Xác định gen basidiomycetes laccase trên đất rừng nam cát tiên bằng phương pháp đo lường

Science & Technology Development, Vol 16, No.T3- 2013 Ứng dụng kỹ thuật metagenomics để nhận diện gene mã hóa laccase nấm Basidiomycetes mẫu đất rừng Nam Cát Tiên  Hoàng Quốc Khánh Viện Sinh học Nhiệt đới, Viện Hàn Lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam  Nguyễn Bích Ngọc Đại học Quốc gia Tp Hồ Chí Minh (Bài nhận ngày 02 tháng 04 năm 2013, nhận đăng ngày 10 tháng năm 2013) TÓM TẮT Theo số cơng trình nghiên cứu có khoảng 0,1-1% vi sinh vật phát từ việc ni cấy truyền thống, cịn lại 99% vi sinh vật môi trường tự nhiên chưa phát chủ yếu chúng khó ni cấy nuôi cấy Nghiên cứu vi sinh vật mà không cần thông qua bước nuôi cấy mục tiêu hướng tới nghiên cứu đa dạng vi sinh đại Nghiên cứu thực theo hướng metagenomics nhằm khảo sát đa dạng gen laccase nấm mẫu đất rừng Nam Cát Tiên bao gồm bước thí nghiệm đơn giản, nhanh chóng, chi phí thấp ly trích tinh DNA trực tiếp từ đất, sử dụng cặp mồi thối hóa Cu1F/Cu2R đặc trưng cho nấm đảm, tạo dịng phân tích trình tự thư viện gen laccase Chúng thành công nhận diện gen laccase từ mẫu thu Từ khóa: metagenomics, laccase, Nam Cát Tiên, phương pháp troughing MỞ ĐẦU Các nghiên cứu trước tiếp cận gen di truyền sinh vật đất chủ yếu thông qua việc nuôi cấy chúng mơi trường lỏng rắn có chứa cacbon, lượng, nguồn cho nhận điện tử với điều kiện vật lý thích hợp; từ phân lập chúng thành chủng riêng biệt điều kiện phòng thí nghiệm Tuy nhiên điều kiện phịng thí nghiệm gây áp lực chọn lọc, dẫn tới hạn chế tăng trưởng phần lớn sinh vật dựa vào đặc điểm vật lý, hình thái đơn giản chúng khó phân biệt rõ ràng Để khắc phục vấn đề nhà khoa học sử dụng nhiều chiến lược phân lập trực tiếp Trang 60 dựa vào phát sinh loài Các nhà sinh thái, sinh học phân tử với trợ giúp vector tạo dòng cosmid, fosmid BACs cung cấp thông tin vô giá sinh vật nuôi cấy, cung cấp DNA trọng lượng phân tử lớn ly trích từ mẫu để xây dựng thư viện metagenomic, dịng giải trình tự đem phân tích, so sánh [8, 9, 12, 13] Việc giải trình tự RNA ribosom gen mã hóa chúng từ xác định, mơ tả chủng sinh vật phát hiện, chủng thu phương pháp nuôi cấy, khởi đầu thời kì sinh thái vi sinh Những thơng tin gen RNA TẠP CHÍ PHÁT TRIỂN KH&CN, TẬP 16, SỐ T3 - 2013 sở để nhà nghiên cứu xây dựng chiến lược nghiên cứu thích hợp nghiên cứu tiến hóa chúng Stahl cộng (1984) nhóm nghiên cứu Lane (1985) sử dụng phân tích trực tiếp trình tự gen 16S rRNA để mô tả đa dạng vi sinh vật mẫu môi trường mà không dùng phương pháp cấy khuẩn, phân tích 16S rRNA hoạt động độc lập diện 13.000 sinh vật nhân sơ [8] Mặc dù có tiềm khoa học phát huy tiếp cận metagenomics cách thức để đạt kết cịn vấn đề khó khăn cần tiếp tục hoàn thiện Một đối tượng nghiên cứu nhiều gần metagenomic Laccase – loại enzyme oxy hóa khử ứng dụng phổ biến ngành công nghiệp tìm thấy thực vật, nấm, số vi khuẩn côn trùng Việc nghiên cứu laccase đối tượng thực vật nấm phổ biến Laccase từ nấm nghiên cứu khảo sát kỹ đặc