BÁO CÁO KHOA HỌC VỀ NGHIÊN CỨU VÀ GIẢNG DẠY SINH HỌC Ở VIỆT NAM HỘI NGHỊ KHOA HỌC QUỐC GIA LẦN THỨ 5 DOI 10 15625/vap 2022 0093 PHƯƠNG PHÁP MULTIPLEX PCR MỚI TRONG PHÁT HIỆN CÁC CÁ THỂ MANG KIỂU GENE[.]
BÁO CÁO KHOA HỌC VỀ NGHIÊN CỨU VÀ GIẢNG DẠY SINH HỌC Ở VIỆT NAM - HỘI NGHỊ KHOA HỌC QUỐC GIA LẦN THỨ DOI: 10.15625/vap.2022.0093 PHƯƠNG PHÁP MULTIPLEX PCR MỚI TRONG PHÁT HIỆN CÁC CÁ THỂ MANG KIỂU GENE GÂY CHẾT THAI TRÊN ĐÀN HEO THƯƠNG PHẨM TẠI CÁC TRẠI PHÍA NAM VIỆT NAM Nguyễn Mai Nghiệp1, Lê Minh Thơng2, Nguyễn Thế Anh3, Bùi Phú Nam Anh4,* Tóm tắt Hiện tượng chết lưu thai heo vấn đề lớn ngành chăn nuôi Để giải vấn đề này, nghiên cứu trước thường tập trung vào dinh dưỡng, sức khỏe heo mẹ môi trường chuồng trại Gần đây, nghiên cứu chết thai bệnh di truyền Bệnh gây đột biến 600 kb gene TL9 nhiễm sắc thể số 18 heo Với cá thể dị hợp tử mang đột biến đoạn trên, chương trình kiểm sốt phép lai phối giống nhằm giảm thiểu tần suất xuất allele đột biến đàn, xác suất để hệ mang kiểu gene đồng hợp tử lặn del/del 25 % Do đột biến đoạn phát phương pháp RNA-Seq, khả tầm soát cá thể mang kiểu gene dị hợp cần phương pháp nhanh kinh tế để áp dụng vào thực tiễn Ở nghiên cứu này, thiết lập thành cơng quy trình Multiplex PCR nhằm phát cá thể mang kiểu gene dị hợp TL9 Nghiên cứu cho thấy, ba giống heo thương phẩm khảo sát, kết nghiên cứu rằng, giống heo thương phẩm khảo sát, giống heo Yorshire, Landrace Duroc có tần suất dị hợp tử đàn tương ứng %, % % Nghiên cứu cho thấy, cần tiếp tục khảo sát với số lượng mẫu lớn để xác định tỉ lệ cá thể dị hợp tử đàn, từ xác định phép lai thích hợp tương ứng Từ khóa: Duroc, landrace, multiplex PCR, thai chết, TL9, Yorshire ĐẶT VẤN ĐỀ Gần đây, nghiên cứu dựa tính đa hiệu gene (một gene ảnh hưởng đến nhiều tính trạng chiều trái chiều) cho thấy số đột biến gene lặn gây chết trạng thái đồng hợp tử, lại có ảnh hưởng tích cực đến số lượng thai sống tốc độ sinh trưởng cá thể mang cặp gene dị hợp tử Điển hình số đột biến lặn gây chết thai gene TL9 Theo trang thông tin liệu NCBI, gene TL9 có vị trí nằm NC_010460.4 (39663720 40394244) nhiễm sắc thể số 18, kích thước gene TL9 khoảng 730 kb Nghiên cứu Derks cs (2018) đột biến đoạn 600 kb gây chết thai chúng mang kiểu gene đồng hợp tử del/del, đồng thời ảnh hưởng đa hiệu đến tốc độ sinh trưởng lượng thức ăn ăn vào cá thể heo mang kiểu gene TL9 dị hợp tử Trong quần thể heo Large White Hà Lan, tần suất allele nghiên cứu nhân giống khoảng thời gian 18 năm ảnh Trường Đại học Nơng Lâm Thành phố Hồ Chí Minh Trường Đại học Quốc tế, Đại học Quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh Phân viện Chăn ni Nam Bộ, Viện Chăn nuôi Quốc gia Trường Đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh * Email: anh.bpn@ou.edu.vn PHẦN NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG SINH HỌC PHỤC VỤ ĐỜI SỐNG VÀ PHÁT TRIỂN XÃ HỘI 837 hưởng gây chết chúng trạng thái đồng hợp tử lặn Ở thập kỷ trước, tần số allele có hại cao chủ yếu trôi dạt di truyền từ việc tái tổ hợp ngẫu nhiên kiểu gene, suốt giai đoạn này, khơng có