3517(6) 6 2017 Khoa học Nông nghiệp Mở đầu Konjac (Amorphophallus konjac) là một loài trong chi Nưa (Amorphophallus) thuộc họ Ráy (Araceae) Củ Nưa konjac có chứa glucomannan, một loại đường polysachar[.]
Khoa học Nơng nghiệp Nhân giống in vitro lồi Nưa konjac (Amorphophallus konjac) Việt Nam để bảo tồn phục vụ sản xuất Trần Văn Tiến1,2*, Nguyễn Văn Dư3, Nguyễn Công Sỹ3, Hà Văn Huân4, Nguyễn Minh Quang4 Học viện Hành Quốc gia Học viện KH&CN, Viện Hàn lâm KH&CN Việt Nam Viện Sinh thái Tài nguyên sinh vật Trường Đại học Lâm nghiệp Ngày nhận 13/3/2017; ngày chuyển phản biện 20/3/2017; ngày nhận phản biện 17/4/2017; ngày chấp nhận đăng 21/4/2017 Tóm tắt: Nưa konjac (Amorphophallus konjac) lồi Nưa có giá trị kinh tế trồng nhiều nước giới Trung Quốc, Nhật Bản Củ Nưa konjac có chứa glucomannan nguyên liệu cho công nghiệp chế biến thực phẩm thực phẩm chức Ở Việt Nam, lồi Nưa konjac tìm thấy mọc tự nhiên số tỉnh phía Bắc Lào Cai, Hà Giang Hàm lượng glucomannan phân tích củ Nưa konjac Việt Nam 44,97% khối lượng khô, gần tương đương với giống Nưa konjac trồng Trung Quốc (hàm lượng khoảng 45-55%) Trong báo này, tác giả trình bày kết nhân giống in vitro loài Nưa konjac Việt Nam để bảo tồn phục vụ sản xuất Kết nghiên cứu cho thấy, chồi đỉnh khử trùng tốt sử dụng dung dịch Javen 60% (NaClO) 12 phút, tỷ lệ mẫu in vitro đạt 100%, tỷ lệ mẫu tái sinh đạt 100%, thời gian mẫu nảy chồi sau 15 ngày nuôi Công thức môi trường dinh dưỡng thích hợp để tái sinh chồi Nưa konjac in vitro MS + mg/l BAP + 0,2 mg/l Kinetin + g/l agar + 30 g/l sucrose, trung bình đạt 5,22 chồi/mẫu chiều cao trung bình chồi 3,84 cm, chất lượng chồi tốt Công thức môi trường rễ tốt 1/2 MS + g/l agar + 14 g/l sucrose + 0,4 mg/l IBA + g/l than hoạt tính, tỷ lệ chồi rễ đạt 100%, số rễ trung bình/chồi 4,98, chiều dài trung bình rễ đạt 2,67 cm, sau ngày nuôi chồi bắt đầu rễ Giá thể thích hợp cho trồng Nưa konjac in vitro 50% đất + 30% cát + 20% trấu hun, tỷ lệ sống cao đạt 94,07% (sau tuần trồng) Cây khỏe mạnh, sinh trưởng phát triển bình thường Từ khóa: Amorphophallus konjac, đỉnh sinh trưởng, nhân giống in vitro, tái sinh chồi Chỉ số phân loại: 4.6 Mở đầu Konjac (Amorphophallus konjac) loài chi Nưa (Amorphophallus) thuộc họ Ráy (Araceae) Củ Nưa konjac có chứa glucomannan, loại đường polysacharid tan nước [1] Các sản phẩm làm từ bột củ Nưa konjac có chứa đường glucomannan có nhiều tác dụng khác bổ sung dinh dưỡng, điều chỉnh nồng độ đường, làm giảm tỷ lệ mỡ máu, giảm thèm ăn người béo phì [1, 2] Với giá trị đường glucomannan, nhiều quốc gia giới (như Trung Quốc, Nhật Bản, New Zealand…) tiến hành trồng Nưa konjac với diện tích lên tới nhiều ngàn nhằm phát triển kinh tế Ở Trung Quốc, năm 1998 có khoảng 30 ngàn đất trồng Nưa konjac [3] Ở Nhật Bản từ năm 70 kỷ trước, hàng trăm Nưa konjac thu hoạch, đem nguồn lợi kinh tế gần tỷ yên [4] Ở Việt Nam, loài Nưa konjac tìm thấy mọc tự nhiên phía Bắc (Hà