biệt laccase từ nấm đảm Basidiomycetes Trong vài thập kỷ gần đây, gen sinh tổng hợp laccase bắt đầu nghiên cứu Tính có 100 gen sinh tổng hợp laccase đánh giá so sánh Laccase có phổ đặc hiệu chất rộng Laccase hoạt động tối thích khoảng pH 4-6 chất phenolic Khi tăng pH sang vùng trung tính vùng kiềm hoạt tính laccase giảm Nhiệt độ bền laccase dao động đáng kể, phụ thuộc vào nguồn gốc vi sinh o vật Laccase bền 30-50 C hoạt tính o nhiệt độ 60 C Laccase bền nhiệt phân lập chủ yếu từ loài thuộc prokaryote Laccase (p-benzenediol: oxygen oxidoreductase, E.C.1.10.3.2) thuộc nhóm enzyme oxidase, cụ thể polyphenol oxidase Trong phân tử có chứa nguyên tử đồng có khả oxy hóa chất sử dụng phân tử oxy làm chất nhận điện tử Khác với phần lớn enzyme khác, laccase có phổ chất đa dạng, bao gồm diphenol, polyphenol, dẫn xuất phenol, diamine, amine thơm, benzenethiol, PCB (Polychlorinated biphenyl), dioxin hợp chất vô iot Các loại enzyme laccase tách chiết từ nguồn khác khác mức độ glycosyl hóa, khối lượng phân tử tính chất động học Từ tảng báo tập trung vào vấn đề khảo sát đa dạng gen laccase nấm với mẫu đất rừng tự nhiên Nam Cát Tiên qua bước đầu đề quy trình khảo sát đa dạng gen cụ thể theo hướng metagenomics để từ phát triển hồn thiện quy trình vào mục tiêu khảo sát đa dạng gen laccase VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP Mẫu đất vi sinh vật Mẫu đất lấy ngẫu nhiên nơi từ rừng quốc gia Nam Cát Tiên đánh số 1, 2, Mẫu đất phần đất bề mặt lớp mục Khi lấy mẫu ta gạt bỏ lớp mục để lộ bề mặt lớp đất dùng thìa lấy phần đất bề mặt cho vào túi ni lơng, bảo quản thùng xốp có chứa đá lạnh Phương pháp nghiên cứu Phương pháp xác định hoạt tính enzyme laccase từ đất rừng Nam Cát Tiên Dựa phản ứng laccase chất chất thử ABTS sử dụng để xác định xem đất có vi sinh vật sản xuất enzyme laccase khơng, hoạt tính cao hay khơng [1, 11] Chuẩn bị dịch Chuẩn bị 50 mM dịch đệm acetate pH 5: trộn 50 ml dịch acetat 1M (8,2 g/100 ml) với 950 ml H2O (điều chỉnh pH HCl tới pH=5); buffer o bảo quản C, kiểm tra pH xử dụng điều chỉnh cần; chuẩn bị ABTS 5mM sử dụng nước cất 25 – 50 ml Trang 61 Science & Technology Development, Vol 16, No.T3- 2013 Chuẩn bị mẫu Ly trích DNA Mẫu đất 2,75 g; trộn đất với 91 ml đệm Na acetate 50 mM (pH đất); đồng với máy trộn phút, ngưng trộn lắc trịn để loại bỏ đất bị dính mép, đánh tan thêm phút; đổ dịch vào bình giữ lạnh sử dụng Thu nhận DNA trực tiếp bước khó đất chứa nhiều thành phần phức tạp vô lẫn hữu có đất Ngồi đất có tồn DNA sinh vật chết Các thành phần đất liên kết chặt chẽ lỏng lẻo, phối hợp với thành mạng lưới hốc giữ DNA Thu nhận DNA tổng mẫu đất cần tiến hành qua nhiều bước liên quan chặt chẽ với nhau, bước phá màng tế bào để ly giải DNA phương pháp phá màng tế bào phương pháp vật lý, hóa học [3] Dựa oxi hóa ABTS (2,2'-azino-bis 3ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) laccase thành hợp chất hấp thụ ánh sáng mạnh bước sóng 420 nm Một đơn vị hoạt độ laccase lượng enzyme cần thiết để tạo thành μM sản phẩm