thay đổi đáng kể áp lực chọn lọc áp dụng tính trạng sản xuất Trong nghiên cứu Derks cs (2018) gene TL9, tốc độ sinh trưởng tăng rõ rệt giai đoạn kiểm tra suất từ 25 - 120 kg tăng thức ăn tiêu thụ đột biến chức đưa đến trạng thái dị hợp tử kiểu gene TL9 Lý giải tượng này, tác giả cho biết protein TL9 tham gia vào tổ hợp protein (protein complex) BBSome bao gồm 14 protein từ BBS1 đến BBS14 có vai trị quan trọng yếu tố di truyền (nhung mao) liên quan đến dẫn truyền tín hiệu hóa học (Novas cs., 2015) TL9 thành phần tổ chức trung tâm họ protein BBSome, có tương tác trực tiếp với BBS1, 2, (Klink cs., 2017) Ở người, đột biến chức TL9 thành viên khác BBSome gây hội chứng Bardet-Biedl (hội chứng BBS), bệnh di truyền ảnh hưởng đến nhiều phận thể với triệu chứng thị lực tiến triển, dị tật thừa ngón, béo phì vùng thân, thiểu sinh dục nam, bất thường thận học tập khó khăn Các nghiên cứu đưa giả thiết đột biến đóng góp vào biểu kiểu quan sát Như vậy, gene TL9, câu hỏi đặt nhân tố điều hòa nguyên nhân gây chết sớm cá thể mang cặp gene đột biến lặn trạng thái đồng hợp tử (del/del) Các nghiên cứu cho đột biến đoạn tạo trạng thái đồng hợp tử lặn dẫn tới việc hoàn toàn chức gene TL9 làm giảm biểu gene BMPER (gene mã hóa Protein) việc tác động lên yếu tố tăng cường BMPER (Bone Morphogenetic Protein Binding Endothelial Regulator) Chính yếu tố tăng cường đóng vai trị quan trọng q trình phiên mã việc yếu tố tăng cường dẫn đến làm giảm biểu gene liên kết (Kulaga et al., 2004) Vấn đề gene TL9, nhiều tác giả đưa giả thuyết đột biến đoạn ảnh hưởng làm giảm yếu tố tăng cường BMPER từ làm giảm biểu gene BMPER trạng thái đồng hợp tử Trong nghiên cứu Derks cs (2018), tác giả ủng hộ quan điểm đột biến đoạn ảnh hưởng đến yếu tố điều hòa BMPER dẫn đến cân allele gene BMPER vật mang gene Do vậy, chức điều hòa gene BMPER giảm xuống nghiêm trọng xem nguyên nhân gây chết thai cá thể mang kiểu gene đột biến trạng thái đồng hợp tử lặn (del/del) (Funari et al., 2010) Về việc điều tiết, cân allele đột biến lặn có ảnh hưởng đa hiệu chọn giống vật nuôi, kết nghiên cứu Derks cs (2018) ví dụ bật chọn lọc cân allele lặn gây chết đột biến đoạn 600kb gene TL9 mang lại hiệu tốt giống heo Large White Do đó, cần trì allele đột biến lặn tần số quần thể nhằm khai thác hiệu ảnh hưởng đa hiệu chúng đến khả thụ thai tốc độ sinh trưởng trạng thái dị hợp tử Đồng thời, kiểu gene TL9 cá thể bố, mẹ cần phân tích làm sở cho việc xây dựng chương trình ghép phối đàn giống hạt nhân đàn bố mẹ với mục tiêu trì allele lặn gây chết (del) trạng thái dị hợp tử tránh kiểu gene dị hợp tử gây chết thai Cách tiếp cận đồng nghĩa với việc tăng số sơ sinh sống/ổ tăng tốc độ sinh trưởng lợn sau sinh, đặc biệt giai đoạn sinh trưởng từ 25 - 120 kg BÁO CÁO KHOA HỌC VỀ NGHIÊN CỨU VÀ GIẢNG DẠY SINH HỌC Ở VIỆT NAM 838 Các nghiên cứu gần cho thấy đột biến đoạn 600 kb gene TL9 làm giảm đến 20 % tổng số heo sơ sinh sống đàn giống Large White Tuy vậy, kiểu gene lại có ảnh hưởng tích cực đến khả thụ thai tốc độ sinh trưởng sau sinh cá thể mang kiểu gene dị hợp