Giang, Lào Cai) Hàm lượng đường glucomannan phân tích từ mẫu củ năm tuổi thu hái tự nhiên phương pháp so màu M Chua cs đạt 44,97% trọng lượng khô Như vậy, hàm lượng glucomannan loài Nưa konjac Việt Nam cao gần tương đương với giống Nưa konjac có hàm lượng glucomannan cao trồng sản xuất Trung Quốc (hàm lượng glucomannan đạt 45-55% trọng lượng khô) [3] Ở tỉnh Hà Giang Lào Cai, người dân địa phương khai thác sử dụng loài để chế biến ăn truyền thống từ lâu đời, không bảo tồn định hướng phát triển nên số lượng cá thể loài Nưa konjac tự nhiên tỉnh ngày suy giảm Ngày nay, kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật áp dụng rộng rãi nhiều lĩnh vực, đặc biệt nhân nhanh bảo tồn loài thực vật quý hiếm, gống trồng có giá trị kinh tế cao Trong năm qua, nghiên cứu loài Nưa konjac tập trung chủ yếu đặc điểm sinh học, hóa học, chế biến bột glucomannan, tìm hiểu tri thức địa khai thác sử dụng củ chế biến thực phẩm thực phẩm chức tác Võ Văn Chi (1999), Đỗ Tất Lợi (2005), Nguyễn Văn Dư (2012) [5-7] Cho đến nay, chưa có Tác giả liên hệ: Email: vantienbvhn@gmail.com * 17(6) 6.2017 35 Khoa học Nông nghiệp In vitro propagation of Amorphophallus konjac species in Vietnam for conservation and production Van Tien Tran1,2, Van Du Nguyen3, Cong Sy Nguyen3, Van Huan Ha4, Minh Quang Nguyen4 National Academy of Public Administration (NAPA) Graduate University of Science and Technology (GUST), Vietnam Academy of Science and Technology (VAST) Institute of Ecology and Biological Resources (IEBR) Vietnam National University of Forestry (VNUF) Received 13 March 2017; accepted 21 April 2017 Abstract: Amorphophallus konjac is a species with high economic values; it is grown in some countries including China, Japan, and so on Glucomannan in the tuber of A konjac is a material for food industry and functional food processing In Vietnam, A konjac is found naturally growing in Ha Giang and Lao Cai provinces The content of glucomannan in tubers of Vietnamese A konjac is 44.97% (dry weight), nearly equal to that of the A konjac variety in China with 45-55% In this paper, we present the results of in vitro propagation of A konjac species in Vietnam for conservation and production The results showed that the top bud was sterilized effectively by using 60% sodium hypochlorite (NaOCl) in 12 minutes The pure rate of in vitro samples was 100%, the regenerated rate of clean samples was 100%, and the time for budding was after 15 days The best nutrient medium for bud regeneration of A konjac was: MS + mg/l BAP + 0.2 mg/l Kinetin + g/l agar + 30 g/l sucrose, the average number of buds was 5.22 buds per sample, and the average height of bud was 3.84 cm with high quality The best nutrient medium for rooting was 1/2 MS + g/l agar + 14 g/l sucrose + 0.4 mg/l IBA + g/l activated carbon, with the rooting rate of 100%, the average roots as 4.98 roots/shoot, the average length of roots as 