu đến sản xuất VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1 Vật liệu 2.1.1 Vector chủng vi sinh vật Vector pET22b(+) biểu protein tái tổ hợp endo-glucanase tổng hợp nhân tạo hãng Genscript (Hoa Kỳ) ký hiệu pET22_EG5 Chủng E coli Rosetta1 (DE3) (Merck, Đức) mang vector pET22_EG5 tạo phòng Kỹ thuật di truyền, viện Công nghệ Sinh học 2.1.2 Môi trường biểu Chủng vi khuẩn mang gen tái tổ hợp biểu môi trường LB (cao nấm men (0,5%), bacto tryton (1%), NaCl (1%), bổ sung kháng sinh ampicilline đến nồng độ 100 µg/ml) 2.2 Phương pháp Chuẩn bị lít mơi trường LB hệ thống lên men lít Khử trùng tồn hệ thống mơi trường điều kiện thích hợp để chuẩn bị lên men Cấy chủng giống gốc E coli mang pET22b(+)_EG5 bình tam giác 500 ml chứa 50 ml mơi trường LB bổ sung ampicilline đến 100 µg/ml, ni lắc qua đêm nhiệt độ 37°C, tốc độ lắc 180 vịng/phút Sục khí với lượng lít khí/lít mơi trường/phút (vvm) khuấy với tốc độ 180 vòng/phút phút để bão hịa nguồn oxy mơi trường trước lên men Đo OD600 dịch nuôi cấy chủng qua đêm, từ bổ sung chủng vào hệ thống lên men cho OD600 ban đầu khoảng 0,05 Điều kiện lên men ban đầu nhiệt độ 37°C, pH mơi trường khoảng 6,0-7,0, độ sục khí vvm tốc độ khuấy 180 vòng/phút Lấy mẫu đo kiểm tra mật độ tế bào dịch nuôi cấy sau 30 phút Sau khoảng 30 phút, OD600 đạt khoảng 0,4÷0,5 bắt đầu hạ nhiệt độ nuôi cấy xuống 25°C Bổ sung chất cảm ứng IPTG đến nồng độ cuối 0,05 mM để cảm ứng trình sinh tổng hợp endo-glucanase Tiếp tục kiểm tra mật độ tế bào theo thời gian sau cảm ứng Mẫu lấy trình lên men dừng lại thời điểm sau cảm ứng Sinh khối tế bào sau trình lên men đo OD600 để xác định mật độ tế bào ly tâm tốc độ 5000 vòng/phút 10 phút để loại bỏ môi trường trước bảo quản -20°C 126 Tạp chí Khoa học Cơng nghệ nhiệt đới, Số 26, 12 - 2022 Nghiên cứu khoa học công nghệ 2.2.2 Kiểm tra protein tái tổ hợp SDS-PAGE Sinh khối tế bào hịa nước deion vơ trùng cho OD600 10 500 µl dịch tế bào xử lý sóng siêu âm cường độ cao khoảng 100200 lần, lần phóng sóng siêu âm khoảng 0,5 giây, thời gian nghỉ lần phóng sóng siêu âm khoảng 0,5 giây Dịch tế bào sau siêu âm coi mẫu protein tổng số, đồng thời dịch ly tâm tốc độ 8000 vòng/phút 10 phút 4°C để tách riêng hai pha tan khơng tan Mẫu biến tính 100°C 10 phút điện di gel polyacrylamid 12,6% 2.2.3 Tinh chế enzym endo-glucanase sắc ký lực His-tag 10 ml dịch tế bào OD600 ~20 phá tế bào sóng siêu âm điều kiện lạnh (4°C) phút với quy trình giây phóng sóng siêu âm, giây nghỉ Sau đó, dịch ly tâm 13000 vòng/phút 10 phút, thu pha tan Một lần thể tích đệm PBS 2X pH chứa imidazol 40 mM bổ sung vào dịch tế bào Dịch tan lọc qua màng 0,45 µm Dịch lọc đưa lên cột sắc ký lực Hi-trap ml cân với 25 ml đệm bám cột (PBS 1x pH 7, 500 mM NaCl, 20 mM imidazol) với tốc độ dòng ml/phút, thu dịch chảy từ cột để kiểm tra mức độ bám enzym (F) Rửa cột 25 ml đệm rửa (PBS 1x pH 7, 500 mM NaCl, 75 mM imidazol), thu dịch Đẩy enzym EG5 khỏi cột 25 ml đệm thu mẫu (PBS 1x pH 7, 500 mM NaCl, 200 mM imidazol), thu enzym theo phân đoạn ml Rửa protein cịn sót lại cột 15 ml đệm rửa (PBS 1x pH 7, 500 mM NaCl, 500 mM imidazol), thu dịch Cân cột đệm bám cột trước lặp lại lần tinh chế Điện di protein kiểm tra phân đoạn tinh chế gel SDSPAGE 12,6% Các phân đoạn chứa EG5 đậm gộp lại