tử Do vậy, việc phân tích xác định kiểu gene cá thể bố, mẹ xây dựng chương trình ghép phối nhằm tránh tạo kiểu gene đồng hợp tử gây chết phôi thai hướng tiếp cận có ý nghĩa việc cải thiện nâng cao số đẻ sống/ổ tốc độ sinh trưởng chúng sau sinh, đặc biệt giai đoạn từ 25 - 110 kg PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Thu mẫu máu ly trích DNA Nghiên cứu tiến hành đàn giống nuôi giữ trại heo giống Bình Minh, Cơng ty Khang Minh An, HTX Đồng Hiệp tỉnh Đồng Nai, có nguồn gốc nhập từ Đài Loan, Đan Mạch Canada Trong giai đoạn khảo sát từ năm 2021 đến năm 2022, tổng số 423 cá thể, bao gồm 223 cá thể giống Yorshire, 100 cá thể giống Duroc 100 cá thể giống Landrace lấy mẫu khảo sát nhằm phân tích kiểu gene TL9 Các bước tiến hành bao gồm thu thập mẫu máu (3-5 mL) tĩnh mạch cổ (sau sát trùng cồn 70o) cho vào ống nghiệm có chứa EDTA, lắc nhẹ chuyển phịng thí nghiệm để tách chiết DNA Kit GeneJet Whole Blood Geneomic DNA Purification (Thermo Fisher Scientific) Nồng độ DNA kiểm tra máy đo quang phổ bước sóng OD 260/280 Mẫu DNA sau bảo quản -20 oC phân tích kiểu gene 2.2 Thiết kế mồi Multiplex PCR Hình Thiết kế mồi Multiplex PCR để phát kiểu gene TL9 Hình phía trên: Mồi F1 R1 dùng để khuếch đại allele a đột biến bị 600 kb Hình phía dưới: Mồi F2 R1 dùng để khuếch đại allele A nguyên thủy Phân tích kiểu gene TL9 kỹ thuật Multiplex PCR, sử dụng cặp mồi thiết kế phần mềm Primer Vị trí ba mồi thiết kế hình nhằm phát allele đột biến allele kiểu dại Trình tự mồi sau: Mồi F1: 5’- TACCCT GACCATCTTGATTG -3’, Mồi F2: 5’ AGTGTAGCCAGAGCATCT 3’, Mồi R1: 5’ ACCACATCTGCACACTCA 3’ Phản ứng PCR gồm: 100 - 500 ng DNA, 200 µM PHẦN NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG SINH HỌC PHỤC VỤ ĐỜI SỐNG VÀ PHÁT TRIỂN XÃ HỘI 839 dNTP, 1,5 mM MgCl2, 0,5 µl Tq polymerase, 10 pM mồi 1x PCR buffer tổng thể tích cuối 25 µl Chu trình nhiệt sau: 94 oC phút; 35 chu kỳ gồm: 94 oC 30 giây, 58 oC 30 giây, 72 oC 30 giây; cuối 72 oC phút hệ thống Gene Amp PCR System Sau kiểm tra kết PCR điện di gel agarose % nhuộm với TBR hiệu điện 150 V 45 phút MultiSUB midi, quan sát đèn cực tím máy ghi hình ảnh gel điện di GelDoc-It2 (UVP, Mỹ) để nhận diện allele Kiểu gene TL9 xác định dựa có mặt đoạn khuếch đại 745 bp allele A nguyên thủy; đoạn khuếch đại 581 bp allele a đột biến 2.3 Giải trình tự Các kiểu gene TL9 bao gồm A (kiểu dại) a (đột biến) khuếch đại riêng rẽ thực kiểm tra thông qua điện di gel Agarose % với hiệu điện 100 V 30 phút Sau đối chiếu kích thước với thang chuẩn đánh giá độ tinh định lượng tương đối nồng độ DNA, mẫu khuếch đại allele TL9 A TL9 a gửi giải chiều trình tự Viện Cơng nghệ ADN Phân tích di truyền (GENELAB – Việt Nam) Kết giải trình tự so sánh chất lượng peak tín hiệu với trình tự tương ứng trước so sánh với liệu GeneBank (NCBI - Mỹ) Thông qua công cụ BLAST, kiểu gene so sánh với trình tự cơng bố trước GeneBank KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 3.1 Tần suất kiểu gene Aa đàn Kết khảo sát tần số kiểu gene 423 cá thể từ đàn giống Yorshire, Landarce Duroc trình bày