từ ABTS thời gian phút, điều kiện thí nghiệm (Bảng 1) Bảng Tỉ lệ thành phần phản ứng thí nghiệm đo hoạt tính laccase Thành phần Đối chứng (ml) Thí nghiệm (ml) Đệm acetate (50mM), pH 2, 1,8 Dịch đất 0,6 0,6 ABTS (5mM) 0,6 Tổng thể tích 3 Tính hoạt độ Phản ứng xảy cho ABTS vào hỗn hợp (nhiệt độ phòng) Giá trị OD đo sau phút Cơng thức tính: Trong đó: U: Hoạt độ enzym (U/l), ε: Hệ số hấp thụ ánh sáng bước sóng 420nm, ε= 36.000 (M-1cm-1) Vpu: Tổng thể tích phản ứng (3 ml), VE: Thể tích enzyme (1 ml), ODt: Giá trị OD đo thời điểm t ODo: Giá trị OD đo thời điểm t = 0, Df: Độ pha loãng, t: Thời gian phản ứng Tất thí nghiệm đo với độ pha lỗng lần Trang 62 DNA ly trích trực tiếp từ mẫu đất mà không qua bước phân lập nuôi cấy tế bào: 13,5 ml lysis buffer, 100 µl lysozyme cho vào 5g mẫu, o ủ 30 phút 37 C; thêm ml SDS 10%, ủ o 30 phút 65 C; ly tâm 7000 vòng phút o C, thu dịch nổi, thêm chloroform/isoamyl alcohol (tỷ lệ 24/1) vào mẫu với tỉ lệ 1:1 Ly tâm o 6500 vòng 10 phút C, thu dịch nổi; thêm isopropanol vào mẫu với tỉ lệ thể tích 3/5, ly tâm 13000 vịng 30 giây nhiệt độ phòng, thu tủa; dùng cồn 70o lạnh rửa tủa; hịa tủa với 200 µl TE Tinh DNA Các nghiên cứu phương pháp thu nhận DNA từ đất có chung kết luận DNA sau thu cần qua bước tinh để loại bỏ hết tạp chất axit humic, chất hữu trình ly trích DNA cịn sót lại [3] Nghiên cứu cho thấy đất chứa nhiều thành phần gây ức chế phản ứng PCR axit humic, chúng ức chế phản ứng enzyme [6, 10] Trong phạm vi nghiên cứu tinh phương pháp troughing, quy trình sau: Lựa chọn genomic DNA tách chiết trực tiếp từ đất cách tiến hành chạy điện di gel TAE agarose (0,8% - 1%); quan sát băng DNA gel tia UV Sau dùng dao cắt gel tạo thành giếng kích thước 0,5 – TẠP CHÍ PHÁT TRIỂN KH&CN, TẬP 16, SỐ T3 - 2013 1cm chiều dài phụ thuộc vào kích thước băng DNA, thêm dung dịch đệm 25 – 30% PEG 8000 vào đầy giếng; chạy điện di 30 phút để DNA thu vào giếng; tập hợp DNA vào eppendorf; thêm vào chloroform : isoamyl alcohol (24:1 v/v) với thể tích với dịch chiết DNA thu từ giếng, ly tâm 12000 vòng 4oC vòng 10 phút, thu dịch nổi; thêm µl glycogen (10mg/ml) 50 µl sodium acetate 3M vào eppendorf trộn Thêm vào 1ml cồn lạnh kết tủa DNA nhiệt độ - 80oC vòng 25 phút; ly tâm 12000 rpm vòng 15 phút nhiệt độ 4oC thu tủa; rửa tủa DNA cồn lạnh 70%; để khô khoảng phút nhiệt độ phòng thêm vào 35 µl TE Phương pháp điện di Nhằm mục đích kiểm tra chất lượng mẫu DNA thu được, nhóm sử dụng phương pháp chạy điện di DNA gel agarose 0,8% 1% thời gian 30 phút điện 100 V cường độ 50 mA với tỉ lệ mẫu µl mẫu với µl dung dịch nạp mẫu giếng thạch Chọn mồi thối hóa đặc biệt cho gen laccase Từ nghiên cứu D'Souza (1996) [5], báo lựa chọn vùng Cu1F, Cu2R để sử dụng chọn cặp mồi cho phản ứng PCR nhằm phân lập vùng thối hóa gen laccase Phản ứng PCR đề tài thực với mồi Cu1F (5’CAT(C) TGG CAT(C) GGN TTT(C) TTT(C) CA- 3’) Cu2R (5’GG(A)CT GTG GTA CCA GAA NGT NCC-3’) PCR Phản ứng PCR tiến hành với điều kiện: µl DNA thêm vào 50 µl hỗn hợp phản ứng bao gồm µl 10 x Taq