chuyển vào túi thẩm tích có kích thước lỗ màng cut-off 10 kDa Mẫu thẩm tích đệm PBS 1x pH 7, q trình thẩm tích, đệm thẩm tích trì điều kiện lạnh (4°C) có khuấy từ nhẹ Dịch sau thẩm tích bổ sung glycerol khử trùng đến nồng độ cuối 10% để bảo quản 2.2.4 Định lượng protein phương pháp Bradford Lượng protein mẫu nghiên cứu định phương pháp Bradford theo hướng dẫn nhà cung cấp dung dịch Bradford (5000006, Biorad) Hút 800 µl mẫu cần xác định nồng độ vào ống Eppendorf (chú ý: mẫu protein pha loãng cho sau ủ phản ứng, cường độ màu đo nằm dải đường chuẩn) Sau bổ sung thêm 200 µl dung dịch Bradford reagent 5X vào ống Trộn ủ phản ứng nhiệt độ phòng phút Đo cường độ màu phản ứng bước sóng 595 nm Nồng độ protein mẫu tính tốn dựa vào phương trình đường chuẩn thiết lập nồng độ BSA (0 10 µg/ml) với bước sóng đo 595 nm Chú ý, mẫu lặp lại lần Blank mẫu sử dụng dH2O thay cho dịch protein Tạp chí Khoa học Công nghệ nhiệt đới, Số 26, 12 - 2022 127 Nghiên cứu khoa học cơng nghệ Hình Đường chuẩn biểu thị phụ thuộc nồng độ BSA cường độ màu đo bước sóng 595 nm 2.2.5 Xác định hoạt tính enzym endo-glucanase Phản ứng thực dựa phương pháp đo độ hấp thụ màu dung dịch DNS (DNSA 1%, NaOH 0,25 M, NaHSO3 0,05%, sodium-potassium tartrat 0,645 M) [6] Mỗi mẫu phản ứng gồm 50 µl PBS 10X pH 4, 125 µl CMC 2%, µL MnCl2 500 mM, 274 µl dH2O 50 µl enzym EG5 (2 µg/ml) Phản ứng enzym chất diễn 30 phút 50oC Sau 30 phút ủ, bổ sung 500 l DNSA vào ống Mẫu đối chứng có thành phần tương tự mẫu đo hoạt tính khác 50 l mẫu chứa enzym cho vào sau bổ sung DNSA Ủ hỗn hợp 100oC 15 phút đo OD540 Đo độ hấp thụ bước sóng 540 nm, mẫu lặp lại lần Độ hấp thụ so sánh với đường chuẩn glucose để xác định hàm lượng glucose ống phản ứng Hình Đường chuẩn biểu thị phụ thuộc nồng độ glucose cường độ màu đo bước sóng 540 nm Một đơn vị hoạt tính (IU) enzym lượng endo-glucanase cần thiết để giải phóng mol glucose phút điều kiện đo 128 Tạp chí Khoa học Cơng nghệ nhiệt đới, Số 26, 12 - 2022 Nghiên cứu khoa học công nghệ KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Lên men chủng E coli mang pET22(b)_EG5 hệ thống lên men lít Trước nghiên cứu biểu EG5 quy mơ bình lên men, chủng E coli biểu EG5 tái tổ hợp nghiên cứu xây dựng quy trình biểu tinh protein quy mơ bình tam giác Cụ thể, EG5 biểu chủng E coli mang vector pET22b(+)_EG5 môi trường LB bổ sung ampicilline đến nồng độ cuối 100 µg/ml, ni lắc nhiệt độ 37°C với tốc độ lắc 180 vòng/phút Protein EG5 cảm ứng biểu thời điểm mật độ tế bào dịch nuôi cấy đạt OD600 khoảng 0,5-0,6 với nồng độ chất cảm ứng 0,05 mM IPTG Sau cảm ứng, chủng biểu tiếp tục nuôi lắc nhiệt độ 25°C, tốc độ lắc không đổi vịng Dựa quy trình biểu protein EG5 tái tổ hợp thiết lập quy mơ bình tam giác, chủng biểu lên men hệ thống lên men lít Ở hai lần lên men hệ thống lên men lít, với mơi trường LB, pH mơi trường ban đầu 6,79 6,75 Các thông số tốc độ khuấy 180 vịng/phút, tốc độ sục khí lít khí/lít mơi trường/phút, nhiệt độ biểu 37°C trì tự động hệ thống điều khiển Đây điều kiện tiêu chuẩn để nuôi cấy vi khuẩn E coli sử dụng nhiều nghiên cứu trước Kết xây dựng đường cong sinh trưởng theo dõi pH môi trường nuôi cấy chủng biểu EG5 tái tổ hợp hệ thống lên men thể hình Kết đo OD600 mật độ tế bào để xây dựng đường cong sinh trưởng