2.67cm, after days of culture The most appropriate substrate for planting in vitro A konjac was 50% soil + 30% sand + 20% rice hull ash, which provided the highest survival rates at 94.07% After weeks of planting, the trees grew and developed normally Keywords: Amorphophallus konjac, apical meristems, bud regeneration, in vitro propagation Classification number: 4.6 17(6) 6.2017 nghiên cứu thực nhân giống ni cấy mơ tế bào lồi Nưa konjac Việt Nam nhằm bảo tồn phát triển loài có giá trị kinh tế Từ sở thấy, việc nghiên cứu nhân giống in vitro loài Nưa konjac Việt Nam để phục vụ bảo tồn sản xuất giống cần thiết Bài báo trình bày kết nhân giống in vitro loài Nưa konjac Việt Nam nhằm tạo số lượng lớn cá thể lồi có hàm lượng glucomannan cao bệnh đáp ứng nhu cầu sản xuất quy mô lớn Vật liệu phương pháp nghiên cứu Vật liệu Củ Nưa konjac (Amorphophallus konjac) thu huyện Phó Bảng, tỉnh Hà Giang Đoạn chồi đỉnh dài 2-3 cm chồi củ sử dụng để làm vật liệu nhân giống Hình Củ Nưa konjac Phương pháp nghiên cứu Các thí nghiệm bố trí theo kiểu ngẫu nhiên hồn tồn Số mẫu cơng thức thí nghiệm phải đủ lớn (≥ 30) Thí nghiệm lặp lại lần Kết nghiên cứu xử lý để thu giá trị trung bình phân tích Ducan’s test phần mềm SPSS 20.0 với mức xác suất có ý nghĩa α = 0,05 phần mềm Microsoft Office Excel 2007 Thời điểm thu thập số liệu sau tuần nuôi cấy Các mơi trường thí nghiệm chỉnh pH = 5,8, sau khử trùng 120oC thời gian 20 phút Các mẫu cấy nuôi điều kiện ánh sáng trắng 12 giờ/ngày, cường độ 3.000 lux, nhiệt độ 25-27oC Nghiên cứu tiến hành với thí nghiệm sau: Thí nghiệm - Ảnh hưởng hóa chất thời gian khử trùng đến khả tạo mẫu in vitro: Khử trùng mẫu: Đoạn chồi đỉnh dài 2-3 cm lấy từ chồi Nưa konjac, chọn chồi từ củ 2-3 năm tuổi, không thối, sức sống tốt Đoạn chồi đỉnh đựng ống phancol, lắc rửa mạnh nước dung dịch nước xà phòng để loại bỏ chất bẩn bám bề mặt Tiếp tục rửa 36 Khoa học Nông nghiệp nước cất vô trùng tủ cấy, lắc mạnh 1-2 phút để loại bỏ chất bẩn bám bề mặt, lặp lại lần Sau tiến hành rửa cồn 70% 30 giây rửa nước cất vô trùng (rửa lần) Sử dụng hóa chất HgCl2 0,1% để khử trùng 4-8 phút NaClO (Javel) 60% với thời gian 6-18 phút, sau rửa lại 4-5 lần nước cất vô trùng Cấy mẫu vào môi trường: Đoạn chồi đỉnh sau xử lý đưa vào đĩa vô trùng, dùng giấy thấm vô trùng để thấm khô nước bề mặt mẫu, sau tách lớp bao bọc bên ngồi, loại phần mơ tổn thương cắt thành đoạn cm cấy lên môi trường MS (Murashige and Skoog Medium) + g/l agar + 30 g/l sucrose Thí nghiệm - Ảnh hưởng môi trường dinh dưỡng đến khả tái sinh chồi Nưa konjac in vitro: Trong thí nghiệm này, chúng tơi sử dụng chồi mầm in vitro để cấy vào loại môi trường dinh dưỡng khác nhau, gồm: Môi trường MS, WPM (Woody Plant Medium), B5 (Gamborg Medium), N6 (Chu Medium), loại môi trường bổ sung 0,5 mg/l BAP + g/l agar + 30 g/l sucrose nhằm xác định mơi trường dinh dưỡng thích hợp cho tái sinh chồi Nưa konjac in vitro Thí nghiệm - Ảnh hưởng nồng độ BAP đến khả tái sinh chồi Nưa konjac in vitro: Đối với Nưa konjac, nghiên cứu ảnh hưởng hàm lượng BAP đến tạo thành chồi dải nồng độ 0,5-3,0 mg/l Thí nghiệm tiến hành với công thức, công thức tiến hành môi trường dinh dưỡng xác định thí nghiệm 2, bổ sung g/l agar + 30 g/l sucrose chất điều hòa sinh trưởng nồng độ khác Thí nghiệm - Ảnh hưởng nồng độ BAP Kinetin đến khả tái sinh chồi Nưa konjac in vitro: Nồng độ BAP tối ưu cho tái sinh chồi in vitro sử dụng để tiếp tục nghiên cứu ảnh hưởng tổ hợp BAP Kinetin đến khả nhân nhanh chồi Công thức môi trường MS + g/l agar + 30 g/l sucrose + nồng độ BAP thích hợp thí nghiệm kinetin bổ sung nồng độ khác 0,2-1,0 mg/l định thí nghiệm 5, bổ sung IBA với nồng độ khác (0-1 mg/l) Thí nghiệm - Ảnh hưởng giá thể đến tỷ lệ sống Nưa konjac in vitro vườn ươm: Để xác định ảnh hưởng thành phần giá thể trồng đến tỷ lệ sống sinh trưởng Nưa konjac in vitro đưa trồng thử nghiệm vườn ươm, tiến hành thử nghiệm với công thức 100% đất tầng B, 100% cát, 50% đất + 50% cát, 50% đất tầng B + 30% cát + 20% trấu hun Kết thảo luận Ảnh hưởng hóa chất thời gian khử trùng đến khả tạo mẫu in vitro Trong thí nghiệm sử dụng HgCl2 0,1% để khử trùng với thời gian 4, phút NaClO (Javel) 60% 6, 12 18 phút Kết thí nghiệm trình bày bảng Bảng Ảnh hưởng loại hóa chất thời gian khử trùng đến khả tạo mẫu in vitro Hóa chất HgCl2 0,1% Javen 60% (NaClO) Mẫu Mẫu tái sinh Thời gian mẫu nảy chồi (ngày) Thời gian (phút) Tổng số mẫu cấy (mẫu) Số mẫu (mẫu) Tỷ lệ mẫu (%) Số mẫu nảy chồi Tỷ lệ mẫu nảy chồi (%) 30 26,00 86,67 21,33c 71,11 16 30 27,33 91,11 d 13,67 45,56 21 30 30,00 100,00 3,67 e 12,22 25 30 22,67 75,56 21,67 12 30 30,00 100,00 30 18 30 30,00 100,00 25 72,22 15 a 100,00 15 b 83,33 19 c (a,b,c ): Những chữ khác nêu cột biểu diễn khác có ý nghĩa α = 0,05 Ducan’s test Thí nghiệm - Ảnh hưởng môi trường dinh dưỡng đến khả rễ chồi Nưa konjac in vitro: Chồi tạo với số lượng lớn, đủ tiêu chuẩn (đạt kích thước 3-5 cm) cắt cấy chuyển sang môi trường tạo rễ là: Công thức môi trường MS (1962) 1/2 MS (các chất khoáng đa lượng vi lượng giảm 1/2) + g/l agar + 0,5 mg/l IBA + g/l than hoạt tính bổ sung sucrose với hàm lượng khác (12-20 g/l) Kết bảng cho thấy, khử trùng HgCl2 0,1% cho tỷ lệ mẫu cao (86,67-100%) tỷ lệ mẫu tái sinh lại thấp Khi tăng thời gian khử trùng tỷ lệ mẫu nảy chồi giảm xuống thấp (chỉ đạt 12,22% công thức khử trùng HgCl2 0,1% phút) thời gian phôi củ nảy mầm chậm Ở công thức khử trùng HgCl2 0,1% phút tỷ lệ mẫu đạt 86,67%, tỷ lệ mẫu nảy chồi đạt cao (71,11%) thời gian tái sinh chồi thấp (16 ngày) Thí nghiệm - Ảnh hưởng nồng độ IBA đến khả rễ chồi Nưa konjac in vitro: Sau xác định mơi trường dinh dưỡng thích hợp cho rễ chồi Nưa konjac in vitro, tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng chất điều hòa sinh trưởng IBA đến khả rễ chồi Thí nghiệm bố trí sử dụng mơi trường dinh dưỡng thích hợp xác Khi khử trùng mẫu với hoá chất Javen 60% đem lại kết tốt hơn, cho tỷ lệ mẫu tỷ lệ mẫu tái sinh cao Với thời gian khử trùng 12 phút, tỷ lệ mẫu tái sinh đạt cao (100%), sau 15 ngày nuôi cấy mẫu nảy chồi Với thời gian khử trùng 18 phút cho tỷ lệ mẫu tái sinh thấp hơn, đạt 72,22 83,33% 17(6) 6.2017 37 Khoa học Nông nghiệp Bảng Ảnh hưởng BAP đến khả tái sinh chồi Nưa konjac in vitro Hình Đỉnh sinh trưởng Nưa konjac nảy chồi môi trường MS (A: Mẫu khử trùng Javen 60% 12 phút; B: Mẫu khử trùng HgCl2 0,1% phút) Ảnh hưởng môi trường dinh dưỡng đến khả tái sinh chồi Nưa konjac in vitro Trong thí nghiệm này, sử dụng chồi mầm in vitro để cấy vào loại môi trường dinh dưỡng khác Kết thí nghiệm thu thập sau tuần nuôi cấy thống kê bảng Bảng Ảnh hưởng môi trường dinh dưỡng đến khả tái sinh chồi Nưa konjac in vitro BAP (mg/l) Tổng số mẫu cấy (mẫu) Số mẫu tái sinh chồi (mẫu) Tỷ lệ mẫu tái sinh chồi (%) Số chồi trung bình/ mẫu (chồi) Chiều cao trung bình chồi (cm) 45 24,67e 54,81 1,23e 1,51d 0,5 45 36,33 c 80,74 c 1,92 1,47d 45 40,33b 89,63 1,66d 1,72c 1,5 45 41,33 91,85 b 2,29 2,25b 45 45,00a 100,00 2,75a 2,96a 2,5 45 33,33d 74,07 1,67d 1,29e 45 32,33 71,85 1,27 1,18e b d e Kết bảng cho thấy, công thức môi trường cho tỷ lệ mẫu tái sinh chồi cao mg/l BAP (đạt 100%), tỷ lệ mẫu tái sinh chồi thấp công thức đối chứng (0 mg/l BAP), đạt 54,81% Các công thức môi trường nồng độ BAP khác cho tỷ lệ mẫu tái sinh đạt 70% Từ kết thu khẳng định, BAP nồng độ khác có ảnh hưởng mạnh mẽ tới khả phát sinh chồi mẫu cấy Khi tăng hàm lượng BAP cao mg/l thí nghiệm sau số mẫu tái sinh chồi chiều cao chồi giảm, đồng thời thấy xuất khối mô sẹo lớn Môi trường dinh dưỡng Tổng số mẫu cấy ban đầu (chồi) Số mẫu tái sinh chồi Tỷ lệ mẫu tái sinh chồi (%) Số chồi Trung bình/ mẫu Ảnh hưởng tổ hợp BAP Kinetin đến khả tái sinh chồi 1/2 MS 45 37,67a 83,70 1,81b MS 45 41,33 91,85 2,45 WPM 45 a 39,33 87,41 1,82b B5 45 30,33b 67,41 1,58b N6 45 25,67c 57,04 1,34b Nhằm xác định loại chất điều hòa sinh trưởng với nồng độ thích hợp cho tái sinh chồi Nưa konjac, mơi trường ni cấy ngồi bổ sung chất điều hịa sinh trưởng BAP, nghiên cứu ảnh hưởng tổ hợp BAP với Kinetin cách sử dụng cơng thức mơi trường có hàm lượng mg/l BAP bổ sung thêm Kinetin nồng độ khác (0,2; 0,4; 0,6; 0,8 1,0 mg/l) Kết thí nghiệm thu sau tuần ni thể bảng a a Kết bảng cho thấy, cơng thức mơi trường MS mẫu cấy có khả tái sinh tốt (đạt 91,85%), số chồi trung bình/mẫu đạt 2,45 chất lượng chồi tốt (chồi mập, khỏe mạnh, xanh đậm, phát triển nhanh) Trong mơi trường cịn lại mơi trường WPM cho tỷ lệ mẫu tái sinh cao (đạt 87,41%), số chồi trung bình 1,82 Với mơi trường 1/2 MS cho số chồi trung bình/mẫu đạt 1,81, tỷ lệ tái sinh đạt 83,7% chất lượng chồi mức trung bình (chồi yếu, xanh vàng, phiến hẹp, mỏng); cịn mơi trường B5 N6 cho tỷ lệ mẫu tái sinh thấp, chất lượng chồi Ảnh hưởng BAP đến khả tái sinh chồi Nưa konjac in vitro Trong thí nghiệm này, chúng tơi sử