đệm MgCl2 (QBIOgen, Heidelberg, Germany), µl dNTPs (10mM lần), µl primer (60 µM), 0,2 µl polymerase Taq DNA Hỗn hợp phản ứng phủ lên giọt dầu vô trùng PCR chạy hệ thống gradien vòng Master (Eppendorf, Hamburg, Germany) với vòng khởi đầu biến tính (30s 94oC), tiếp tục (30s 50oC) kéo dài (2 phút 72oC), chu kì kéo dài cuối (10 phút 72oC) Kiểm tra sản phẩm PCR phương pháp điện di agarose 1% với thang đo BenchTop (Promega, Madison) Các gel nhuộm chụp ảnh Trình tự DNA phân tích trình tự Sản phẩm PCR biến nạp tạo dòng kit TOPO TA Cloning Invitrogen Các sản phẩm nhân dòng gửi giải trình tự cơng ty Macrogen Các trình tự nucleotid thu từ mẫu đất xử lý chương trình Bioedit kiểm tra ngân hàng gen DNA thuật tốn tìm Gapped BlastN (NCBI) KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Xác định hoạt tính laccase Mẫu đất rừng Nam Cát tiên thu vị trí khác điều kiện nhiệt độ, khí hậu (mẫu thu vào mùa mưa) Mỗi mẫu đất tiến hành đo lần lấy kết trung bình Theo cơng thức tính phần phương pháp, sau tính toán ta giá trị U(U/l) Bảng Bảng Hoạt tính enzyme laccase mẫu đất STT Mẫu đất ODt U (U/l) Mẫu số 0,039 1,81 Mẫu số 0,037 1,71 Mẫu số 0,046 2,13 Trang 63 Science & Technology Development, Vol 16, No.T3- 2013 Từ Bảng cho thấy mẫu đất có laccase hoạt tính khơng cao < U/l Mặc dù thí nghiệm cho thấy có đổi màu dung dịch tương tác laccase thuốc thử ABTS, khẳng định có mặt laccase môi trường tự nhiên không nhiều, khẳng định lại kết thí nghiệm trước hoạt tính laccase nấm Ectomycorehizal (Muenzenberger cộng (1997), Gramss cộng (1998))… [6, 7] Trong nghiên cứu này, mẫu đo chuẩn bị nhờ hòa lẫn đất với dung dịch đệm Na acetate để enzyme đồng vào dung dịch Nhìn chung so với DNA, enzyme thường bền môi trường tế bào mẫu đất thu nhận bảo quản 4oC thời gian chờ xử lý tiến hành đo hoạt tính làm ảnh hưởng tới kết thí nghiệm Số liệu đo thấp chứng tỏ laccase có bền bên ngồi mơi trường khu lấy mẫu Laccase chủ yếu có loại nấm phân hủy lignin, xuất nhóm sinh vật khác Dù kết đủ để biểu thị cho diện laccase mẫu đất rừng Nam Cát Tiên Việc đo hoạt tính laccase giúp loại bỏ mẫu đất không chứa laccase, giảm bớt thời gian nghiên cứu Thu nhận DNA từ mẫu đất rừng Nam Cát Tiên Ba mẫu DNA thu từ phương pháp ly trích nói tube DNA có màu vàng đất, mẫu chạy điện di gel agarose 0,8% để kiểm tra chất lượng mẫu Kết thu băng DNA đậm nét rõ ràng DNA tổng số nhiều sinh vật khác Các băng có dạng dải dài với nhiều kích thước khác (Hình 1) Nghiên cứu sử dụng lysozyme, chất tẩy rửa SDS, kết thu tốt phương pháp dễ thực rẻ tiền, DNA bị đứt gãy Trang 64 Tinh DNA Hình cho thấy có vệt mờ gel ngồi vạch DNA sáng, chứng tỏ DNA tổng số thu từ bước ly trích lẫn nhiều tạp chất Mặc dù DNA thu có hàm lượng tốt bước tinh DNA cần thiết để chuẩn bị cho phản ứng PCR Hình thể DNA tổng số chạy gel 0,8% sử dụng phương pháp troughing để thu DNA Các giếng cắt trước DNA tổng số đoạn kích thước x 0,5 cm, chứa đầy dung dịch PEG 8000 30% DNA chạy cực dương qua giếng bị dung dịch giữ lại giếng DNA tổng số tạp chất axit