Đa Dạng Di Truyền Và Các Thông Số Di Truyền Theo Tính Trạng Tăng Trưởng Phục Vụ Chọn Giống Tôm Sú.pdf

i BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG NGUYỄN HỮU HÙNG NGHIÊN CỨU ĐA DẠNG DI TRUYỀN VÀ CÁC THÔNG SỐ DI TRUYỀN THEO TÍNH TRẠNG TĂNG TRƯỞNG PHỤC VỤ CHỌN GIỐNG TÔM SÚ (PENAEUS MONODON FABRICIU[.]

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG NGUYỄN HỮU HÙNG NGHIÊN CỨU ĐA DẠNG DI TRUYỀN VÀ CÁC THƠNG SỐ DI TRUYỀN THEO TÍNH TRẠNG TĂNG TRƯỞNG PHỤC VỤ CHỌN GIỐNG TÔM SÚ (PENAEUS MONODON FABRICIUS, 1798) LUẬN ÁN TIẾN SĨ KHÁNH HÒA - 2020 i BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG NGUYỄN HỮU HÙNG NGHIÊN CỨU ĐA DẠNG DI TRUYỀN VÀ CÁC THƠNG SỐ DI TRUYỀN THEO TÍNH TRẠNG TĂNG TRƯỞNG PHỤC VỤ CHỌN GIỐNG TÔM SÚ (PENAEUS MONODON FABRICIUS, 1798) Ngành đào tạo: Nuôi trồng thủy sản Mã số: 9620301 LUẬN ÁN TIẾN SĨ NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS NGUYỄN VĂN HẢO PGS.TS LẠI VĂN HÙNG KHÁNH HỊA - 2020 ii Cơng trình hồn thành Trường Đại học Nha Trang Người hướng dẫn khoa học: TS Nguyễn Văn Hảo PGS TS Lại Văn Hùng Phản biện 1: TS Nguyễn Minh Thành Phản biện 2: TS Trần Thị Thúy Hà Phản biện 3: TS Đặng Thúy Bình Luận án bảo vệ Hội đồng đánh giá luận án cấp trường họp Trường Đại học Nha Trang vào hồi ngày tháng năm 2020 Có thể tìm hiểu luận án : Thư viện Quốc gia Thư viện Trường Đại học Nha Trang iii LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu khoa học thực hướng dẫn TS Nguyễn Văn Hảo, PGS TS Lại Văn Hùng hỗ trợ đồng nghiệp Số liệu luận án trung thực chưa công bố cơng trình nghiên cứu khác Khánh Hịa, ngày 02 tháng 04 năm 2020 Tác giả luận án Nguyễn Hữu Hùng iv LỜI CẢM ƠN Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn chân thành sâu sắc tới TS Nguyễn Văn Hảo, PGS TS Lại Văn Hùng – người thầy tận tình hướng dẫn tơi suốt thời gian nghiên cứu luận án khơng thể hồn thành khơng có giúp đỡ q báu Xin chân thành cảm ơn Lãnh đạo Viện Nghiên cứu Ni trồng thủy sản III phịng chức tạo điều kiện cho suốt trình nghiên cứu Xin chân thành cảm ơn Ban giám hiệu Đại học Nha Trang, Lãnh đạo Viện Nuôi trồng thủy sản, Phịng sau Đại học tồn thể thầy cô tạo điều kiện tốt cho suốt trình học tập nghiên cứu trường Xin chân thành cảm ơn Lãnh đạo Viện Nghiên cứu Nuôi trồng thủy sản II giúp đỡ tạo điều kiện sở vật chất, người suốt trình thực luận án Xin chân thành cảm ơn Lãnh đạo Trung tâm Quốc gia giống Hải sản Nam bộ, Trại thực nghiệm Bạc Liêu, Trung tâm Quan trắc môi trường dịch bệnh Thủy sản Nam bộ, Phòng Sinh học Thực nghiệm - Viện Nghiên cứu Nuôi trồng thủy sản II, Doanh nghiệp tư nhân Đặng Lâm (Vũng Tàu) tất đồng nghiệp giúp đỡ triển khai nội dung nghiên cứu suốt thời gian thực luận án Cuối cùng, xin cảm ơn gia đình, người thân, bạn bè sát cánh, động