Luận án nghiên cứu hệ gen của virus cúm a h5n1 phân lập từ gà nuôi tại hậu giang

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI TRẦN QUANG VUI LUẬN ÁN TIẾN SỸ NÔNG NGHIỆP Hà Nội - 2012 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI TRẦN QUANG VUI Chuyên ngành: Vi sinh vật học thú y Mã số: 62 62 50 10 LUẬN ÁN TIẾN SỸ NÔNG NGHIỆP Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS LÊ THANH HOÀ TS NGUYỄN BÁ HIÊN Hà Nội - 2012 I LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu thân tơi thực Các số liệu, kết trình bày luận án trung thực chưa cơng bố cơng trình luận án trước Mọi giúp đỡ cảm ơn Các thơng tin, tài liệu trích luận án rõ nguồn gốc Nghiên cứu sinh Trần Quang Vui II LỜI CẢM ƠN Hoàn thành luận án này, tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới: - PGS.TS Lê Thanh Hòa TS Nguyễn Bá Hiên - người thầy dành nhiều thời gian tâm huyết hướng dẫn nghiên cứu tận tình giúp đỡ tơi hồn thành luận án - Bộ Khoa học Công nghệ Nhiệm vụ Nghị định thư Việt Nam - Thái Lan Phịng Thí nghiệm trọng điểm Công nghệ gen (Viện Công nghệ sinh học) hỗ trợ kinh phí trang thiết bị để thực đề tài Tôi xin chân thành cảm ơn: - Phịng Miễn dịch học, Viện Cơng nghệ sinh học (Viện Khoa học Công nghệ Việt Nam) tạo điều kiện thuận lợi giúp đỡ tơi nhiều q trình thực đề tài - Bộ môn Vi sinh vật - Truyền nhiễm, Khoa Thú Y, Viện Đào tạo Sau Đại học, Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội t ạo điều kiện thuận lợi trình nghiên cứu - Khoa Chăn nuôi - Thú y, Trường Đại học Nông Lâm, Đại học Huế cho phép tạo điều kiện thuận lợi để tơi có đủ thời gian thực luận án - Th.S Nguyễn Thị Bích Nga, anh chị Phịng Miễn dịch học thuộc Viện Cơng nghệ Sinh học bạn đồng nghiệp tận tình giúp đỡ , hỗ trợ kỹ thuậ t trình nghiên cứu Góp cơng sức khơng nhỏ việc hoàn thành luận án người vợ thân yêu - đ ộng viên giúp đỡ, gánh vác công việc gia đình đ ể tơi dành thời gian cho nghiên cứu hoàn thành luận án Nghiên cứu sinh Trần Quang Vui III MỤC LỤC Trang DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT VÀ GIẢI NGHĨA VI DANH MỤC CÁC BẢNG VIII DANH MỤC CÁC HÌNH XI MỞ ĐẦU CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Đại cương bệnh cúm gia cầm 1.1.1 L ịch sử bệnh cúm gia cầm ịch cúm gia cầm A/H5N1 giới 1.1.2 Tình hình d ịch cúm gia cầm 1.1.3 Tình hình d ệnh 1.1.4 Nguyên nhân gây b A/H5N1 Việt Nam 1.1.5 Cơ chế sinh bệnh 13 1.1.6 Tri 1.1.7 B ệu chứng lâm sàng ệnh tích 15 16 1.1.8 Chẩn đoán bệnh 18 ống bệnh cúm gia cầm 20 1.1.9 Phòng ch 1.2 Sinh học phân tử virus cúm A 1.2.1 H ệ gen virus cúm A 24 1.2.2 Protein virus - cấu trúc chức 1.2.3 Cơ chế phân tử trình xâm nhiễm nhân lên virus cúm A ức biến đổi kháng nguyên virus cúm A 2.4 Các phương th 38 1.3 Tiến hóa hệ gen virus cúm A/H5N1 1.3.1 S ự tiến hóa virus cúm A/H5N1 26 36 42 42 1.3.2 Sự xâm nhập genotype virus cúm A/H5N1 ệt vào Vi 24 Nam 44 1.3.3 Sự biến đổi thành phần hemagglutinin (HA) tạo nên nhóm kháng nguyên (clade) virus cúm A/H5N1 Việt Nam 47 IV 1.4 Phản