humic Hình Kết điện di DNA tổng số ly trích từ mẫu đất 1, 2, Mẫu điện di với thể tích 5l thời gian 30 phút điện 100V Các băng DNA mẫu cho kích thước khác chụp đánh dấu vòng elip Sau giai đoạn điện di tạp chất bị tách khỏi DNA tổng số Vấn đề lại xử lý dung dịch PEG hòa lẫn DNA tổng số số thao tác kỹ thuật để có DNA tinh DNA tinh thu đem chạy điện di để kiểm tra chất lượng DNA sử dụng với thể tích µl cho giếng Kết cho thấy phương pháp troughing cho kết tốt, băng DNA rõ nét khơng cịn vệt mờ Hình Các băng DNA cịn đầy đủ kích thước mẫu DNA ban đầu Số lượng DNA thu hồi đủ nhiều để sử dụng tiến hành bước phân tích TẠP CHÍ PHÁT TRIỂN KH&CN, TẬP 16, SỐ T3 - 2013 (a) DNA cần tinh DNA tinh (b) Giếng thu DNA Hình Tinh DNA phương pháp troughing 1,2,3: mẫu 1, 2, tương ứng a: băng DNA mẫu 1, 2, tương ứng, b: giếng thạch khoét để thu DNA phương pháp troughing Phản ứng PCR Vấn đề thu gen laccase phương pháp khuếch đại nghiên cứu thuộc hướng metagenomics bước có tính định thành cơng thí nghiệm Tùy thuộc vào nghiên cứu cặp mồi, điều kiện phản ứng PCR lựa chọn phù hợp Đánh giá cặp mồi sử dụng Mồi thối hóa sử dụng nên sản phẩm PCR thu đoạn gen laccase trình tự kích thước tương tự nhiều cá thể sinh vật khác đoạn DNA sản phẩm có kích thước khác Sản phẩm PCR kiểm tra phương pháp điện di gel agarose 1% có chạy kèm thang đo kích thước cho kết Hình Kết mẫu số số cho băng DNA kích thước khoảng 100 tới 140 bp Mẫu số khơng có DNA Điều hồn toàn phù hợp với số nghiên cứu trước đa dạng gen laccase Nghiên Hình DNA sau tinh chạy điện di với thể tích 5µl 20 phút điện 100V cho kích thước băng DNA rõ ràng khơng cịn vệt mờ 1,2,3: mẫu 1, 2, tương ứng; vòng tròn đánh dấu băng DNA cứu Luis (2004) trước sử dụng cặp mồi tương tự cho kết đoạn laccase PCR thu có kích thước nhỏ khoảng 100 bp tới 400 bp [11], băng có ý nghĩa nghiên cứu có kích thước khoảng 100 bp tới 200 bp Kích thước sản phẩm PCR tương đương khiến cho băng DNA thể hình điện di dày, đậm khơng sắc nét (Hình 4) Tiến hành dịng hóa sản phẩm PCR thu Kit Topo (InVitrogen): Sản phẩm PCR mẫu chèn vào vector tạo dòng pCR-XL-TOPO chứa gen kháng kháng sinh Kanamicin sau biến nạp vào tế bào E coli Cuối tế bào cấy trải đĩa petri thời điểm, có nồng độ kháng sinh tương tự Các dịng chứa plasmid có đoạn DNA chèn vào gen kháng kháng sinh Kanamicin hoạt động khuẩn lạc mọc đĩa cấy, dịng khơng có plasmid có đoạn DNA chèn vào bị loại bỏ Trang 65 Science & Technology Development, Vol 16, No.T3- 2013 M M 500 bp 200 bp 100 bp Sản phẩm PCR Hình Kết PCR mẫu 1, 2, tương ứng với cặp mồi Cu1F/Cu2R 1, 2, 3: mẫu 1, 2, tương ứng; M: marker, Mẫu 1, cho băng DNA rõ ràng dày nhiều so với vạch marker, mẫu số cho băng DNA mờ, không đáng kể Khuẩn lạc thu PCR dịch khuẩn lạc với mồi laccase Tuy nhiên kết phản ứng cho mẫu dương tính, mẫu khác khơng có sản phẩm PCR (Hình 6) Sản phẩm PCR có kích thước khoảng 100 bp ~130 bp phù hợp với dự a Sản phẩm PCR mẫu số chèn vào vector tạo dòng biến nạp vào E coli sau cấy mơi trường chứa Kanamicin, cho khuẩn lạc