viên, chia sẻ với tơi suốt q trình học tập nghiên cứu Một lần xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành, sâu sắc với tất giúp đỡ quý báu Khánh Hòa, ngày 02 tháng 04 năm 2020 Tác giả luận án Nguyễn Hữu Hùng v MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN v MỤC LỤC vi DANH MỤC BẢNG xi DANH MỤC HÌNH xii DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT xiii TÓM TẮT NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN xiv SUMMARY OF NEW FINDINGDS OF PhD DISSERTATION xvi MỞ ĐẦU CHƯƠNG I: TỔNG QUAN .4 1.1 Thành tựu chương trình chọn giống đối tượng thủy sản nước giới 1.1.1 Các chương trình chọn giống đối tượng thủy sản 1.1.2 Tính đa dạng mặt địa lý thu thập vật liệu ban đầu để hình thành quần thể chọn giống .7 1.1.3 Đánh giá vật liệu ban đầu cho chương trình chọn giống 1.1.4 Đảm bảo an toàn sinh học bệnh chọn giống tôm 10 1.1.5 Kỹ thuật đánh dấu chọn giống thủy sản 12 1.1.6 Các đánh giá tương tác kiểu gen môi trường 14 1.1.7 Hệ số di truyền tương quan di truyền 15 1.1.8 Hiệu chọn lọc 17 1.2 Gia hóa khép kín vịng đời đối tượng chọn giống điều kiện nhân tạo Việt Nam giới .19 vi 1.3 Ứng dụng thị microsatellite để đánh giá biến dị di truyền chọn giống đối tượng trồng thủy sản 23 1.4 Ứng dụng phương pháp đại (MAS – Marker Assisted Selection; GWS – Genome Wide Selection) chọn giống .26 CHƯƠNG II: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 28 2.1 Đối tượng, thời gian, địa điểm phạm vi nghiên cứu 28 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 28 2.1.2 Thời gian nghiên cứu .28 2.1.3 Địa điểm nghiên cứu 28 2.1.4 Phạm vi nghiên cứu 28 2.2 Vật liệu nghiên cứu 30 2.2.1 Vật liệu nghiên cứu cho đánh giá biến dị di truyền microsatellite 31 2.2.1.1 Vật liệu sinh học .31 2.2.1.2 Dụng cụ .31 2.2.1.3 Hóa chất sử dụng .31 2.2.2 Vật liệu nghiên cứu cho đánh giá dòng phép lai hỗn hợp ước tính số thơng số di truyền .34 2.3 Phương pháp nghiên cứu 34 2.3.1 Phương pháp đánh giá biến dị di truyền microsatellite 34 2.3.1.1 Phương pháp tách chiết ADN tổng số 34 2.3.1.2 Khuếch đại microsatelite PCR 35 2.3.1.3 Phương pháp điện di kiểm tra sản phẩm PCR 37 2.3.1.4 Phân tích allele 37 2.3.2 Phương pháp đánh giá tăng trưởng dịng tơm phương pháp lai hỗn hợp 37 vii 2.3.2.1 Phương pháp đảm bảo an toàn sinh học (Chi tiết phụ lục 7) .37 2.3.2.2 Phương pháp sàng lọc bệnh tôm bố mẹ đầu vào giai đoạn phát triển vịng đời tơm sú (Chi tiết phụ lục 8) .37 2.3.2.3 Phương pháp phân tích chất lượng nước 37 2.3.2.4 Phương pháp nuôi thành thục, cho sinh sản tôm bố mẹ ương nuôi ấu trùng 38 2.3.2.5 Phương pháp ni tăng trưởng gia đình tôm hệ G0 G1 42 2.3.2.6 Phương pháp đánh dấu cá thể 44 2.4 Bố trí thí nghiệm .45 2.4.1 Bố trí thí nghiệm chọn lọc cặp mồi sử dụng để đánh giá biến dị di truyền