Bảng Kết nghiên cứu cho thấy đàn heo giống Duroc, tỷ lệ allele a có hại % Điều phù hợp với tác giả Derks et al (2018) tác giả cho đột biến đoạn 600 kb khơng xuất nhóm giống Duroc Landrace (trao đổi cá nhân) Tuy nhiên, nghiên cứu chúng tơi cho thấy nhóm giống Landrace có allele a dù tỷ lệ thấp (2 %) Ở nhóm giống Yorshire, nghiên cứu tác giả Derks et al (2018) cho tần số allele a cao kết (chiếm 10,84 % so với %) Sự khác biệt lý giải thơng qua số mẫu Nghiên cứu Derks et al (2018) sử dụng 23.722 cá thể Yorkshire, nghiên cứu sử dụng số mẫu 223 Chúng hy vọng với số mẫu tầm soát cao hơn, tần số kiểu gene Aa dự báo xác Đây nghiên cứu thực Việt Nam khảo sát mặt di truyền gây nên tượng chết thai heo Sự diện cá thể mang kiểu gene dị hợp Aa cho thấy khơng có kế hoạch tầm sốt hiệu allele a có hại, thiệt hại kinh tế gây nên trại giống lớn Đối với heo đực dùng làm giống, cần phải tầm soát kiểu gene TL9 trước phối giống Nếu kiểu gene heo đực Aa, cần tiến hành xác định kiểu gene TL9 cá thể heo nái nhằm giảm thiểu phép lai Aa x Aa heo đực heo nái 840 BÁO CÁO KHOA HỌC VỀ NGHIÊN CỨU VÀ GIẢNG DẠY SINH HỌC Ở VIỆT NAM Bảng Tần suất cá thể mang kiểu gene dị hợp giống heo thương phẩm khảo sát Giống Tổng số cá Số cá thể mang kiểu Phần trăm số cá thể mang kiểu gene dị heo thể gene dị hợp tử hợp tử đàn khảo sát Duroc 100 0% Landrace 100 2% Yorshire 223 11 5% 3.2 Hiệu phương pháp Multiplex PCR việc phát allele a gene TL9 So với phương pháp PCR truyền thống với mức thời gian cần thiết từ đến 3,5 để hồn thành chu trình ln nhiệt, phương pháp Multiplex cần khoảng 1,5 để hoàn thành Tuy nhiên so với phương pháp PCR truyền thống, Multiplex PCR yêu cầu cao việc thiết kết trình tự mồi tối ưu hóa phản ứng chu trình nhiệt Cụ thể, thiết kế mồi, đặc biệt ý đến phần tương thích hai mồi, khả khuếch đại giống Tm mồi, kích thước sản phẩm PCR Đối với tối ưu hóa phản ứng PCR, chúng tơi tối ưu hóa cặp mồi chạy phản ứng PCR, sau chúng tơi xác định tỷ lệ tối ưu kết hợp ba mồi phản ứng PCR Bước kế tiếp, xác định nhiệt độ tối ưu cho ba mồi điều kiện phản ứng cho Multiplex PCR Sau khuếch đại gene TL9 thành cơng, cá thể có kiểu gene AA cho băng PCR có kích thước 745 bp Đối với cá thể thai lưu có kiểu gene aa, cho băng PCR có kích thước 581 bp Đối với cá thể dị hợp tử Aa, cho băng PCR có kích thước 745 bp 581 bp (Hình 2) Sau khuếch đại gene TL9 thành cơng, chúng tơi tiến hành giải trình tự sản phẩm PCR nhằm xác nhận trình khuếch đại gene TL9 Kết giải trình tự cho thấy tín hiệu đỉnh (peak) đạt yêu cầu, điều chứng tỏ mồi sử dụng phản ứng PCR nhân allele đơn lẻ hiệu băng có kích thước nghiên cứu khuếch đại từ gene TL9 (Hình 3) Nghiên cứu cho thấy phương pháp Multiplex PCR dùng để phát TL9 cho kết nhanh, kinh tế hiệu Hình Xác định kiểu gene AA, Aa aa gene TL9 PHẦN NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG SINH HỌC PHỤC VỤ ĐỜI SỐNG VÀ PHÁT TRIỂN XÃ HỘI 841 Hình Kết giải trình tự allele A (phía trên) a (phía dưới) gene TL9 KẾT LUẬN Trong báo này, lần xác định tần suất kiểu gene TL9 giống heo thương phẩm Yorshire, Landrace