đốn ban đầu kích thước đoạn gen laccase sử dụng mồi Cu1F, Cu2R Như có đoạn gen có khả laccase dịng hóa, dịng khác chứa đoạn DNA ngẫu nhiên b Sản phẩm PCR mẫu số chèn vào vector tạo dịng biến nạp vào E coli sau cấy môi trường chứa Kanamicin cho 13 khuẩn lạc Hình Kết biến nạp Trang 66 Ba mẫu DNA thu từ phản ứng PCR cho mẫu số mẫu số có kết tốt, mẫu số mờ khơng đáng kể khó xác định tồn sản phẩm PCR Mẫu số số tạo dòng, kết thực nghiệm mẫu cho khuẩn lạc, mẫu số cho 13 khuẩn lạc Tổng cộng thu 14 khuẩn lạc (Hình 5) TẠP CHÍ PHÁT TRIỂN KH&CN, TẬP 16, SỐ T3 - 2013 M N1 N2 N3 N4 N5 N N7 N8 M N9 N10 N11 N12 N13 N14 Giếng điện di 200 bp 200 bp 100 bp 100 bp a b Hình Sản phẩm PCR khuẩn lạc mồi laccase chạy điện di để kiểm tra, kết cho thấy mẫu N1, N7 N10 có vạch DNA khoảng 100 tới 140bp, mẫu khác khơng có DNA Giải trình tự khuẩn lạc nói thu trình tự nucleotid tương ứng Khi so sánh trình tự N1, N7, N10 với trình tự laccase lấy từ Genbank, kết cho thấy mẫu có chứa trình tự bảo tồn, nhiên độ tương đồng với trình tự laccase chưa cao So sánh với nghiên cứu trước đó, nhóm laccase thu thuộc nhóm Basidiomycetes có đa dạng chủng loại, độ tương đồng tới 60 tới 100% [4, 5] Các nhóm laccase thu đem so sánh cho tương đồng với trình tự Genbank từ khoảng 50 tới 80%; phân tích cơng cụ BLAST trang web NCBI cho kết sau: Mẫu N1: Khi phân tích cơng cụ Blast kết cho thấy mức độ bao phủ mẫu N1 trình tự Lachancea kluyveri, Moniliophthora perniciosa, Neurospora crassa lớn 80% độ bao phủ tạo thành liền lạc từ đầu 5’ đến đầu 3’ mẫu N1 (Hình 7) sản phẩm PCR tạo hai mồi, sản phẩm tạo dòng từ DNA tự đất có nguồn gốc nấm Trang 67 Science & Technology Development, Vol 16, No.T3- 2013 a b c Hình Kết so sánh trình tự cơng cụ Blast NCBI mẫu N1 b, c: Độ bao phủ liền mạch từ đầu 5’ tới 3’ N1 với số trình tự so sánh Trang 68 TẠP CHÍ PHÁT TRIỂN KH&CN, TẬP 16, SỐ T3 - 2013 a Mẫu N7: Mức độ bao phủ mẫu N7 trình tự với Marssonina brunea, Puccinia triticina, Talaromyces stipitatus… nhóm khác khoảng 20 tới nhỏ 40% (Hình 8) Hình 8b, c cho thấy có số nucleotid khác đoạn so sánh mẫu (các gap) b C Hình Kết Blast N7 NCBI Độ bao phủ với số nu sai khác (gap) từ đầu 5’ tới 3’ N7 với số trình tự so sánh Trang 69 Science & Technology Development, Vol 16, No.T3- 2013 Mẫu N10: Mức độ bao phủ mẫu N10 trình tự với Verticillium albo-atrum, Microbotrvum violaceum, Trichoderma atroviride nhóm khác nhỏ 30% (Hình 9) Hình 9b cho thấy có số nucleotid khác đoạn so sánh mẫu (các gap) a b Hình Kết Blast N10 NCBI Độ bao phủ với số nu sai khác (gap) từ đầu 5’ tới 3’ N10 với số trình tự so sánh Từ kết trình tự mẫu N7, N10 có độ bao phủ thấp đạt 40% nên sản phẩm khuếch đại ký sinh Mẫu N1 có độ bao phủ khoảng 87% với đoạn trình tự liền lạc, có khả sản phẩm tạo dòng từ DNA tự đất có nguồn gốc từ nấm Thực tế thu mẫu đất từ kết blast cho trình tự bao phủ nhiều với mẫu trình tự nucleotide nhóm nấm Basidiomycetes nên nhóm đề tài lựa chọn Trang 70 trình tự laccase nấm Basidiomycetes Genbank để phân tích Tuy nhiên liệu