dụng mơi trường MS có bổ sung chất điều hòa sinh trưởng BAP với nồng độ khác nhau: 0; 0,5; 1; 1,5; 2; 2,5 3,0 mg/l Kết thí nghiệm thu thập sau tuần nuôi cấy thể bảng 17(6) 6.2017 Bảng Ảnh hưởng tổ hợp BAP Kinetin đến khả tái sinh chồi Nưa konjac in vitro BAP (mg/l) Kinetin (mg/l) Tổng số mẫu cấy (mẫu) Số mẫu tái sinh chồi (mẫu) Tỷ lệ mẫu tái sinh Số chồi trung bình/ mẫu (chồi) Chiều cao trung bình chồi (cm) 0,20 40 40,00a 100,00 5,22a 3,84a 0,40 40 36,67b 91,67 3,35b 3,36b 0,60 40 34,33 b 85,83 2,74 c 3,29b 0,80 40 30,33c 75,83 2,63c 3,20b 1,00 40 29,67c 74,17 2,33d 2,79c Kết bảng cho thấy, khác ảnh hưởng tổ hợp Kinetin BAP đến khả tái sinh chồi so với ảnh hưởng riêng rẽ BAP Sau nuôi cấy tuần, công thức MS + mg/l BAP + 0,2 mg/l Kinetin cho tỷ lệ mẫu tái sinh chồi cao (đạt 100%), số chồi trung bình/mẫu cấy 38 Khoa học Nơng nghiệp 5,22, chiều cao trung bình chồi đạt 3,84 cm Khi tăng hàm lượng Kinetin lên 1,0 mg/l cho tỷ lệ mẫu tái sinh, số chồi trung bình/mẫu chiều cao trung bình chồi thấp Các cơng thức môi trường khác (hàm lượng Kinetin 0,4; 0,6 0,8 mg/l) cho tỷ lệ mẫu tái sinh chồi 75% số chồi trung bình/mẫu chiều cao chồi lại thấp giảm dần hàm lượng Kinetin bổ sung vào môi trường tăng dần Từ số liệu thu thấy, cơng thức bổ sung hàm lượng mg/l BAP + 0,2 mg/l Kinetin cho số chồi trung bình gấp 1,90 lần chiều cao chồi trung bình gấp 1,71 lần so với công thức tốt sử dụng riêng rẽ BAP Hình Chồi Nưa konjac môi trường bổ sung mg/l BAP + 0,2 mg/l Kinetin sau tuần nuôi cấy Kết bảng cho thấy, sau tuần nuôi cấy môi trường rễ có bổ sung đầy đủ chất dinh dưỡng, chất điều hòa sinh trưởng hàm lượng đường khác cho kết chồi rễ với tỷ lệ khác Mẫu nuôi cấy công thức 1/2 MS + g/l agar + 0,5 mg/l IBA + 14 g/l sucrose cho hiệu cao (đạt 100%), số lượng rễ trung bình/chồi đạt 4,98, chiều dài trung bình rễ đạt 2,67 cm thời gian chồi bắt đầu rễ ngày, chất lượng rễ tốt (rễ mập, khỏe mạnh), khả đâm xun mạnh, hình thành mơ sẹo Mẫu cấy công thức môi trường thay đổi hàm lượng đường (tăng/giảm) khác cho kết thấp Trong đó, cơng thức mơi trường hàm lượng đường giảm xuống 12 g/l cho tỷ lệ chồi rễ chiều dài trung bình rễ thấp (lần lượt 82,96% 1,76 cm) Đối với công thức môi trường MS + g/l agar + 14 g/l sucrose + 0,5 mg/l IBA cho kết tương đối cao, tỷ lệ chồi rễ đạt 100%, số rễ trung bình/chồi 4,81, chiều dài trung bình rễ đạt 2,22 cm thời gian chồi bắt đầu rễ ngày, rễ lại xuất nhiều mô sẹo Ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng đến khả rễ của chồi Nưa konjac in vitro Nhằm xác định công thức môi trường dinh dưỡng để chồi Nưa konjac rễ đạt hiệu cao nhất, sử dụng công thức môi trường khác nhau, gồm: Môi trường MS 1/2 MS (giảm 1/2 hàm lượng chất khoáng đa lượng vi lượng) + g/l agar + 0,5 mg/l IBA + g/l than hoạt tính + đường sucrose với hàm lượng khác (12, 14, 16 20 g/l) Số liệu thu thập sau tuần nuôi cấy môi trường rễ thống kê bảng Bảng Ảnh hưởng môi trường dinh