Duroc Kết đạt cho thấy giống Yorshire Landrace có diện cá thể dị hợp tử đàn Để ước lượng xác tỷ lệ cá thể dị hợp tử đàn, đề nghị cần tiếp tục khảo sát với số lượng mẫu lớn để biết xác tỷ lệ cá thể dị hợp tử đàn, từ xác định phép lai thích hợp tương ứng Ngồi ra, chúng tơi thiết lập quy trình xác định kiểu gene TL9 phương pháp Multiplex PCR với mồi tự thiết kế TÀI LIỆU THAM KHẢO Derks, M F L., M S Lopes, M Bosse, O Madsen, B Dibbits, B Harlizius, M A M Groenen and H J Megenes, 2018 Balancing selection on a recessive lethal deletion with pleiotropic effects on two neighboring genes in the porcine geneome PLoS Genet 14(9): e1007661 BÁO CÁO KHOA HỌC VỀ NGHIÊN CỨU VÀ GIẢNG DẠY SINH HỌC Ở VIỆT NAM 842 Funari, V A., D Krakow, L Nevarez, Z Chen, T L Funari, N Vatanavicharn, W R Wilcox, D L Rimoin, S F Nelson and D H Cohn, 2010 BMPER Mutation in Diaphanospondylodysostosis Identified by Ancestral Autozygosity Mapping and Targeted High-Throughput Sequencing The American Journal of Human Genetics 87(4): 532-537 Klink, B U., E Zent, P Juneja, A Kuhlee, S Raunser and A Wittinghofer, 2017 A recombinant BBSome core complex and how it interacts with ciliary cargo Elife Kulaga, H M., C C Leitch, E R Eichers, J L Badano, A Lesemann, B E Hoskins, J R Lupski, P L Beales, R R Reed and N Katsanis, 2004 Loss of BBS proteins causes anosmia in humans and defects in olfactory cilia structure and function in the mouse Nature Genetics 36(9): 994-998 Novas, R., M Cardenas-Rodriguez, F Irigoín and J L Badano, 2015 Bardet–Biedl syndrome: Is it only cilia dysfunction? FEBS Letters 589(22): 3479-3491 A NOVEL MULTIPLEX POLYMERASE CHAIN REACTION METHOD FOR THE IDENTIFICATION OF MUMMUFIED PIGLETS GENOTYPE CARRIERS IN COMMERCIAL PIGS IN THE SOUTH OF VIETNAM Nguyen Mai Nghiep1, Le Minh Thong2, Nguyen The Anh3, Bui Phu Nam Anh4,* Abstract Mummufied piglets are widely considered a serious problem in pig breeding It has been recently discovered that a 600 kb deletion in the TL9 gene located at chromosome 18 in the pig geneome This mutation produces a truncated protein which leads to a malfunctional TL9 protein A consequence of this deletion is the reduction of born number of piglets In this study, we successfully developed a novel single-tube multiplex PCR assay to identify the recessive allele of TL9 We used this technique to detect TL9 alleles in a total of 223 commercial pigs (Yorshire, Landrace and Duroc breeds) Among them, 13 carriers were found (11 in Yorshire breed and in Landrace breed) Our method provides not only a reliable, economic, and practical diagnostic technique for TL9 carrier detection, but also a method to TL9 geneotype detection and a monitoring system for the genetic improvement for pig breeding Keywords: Duroc, landrace, multiplex PCR, mummified piglets, TL9, Yorshire Nong Lam University, Ho Chi Minh City International University, Vietnam National University, Ho Chi Minh City Institute of Animal Science for Southern Vietnam Ho Chi Minh City Open University * Email: anh.bpn@ou.edu.vn