laccase nhóm chưa nhiều hầu hết không rõ ràng mặt phân loại, danh tính lồi nên khó khăn việc phân tích để xác định, kết phân tích cho thấy khả N1 trình tự laccase loại nấm đất rừng Nam Cát Tiên (Hình 10, Hình 14) TẠP CHÍ PHÁT TRIỂN KH&CN, TẬP 16, SỐ T3 - 2013 Vùng bắt cặp Cu2R Vùng bắt cặp Cu1F Hình 10 Sắp gióng cột trình tự laccase nấm trình tự N1 Vùng bắt cặp Cu1F Vùng bắt cặp Cu2R Hình 11 Sắp gióng cột trình tự laccase nấm trình tự N7 Vùng bắt cặp Cu1F Hình 12 Sắp gióng cột trình tự laccase nấm trình tự N10 Vùng bắt cặp Cu1F Vùng bắt cặp Cu2R Hình 13 Sắp gióng cột trình tự nucleotide laccase nhóm nấm Basidiomycete (chưa xác định tên cụ thể) Trang 71 Science & Technology Development, Vol 16, No.T3- 2013 Vùng bắt cặp Cu1F Vùng bắt cặp Cu2R Hình 14 Sắp gióng cột N1và nhóm Kết thực nghiệm cho thấy cá thể mang N1, N7, N10 chứa trình tự bảo tồn laccase nhiên phân tích chương trình Bioedit độ tương đồng với nhóm laccase tìm Genbank N7 N10 không cao nên chưa thể kết luận có phải laccase hay khơng, cịn mẫu N1 đoạn gen laccase loại nấm mẫu đất mẫu đất, tinh mẫu DNA phương pháp troughing KẾT LUẬN Tách dòng tế bào E coli mang sản phẩm PCR nói xác định dịng chứa gen laccase cần tìm Tuy dịng E coli biến nạp tạo chưa nhiều số hạn chế mặt điều kiện tiến hành thí nghiệm nghiên cứu bước đầu thành công việc phân lập trực tiếp gen laccase từ mẫu đất để khảo sát độ đa dạng theo hướng nghiên cứu metagenomics Nghiên cứu cho phép nhóm nghiên cứu đưa số kết luận sau: Kiểm chứng có mặt sinh vật sinh laccase mẫu đất rừng Nam Cát Tiên phương pháp đo hoạt tính laccase trực tiếp từ đất với chất thử ABTS Sử dụng thành công phương pháp metagenomics: thu nhận DNA trực tiếp từ Trang 72 Thu nhận đoạn gen laccase có kích thước khoảng 140 bp (nhỏ 300 bp dự đốn) PCR, thu dịng sản phẩm DNA tinh có chất lượng tốt, kết điện di kiểm chứng cho băng DNA rõ ràng sắc nét TẠP CHÍ PHÁT TRIỂN KH&CN, TẬP 16, SOÁ T3 - 2013 Identification of Basidiomycetes laccase genes in Nam Cat Tien forest soil by metagenomics  Hoang Quoc Khanh Institute of Tropical Biology  Nguyen Bich Ngoc Viet Nam National University of Ho Chi Minh City ABSTRACT It was reported that there were 0.1 – 1% microorganism discovered by traditional cultivation, 99% others were not known cause of difficuties or impossible for growing in labratory’s conditions Studying on microorganisms without culture was an aim of modern microbiology diversity This research was used metagenomics method to access the diversity of laccase genes of mushrooms in Nam Cat Tien forest soil The technique was simple, fast and cheap such as extracting and purifing DNA directly from soil, cloning by using retrograde primers and analyzing sequences of genes library We have identified successfully laccase-like gene from samples collected in Nam Cat Tien forest TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] Đào Thị Ngọc Ánh, Nghiên cứu phân loại, khả phân hủy DDT sinh laccase chủng nấm sợi phân lập từ đất hỗn hợp ô nhiễm thuốc trừ sâu, Luận văn thạc sỹ (2009) [2] Nguyễn Hoài Giang, Nguyễn Xuân Hùng, Trịnh Tam Kiệt, Lê Đình Lương, Nghiên cứu khả phân loại chi Ganoderma kỹ thuật phân tử RAPD-PCR mồi đặc hiệu laccase, Tạp chí Di truyền học Ứng dụng, (2005) [3] D.W Cullen, P.R Hirsch, Simple and rapid method for direct extraction of microbial DNA from soil for PCR, Soil Biol Biochemical, 30: 983-993 (1998) [4] D.M Chen, A.B.Brigitte, F.S.T Andrew, W.G.C John, Identification of laccase-like genes in ectomycorrhizal basidiomycetes and transcriptional regulation by nitrogen in Piloderma byssinum, New Phytologist 157, 547-554 (2003) [5] T.M D'Souza, K Boominathan, C.A Reddy, Isolation of Laccase Gene-Specific Sequences from White Rot and Brown Rot Fungi by PCR, Appl Environ Microbiology, 62, 3739 (1996) [6] P Harnpicharnchai, T Thonggaram, R Sriprang, V Champreda, S Tanapongpipat, L Eurwilaichitr, An efficient purification and fractionation of genomic DNA from soil by modified troughing method, The Society for Applied Microbiology, 45, 387-391 (2007) [7] B Helmut, P Manuel, W Franco, Z Josef, A strategy for optimizing quality and Trang 73 Science & Technology Development, Vol 16, No.T3- 2013 quantity of DNA extracted from soil, Journal of Microbiological Methods, 45, 7-20 (2001) [8] S Jagtar, B Arvind, S Neha, J Amit, B Niti, S Sukhdeep, B Vandana, B Navneet, Metagenomics: Concept, methodology, ecological inference and recent advances, Biotechnology Journal, 4, 480-494 (2009) [9] A Knietsch, T Waschkowitz, S Bowien, A Henne et al., Construction and screening of metagenomics libraries derived from enrichment cultures: Generation of a gene bank for genes conferring alcohol oxidoreductase activity on Escherichia coli., Appl Environ Microbiology, 69, 1408–1416 (2003) Trang 74 [10] P Luis, G Walther, H Kellner, F Martin, F Buscot, Diversity of laccase genes from basidiomycetes in a forest soil, Soil Biology & Biochemistry, 36, 1025-1036 (2004) [11] D.N Miller, J.E Bryant, E.L Madsen, W.C Ghiorse, Evaluation and optimization of DNA extraction and purification procedures for soil and sediment samples, Appl Environ Microbiology, 65, 4715–4724 (1999) [12] W.R Streit, R Daniel, Metagenomics: Methods and Protocols, Humana Press (2010) [13] S Voget, C Leggewie, A Uesbeck, C Raasch et al., Prospecting for novel biocatalysts in a soil metagenome, Appl Environ Microbiology, 69, 6235–6242 (2003)  ... thị cho diện laccase mẫu đất rừng Nam Cát Tiên Việc đo hoạt tính laccase giúp loại bỏ mẫu đất không chứa laccase, giảm bớt thời gian nghiên cứu Thu nhận DNA từ mẫu đất rừng Nam Cát Tiên Ba mẫu... mặt lớp đất dùng thìa lấy phần đất bề mặt cho vào túi ni lơng, bảo quản thùng xốp có chứa đá lạnh Phương pháp nghiên cứu Phương pháp xác định hoạt tính enzyme laccase từ đất rừng Nam Cát Tiên Dựa... rừng Nam Cát Tiên phương pháp đo hoạt tính laccase trực tiếp từ đất với chất thử ABTS Sử dụng thành công phương pháp metagenomics: thu nhận DNA trực tiếp từ Trang 72 Thu nhận đo? ??n gen laccase