cho thấy, chủng biểu EG5 tái tổ hợp sinh trưởng tương đối chậm khoảng thời gian đầu, giá trị OD600 nằm khoảng 0÷0,6, thời gian này, pH môi trường nuôi cấy gần trì tương đối khoảng pH acid 5,7÷5,9 Sau khoảng ni cấy, OD600 dịch nuôi cấy tế bào đạt đến ngưỡng giá trị cảm ứng (0,5÷0,6), chất cảm ứng IPTG bổ sung vào môi trường nuôi cấy đồng thời nhiệt độ ni cấy giảm xuống cịn 25°C Trong vịng sau cảm ứng, chủng biểu sinh trưởng nhanh, thể độ dốc lớn biểu đồ đường cong sinh trưởng Chủng biểu tiếp tục sinh trưởng với tốc độ chậm hơn, thể thông số giá trị OD600 tiếp tục tăng đến tận thời điểm thu mẫu (7 sau cảm ứng), điều chất dinh dưỡng mơi trường cịn chưa sử dụng hết OD600 thời điểm thu mẫu khoảng 4,5, cao khoảng 25-30% so với OD600 mẫu biểu điều kiện bình tam giác pH mơi trường sau cảm ứng có xu hướng tăng dần, chứng tỏ trình sinh tổng hợp EG5 làm tăng lượng chất có tính kiềm tiết ngồi mơi trường Tạp chí Khoa học Cơng nghệ nhiệt đới, Số 26, 12 - 2022 129 Nghiên cứu khoa học công nghệ Hình Đường cong sinh trưởng chủng tái tổ hợp EG5 thay đổi pH môi trường biểu lần lên men 3.2 Kết kiểm tra khả biểu protein tái tổ hợp EG5 hai lần lên men Tế bào chủng biểu sau kết thúc trình lên men thu hồi phương pháp ly tâm Tất dịch tế bào ly tâm 5000 vòng/phút 10 phút để thu sinh khối tế bào, phần nhỏ điện di gel SDS-PAGE để kiểm tra khả biểu protein EG5 Hình Kết kiểm tra biểu EG5 gel SDS-PAGE 12,6% 130 Tạp chí Khoa học Cơng nghệ nhiệt đới, Số 26, 12 - 2022 Nghiên cứu khoa học công nghệ Ghi chú: Đường chạy (-): chủng E coli Rosetta mang vector pET22b(+) không mang gen eg5; M: thang protein chuẩn (#SM0431, Fermentas); TS, T KT: protein pha tổng số, pha tan, pha không tan chủng tái tổ hợp mang vector pET22_EG5 Protein tái tổ hợp biểu chủng chủ cần kiểm tra xem chúng tồn dạng tan hay dạng không tan Sau màng tế bào biểu phá vỡ sóng siêu âm, tồn protein nội bào giải phóng, phần protein tan không tan phân thành hai pha tác dụng lực ly tâm Pha tan pha không tan điện di biến tính gel SDS-PAGE Kết điện di protein hình băng protein EG5 có kích thước khoảng 78 kDa biểu gần hồn tồn pha tan mà khơng xuất pha không tan Băng enzym pha tan pha tổng số đậm tương đương (mẫu TS T) Trong đó, pha khơng tan khơng có băng enzym (mẫu KT) Điều chứng tỏ điều kiện lên men kiểm soát tốt, thông số lên men thiết lập từ quy trình lên men quy mơ lượng nhỏ áp dụng cho bình lên men quy mơ lít phù hợp Nghiên cứu nghiên cứu bước đầu để ứng dụng đưa việc biểu endo-glucanase tái tổ hợp từ quy mơ phịng thí nghiệm vào điều kiện sản xuất quy mô lớn 3.3 Tinh chế protein EG5 cột sắc ký lực His-tag Như trình bày phần quy trình, enzym tái tổ hợp EG5 biểu từ chủng chủ tinh sắc ký lực his-tag sử dụng đệm PBS 1x, pH chứa nồng độ imidazol cao 200 mM Kết tinh chế hai lần điện di kiểm tra gel SDS-PAGE 12,6% Hình Ảnh minh họa enzym EG5 tinh chế từ dịch tổng số pha tan lần tinh chế khác cột sắc ký lực his-tag Ghi chú: M: thang protein chuẩn (#SM0431, Fermentas); S: protein tổng số pha tan; F: dịch thu đưa mẫu lên cột sắc ký; W1 W2: dịch rửa cột thu từ đệm PBS 1x (pH 7) chứa imidazol có nồng độ 75 500 mM; E1-E10: phân đoạn thu enzym đệm PBS 1x (pH 7) chứa imidazol nồng độ 200 mM Tạp chí Khoa học Công nghệ nhiệt đới, Số 26, 12 - 2022 131