ứng RT-PCR nghiên cứu virus cúm A 49 1.5 Một số nghiên cứu sinh học phân tử virus cúm A/H5N1 Việt Nam 1.6 Tầm quan trọng việc giải m ã hệ gen virus cúm A/H5N1 50 54 CHƯƠNG 2: NỘI DUNG, NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 56 2.1 Đối tượng nghiên cứu 56 2.2 2.3 Địa điểm thời gian nghiên cứu 56 Nội dung nghiên cứu 56 ải trình tự toàn b ộ hệ gen chủng virus cúm A/H5N1 2.3.1 Gi ập từ gà Hậu Giang phân l (CkHG4) 56 2.3.2 Phân tích so sánh thành phần gen, mối quan hệ nguồn gốc phả 2.4 hệ chủng CkHG4 với chủng Việt Nam giới 56 Vật liệu nghiên cứu 56 2.4.1 Nguyên li 56 2.4.2 D ệu ụng cụ thiết bị ất 57 2.4.3 Hóa ch 57 ịch môi trường 57 2.4.4 Các dung d 2.5 Phương pháp nghiên cứu 58 2.5.1 Phương pháp tách chiết RNA tổng số 58 2.5.2 Phương pháp RT-PCR 59 ểm tra sản phẩm RT 5.3 Phương pháp ki -PCR ạch sản phẩm RT 5.4 Phương pháp tinh s -PCR 5.5 Phương pháp dòng hóa 63 63 64 2.5.6 Phương pháp giảiVtrình tự À THẢO LUẬN 70 67 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ 3.1 giải mã hệ gen Kết virus cúm A/H5N1 chủng CkHG4 70 lý số liệu 5.7 Phương pháp x ết tách RNA tổng số 69 70 3.1.1 K V 3.1.2 Kết giải trình tự gen kháng nguyên HA (H5) NA (N1) ải trình tự gen H5 (HA) 1.2.1 Gi ải tr 1.2.2 Gi 1.3 K 3 3.2 ự gen N1 (NA) ình t 73 c gen polymerase 75 ự gen PB2 1.3.1 Giải trình t ải trình tự gen PB1 ải trình tự gen PA 1.3.3 Gi 71 ết giải trình tự cá 1.3.2 Gi 71 75 76 77 tíchếtsoquả Phân sánh gen, hệ nguồn gốc phả hệ giảithành trình tựphần gen NP,mối M vquan NS .1.4 K 79 chủng CkHG4 với chủng Việt Nam giới 83 ải trình gen NP 3.2.1 PhânGitích gentựH5 1.4.1 7984 3.2.2 gen N1 93 Phân tích ải t ự gen M 1.4.2 Gi rình t 79 3.2.3 Phân tích gen PB2 102 Phân tích 3.2.4 PB1-F2 106 ải tr genựPB1 gen NS 1.4.3 Gi ình t 80 3.2.5 Phân tích gen PA 112 3.2.6 Phân tích gen NP 117 3.2.7 Phân tích gen M 120 3.2.8 Phân tích gen NS 124 3.3 Thảo luận chung 131 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 136 CÁC CƠNG TRÌNH Đ Ã CƠNG B Ố LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN 138 TÀI LIỆU THAM KHẢO 139 PHỤ LỤC VI DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT VÀ GIẢI NGHĨA Aa Amino acid Thuật từ/Cách dùng nghĩa tiếng Việt Axit amin Bp Base pair Cặp bazơ Ck Chicken Gà CkHG4 A/Chicken/Vietnam/HG4/05(H5N1) Chủng virus cúm A/H5N1 phân Ký hiệu Tiếng Anh lập từ gà Hậu Giang năm 2005 Da Dalton Đơn vị tính trọng lượng phân tử protein Dk Duck Vịt DNA Deoxyribonucleic Acid Axit deoxyribonucleic dNTP deoxy Nucleotide Triphosphate Tiền chất dNTP cho phản ứng PCR ddNTP dideoxy Nucleotide Triphosphate Tiền chất dNTP cho phản ứng giải trình tự Enzyme-Linked Immunosorbent Phản ứng miễn dịch đánh dấu Assay enzym FAO Food and Agricultural Organization Tổ chức nông lương giới Gs Goose Ngỗng HA Haemagglutinin Ngưng kết hồng cầu HI Hemagglutination Inhibition Ngăn trở ngưng kết hồng cầu HPAI Highly Pathogenic Avian Influenza Cúm gia cầm thể độc lực cao Kb Kilo base Kilo bazơ LB Luria-Bertani Môi trường Luria-Bertani