dưỡng đến khả rễ chồi Nưa konjac in vitro Môi trường 1/2 MS MS Sucrose Tổng số mẫu cấy (mẫu) Số chồi rễ (chồi) Tỷ lệ chồi rễ Thời gian bắt đầu rễ (ngày) Số rễ trung bình/ chồi (rễ) Chiều dài trung bình rễ (cm) 12 45 37,33cd 82,96 4,43c 1,76d 14 45 45,00 100,00 a 4,98 2,67 16 45 45,00 100,00 4,56 bc 2,09c 20 45 42,33ab 94,07 4,10d 2,13c 12 45 35,33d 78,52 14 3,88d 1,78d 14 45 45,00a 100,00 4,81ab 2,22bc 16 45 45,00 100,00 bc 4,57 2,29bc 20 45 40,33bc 89,63 4,44c 2,10c a a a 17(6) 6.2017 a Hình A: Rễ Nưa konjac mơi trường 1/2 MS + g/l agar + 14 g/l sucrose + 0,5 mg/l IBA sau tuần nuôi cấy; B: Cây Nưa konjac in vitro hồn chỉnh mơi trường 1/2 MS + g/l agar + 14 g/l sucrose + 0,5 mg/l IBA sau tuần nuôi cấy Ảnh hưởng nồng độ IBA đến khả rễ chồi Khi chồi mang đạt tiêu chuẩn kích thước (dài 3-5 cm) cắt cấy chuyển sang môi trường tạo rễ Sử dụng công thức môi trường dinh dưỡng rễ tốt xác định (môi trường 1/2 MS + g/l agar + 14 g/l sucrose + g/l than hoạt tính) bổ sung IBA với nồng độ khác để nghiên cứu ảnh hưởng loại chất điều hòa sinh trưởng đến khả rễ chồi Nưa konjac điều kiện nuôi cấy in vitro Sau tuần nuôi kết nghiên cứu thể bảng 39 Khoa học Nông nghiệp Bảng Ảnh hưởng IBA đến khả rễ chồi Nưa konjac in vitro Thời gian bắt đầu rễ (ngày) Số rễ trung bình/ chồi (rễ) Chiều dài trung bình rễ (cm) 0,00 0,00 0,00e 0,00d 30,33c 75,83 12,00 4,32b 1,80c 40 40,00a 100,00 6,00 5,30a 2,61a 0,60 40 37,33a 93,33 7,00 4,38b 2,26b 0,80 40 33,67b 84,17 10,00 3,84c 1,95c 1,00 40 28,33 70,83 10,00 3,28 1,80c Tổng số chồi cấy (chồi) Số chồi rễ (chồi) Tỷ lệ chồi rễ (%) 0,00 40 0,00d 0,20 40 0,40 IBA (mg/l) c d Kết bảng cho thấy, sau tuần nuôi cấy môi trường khơng bổ sung chất điều hịa sinh trưởng chồi khơng rễ Khi bổ sung chất điều hòa sinh trưởng IBA với hàm lượng khác xuất chồi rễ với tỷ lệ khác Công thức môi trường 0,4 mg/l IBA cho hiệu rễ tốt (đạt 100%), số rễ trung bình/chồi 5,3, chiều dài trung bình rễ đạt 2,61 cm Ở hàm lượng IBA thấp (0,2 mg/l) cao (0,6; 0,8 1,0 mg/l) cho hiệu tạo rễ hơn, nguyên nhân chồi có khả tổng hợp auxin nội sinh nên bổ sung lượng auxin ngoại sinh nồng độ thấp chưa đủ để kích thích rễ nhanh hàm lượng cao ức chế hình thành rễ Bảng Ảnh hưởng loại giá thể đến tỷ lệ sống Nưa konjac in vitro trồng vườn ươm Giá thể Số cấy (cây) Số sống (cây) Tỷ lệ sống (%) 100% đất tầng B 45 c 28,67 63,70 100% cát 45 23,33d 51,85 50% đất + 50% cát 45 b 35,33 78,52 50% đất tầng B + 30% cát + 20% trấu hun 45 42,33a 94,07 Kết bảng cho thấy, công thức giá thể 50% đất + 30% cát + 20% trấu hun cho tỷ lệ sống trung bình sau tuần trồng cao (đạt 94,07%), tiếp công thức 100% đất tầng B 50% đất + 50% cát, tỷ lệ sống đạt 78,52 63,7% Với công thức 100% cát, tỷ lệ sống đạt thấp (51,85%) Kết luận Công thức khử trùng vật liệu nuôi cấy tốt sử dụng dung dịch Javen 60% (NaClO) 12 phút, tỷ lệ mẫu in vitro đạt 100%, tỷ lệ mẫu tái sinh đạt 100%, thời gian mẫu nảy chồi sau 15 ngày