nuôi cấy ELISA vi khuẩn LPAI Low Pathogenic Avian Influenza Cúm gia cầm thể độc lực thấp M Matrix Protein đệm MDk Muscovy duck Ngan MEGA Molecular Evolutionary Genetics Chương trình phân tích tiến hóa VII Analysis gen NA Neuraminidase Enzym phân giải sialic NEP Nuclear Export Protein Protein vận chuyển NP Nucleoprotein Protein nhân NS Non structural protein Protein không cấu trúc OIE Office International des Epizooties Tổ chức Thú y giới PA Polymerase acidic protein Enzym polymerase có tính axit PB1 Polymerase basic protein Enzym polymerase có tính bazơ PB2 Polymerase basic protein Enzym polymerase có tính bazơ PCR Polymerase Chain Reaction Phản ứng PCR RNA Ribonucleic Acid Axit ribonucleic RNP Ribonucleoprotein Tổ hợp protein liên kết ribonucleic RT-PCR Reverse Transcription-Polymerase Phản ứng PCR ngược Chain Reaction SPF Specific Pathogen Free (-)ssRNA Negative single-strand Ribonucleic Không chứa mầm bệnh (siêu sạch) ARN sợi đơn âm Acid TAE Tris-Acetate-EDTA Tris-Acetate-EDTA TNF-α Tumor Necrosis Factor-α Yếu tố α gây hoại tử khối u WHO World Health Organization Tổ chức Y tế giới VIII DANH MỤC CÁC BẢNG TT Tên bảng 1.1 Tổng số trường hợp nhiễm cúm gia cầm A/H5N1 người báo tháng 12/2003 đến cáo cho WHO t ần phản ứng RT 6/7/2012 2.1 Thành ph -PCR 2.2 Chu trình nhiệt sử dụng nghiên cứu sinh học phân tử virus Trang 59 cúm A/H5N1 60 2.3 Danh sách mồi sử dụng để thu nhận hệ gen virus cúm gia cầm 61 2.4 Thành ph 68 3.1 Danh sách chủng virus cúm A/H5N1 Việt Nam ần phản ứng chu trình nhiệt giải trình tự giới sử dụng gen H5 phân tích so sánh thành phần gen ối quan hệ nguồn gốc phả hệ m 3.2 So sánh vị trí sai khác nucleotide gen H5 chủng CkHG4 với 26 chủng virus cúm khác 3.3 So sánh vị trí sai khác amino acid chuỗi polypeptide H5 ữa 27 chủng virus cúm gi 3.4 85 86 87 Tỷ lệ (%) đồng nucleotide (trên đường chéo) tương đồng amino acid (dưới đường chéo) gen H5 chủng cúm A/H5N1 c 3.5 Việt Nam giới Danh sách chủng virus cúm A/H5N1 Việt Nam giới sử dụng gen N1 phân tích so sánh thành phần gen ối quan hệ nguồn gốc phả hệ m 3.6 So sánh vị trí sai khác nucleotide gen N1 chủng CkHG4 với ủng virus cúm khác 26 ch 3.7 94 95 So sánh vị trí sai khác amino acid chuỗi polypeptide N1 27 chủng virus cúm 3.8 90 96 Tỷ lệ (%) đồng nucleotide (trên đường chéo) tương đồng amino acid (dưới đường chéo) gen N1 ủng cúm A/H5N1 Việt Nam giới ch 100 ... cho nghiên cứu gen /hệ gen virus cúm A/ H5N1 nghiên cứu sản xuất chế phẩm sinh học hệ ứng dụng chẩn đoán phịng bệnh, chúng tơi tiến hành đề tài: Nghiên cứu hệ gen virus cúm A/ H5N1 ập từ gà nuôi Hậu. .. HPAI Highly Pathogenic Avian Influenza Cúm gia cầm thể độc lực cao Kb Kilo base Kilo bazơ LB Luria-Bertani Môi trường Luria-Bertani nuôi cấy ELISA vi khuẩn LPAI Low Pathogenic Avian Influenza Cúm. .. nghi ên cứu vaccine phòng bệnh hiệu Ý ngh? ?a khoa học đề tài - Đây luận án nghiên cứu đầy đủ, có hệ thống sinh học phân tử hệ gen virus cúm A/ H5N1 gà nuôi Hậu Giang - Luận án tài liệu tham khảo