Công thức môi trường dinh dưỡng thích hợp để tái sinh chồi Nưa konjac in vitro MS + mg/l BAP + 0,2 mg/l Kinetin + g/l agar + 30 g/l sucrose, số chồi trung bình/mẫu đạt 5,22, chiều cao trung bình chồi 3,84 cm, chất lượng chồi tốt Công thức môi trường rễ tốt 1/2 MS + g/l agar + 14 g/l sucrose + 0,4 mg/l IBA + g/l than hoạt tính, tỷ lệ chồi rễ đạt 100%, số rễ trung bình/chồi 4,98, chiều dài trung bình rễ đạt 2,67 cm, sau ngày ni chồi bắt đầu rễ Hình A: Rễ Nưa konjac môi trường hàm lượng 0,4 mg/l IBA sau tuần nuôi cấy; B: Cây Nưa konjac in vitro hồn chỉnh mơi trường hàm lượng 0,4 mg/l BAP Ảnh hưởng giá thể đến tỷ lệ sống Nưa konjac in vitro vườn ươm Giai đoạn chuyển in vitro từ bình ni trồng vườn ươm giai đoạn có ý nghĩa quan trọng, định khả ứng dụng tồn quy trình nhân giống in vitro vào thực tiễn sản xuất Một yêu cầu giai đoạn xác định giá thể trồng phù hợp để Nưa konjac in vitro sinh trưởng phát triển tốt Để xác định ảnh hưởng thành phần giá thể trồng đến tỷ lệ sống sinh trưởng Nưa konjac in vitro đưa trồng thử nghiệm vườn ươm, tiến hành thử nghiệm với công thức thí nghiệm Sau tuần trồng, kết nghiên cứu tổng hợp bảng 17(6) 6.2017 Giá thể thích hợp cho trồng Nưa konjac in vitro 50% đất + 30% cát + 20% trấu hun, tỷ lệ sống cao đạt 94,07% sau tuần trồng Cây khỏe mạnh, sinh trưởng phát triển bình thường TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] S Edison (2010), Quality declared planting material: Protocols and standards for vegetatively propagated crops, Food and Agriculture Organization of the United Nations (FAO), pp.65-69 [2] M Chua, K Chan, J.T Hocking, A.P Williams, J.C Perry, C.T Baldwin (2012), “Methodologies for the extraction and analysis of konjac glucomannan from corms of Amorphophallus konjac K Koch”, Carbohydrate Polymers, 87, pp.22022210 [3] P Liu (2004), Konjac, China Agriculture Press, Bei Jing, 348p [4] H Kurihara (1979), “Trends and problems of konjac (Amorphophallus konjac) cultivation in Japan”, Japan Agricultural Research Quarterly, 13, pp.174-179 [5] Võ Văn Chi (1999), “Khoai nưa”, Từ điển thuốc Việt Nam [6] Đỗ Tất Lợi (1995), Những thuốc vị thuốc Việt Nam, Nhà xuất Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội [7] Nguyễn Văn Dư (1994), “Họ Ráy (Araceae Juss) hệ thực vật Việt Nam”, Tạp chí Sinh học, 16(4), pp.108-115 40 ... 0,1% để khử trùng với thời gian 4, phút NaClO (Javel) 60% 6, 12 18 phút Kết thí nghiệm trình bày bảng Bảng Ảnh hưởng loại hóa chất thời gian khử trùng đến khả tạo mẫu in vitro Hóa chất HgCl2 0,1%... để cấy vào loại môi trường dinh dưỡng khác Kết thí nghiệm thu thập sau tuần nuôi cấy thống kê bảng Bảng Ảnh hưởng môi trường dinh dưỡng đến khả tái sinh chồi Nưa konjac in vitro BAP (mg/l) Tổng... thêm Kinetin nồng độ khác (0,2; 0,4; 0,6; 0,8 1,0 mg/l) Kết thí nghiệm thu sau tuần nuôi thể bảng a a Kết bảng cho thấy, công thức mơi trường MS mẫu cấy có khả tái sinh tốt (đạt 91,85%), số chồi