microsatelite 45 2.4.2 Bố trí tổ hợp lai tồn phần dịng tơm sú 45 2.4.3 Bố trí lai tạo gia đình hệ G0 tạo hệ G1 45 2.4.3.1 Các tiêu chí chọn ghép cặp gia đình hệ G0 tạo G1 .45 2.4.3.2 Bố trí ghép cặp tôm bố mẹ G0 tạo hệ G1 46 2.4.4 Nuôi tăng trưởng đánh giá tương tác kiểu gen môi trường 48 2.5 Phương pháp phân tích xử lý số liệu 48 2.5.1 Phương pháp phân tích xử lý số liệu đánh giá đa dạng di truyền .48 2.5.2 Phương pháp phân tích xử lý số liệu phục vụ đánh giá tăng trưởng dịng tơm khác phép lai hỗn hợp 49 2.5.3 Phương pháp thu thập, phân tích xử lý số liệu phục vụ tính tốn thơng số di truyền 50 2.5.3.1 Phương pháp ước tính thành phần phương sai phục vụ đánh giá tương tác kiểu gen - môi trường (G x E) 50 2.5.3.2 Phương pháp tính ảnh hưởng cố định ước tính thành phần phương sai phục vụ tính hệ số di truyền 51 viii CHƯƠNG III KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 55 3.1 Đánh giá biến dị di truyền tôm sú thị microsatellite 55 3.1.1 Kết chọn microsatellite đánh giá biến dị di truyền 55 3.1.2 Các thông số đa dạng di truyền dựa 15 microsatellite bốn dịng tơm sú bố mẹ vật liệu ban đầu 56 3.1.3 Đa dạng di truyền dịng tơm sú vật liệu ban đầu 59 3.1.3.1 Đa dạng kiểu gen (G) 62 3.1.3.2 Dị hợp tử quan sát (H0) 62 3.1.3.3 Thơng tin đa hình (PIC) 63 3.1.3.4 Sai khác so với cân Hardy-Weinberg .63 3.1.3.5 Giá trị cận huyết (FIS ) 63 3.1.3.6 Sai khác di truyền dịng tơm (FST ) 64 3.2 Đánh giá tăng trưởng dịng tơm sú 66 3.2.1 Sàng lọc bệnh dịng tơm bố mẹ vật liệu ban đầu .66 3.2.2 Tạo gia đình tổ hợp lai 67 3.2.3 Ương nuôi gia đình tơm hệ G0 68 3.2.3.1 Ương nuôi từ nauplius đến hậu ấu trùng 15 68 3.2.3.2 Ni từ hậu ấu trùng 15 đến kích cỡ đánh dấu 70 3.2.4 Tăng trưởng tơm ni bể an tồn sinh học 71 3.2.4.1 Thống kê mô tả yếu tố ảnh hưởng đến tăng trưởng tôm hệ G0 71 3.2.4.2 Tăng trưởng tôm tổ hợp lai 73 3.3 Ước tính số thơng số di truyền quần đàn thiết lập 79 3.3.1 Đánh giá tương tác kiển gen môi trường (G × E) .79 3.3.1.1 Các yếu tố mơi trường ni 79 ix 3.3.1.2 Thống kê mô tả yếu tố ảnh hưởng 80 3.3.1.3 Tương quan kiểu gen mơi trường (G × E) 81 3.3.2 Hệ số di truyền 83 3.3.2.1 Thống kê mô tả tăng trưởng tôm sú hệ G1 83 3.3.2.2 Ước tính hệ số di truyền 85 3.3.3 Hiệu chọn lọc sau hệ tính trạng tăng trưởng 90 3.3.3.1 Hiệu chọn lọc .90 3.3.3.2 Ước tính hiệu chọn lọc phân tích xu hướng di truyền thơng qua khác biệt EBV hai nhóm chọn lọc G0 G1 90 3.3.3.3 Ước tính hiệu chọn lọc thơng qua khác biệt EBV nhóm chọn lọc trung bình hệ G1 .91 CHƯƠNG IV: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Ý KIẾN 94 4.1 Kết luận 94 4.2 Đề xuất ý kiến 96 TÀI LỆU THAM KHẢO Tài liệu tham khảo tiếng Việt Tài liệu tham khảo tiếng Anh x bố mẹ theo dõi chặt chẽ khâu chăm sóc, sức khỏe, mức độ bắt mồi để điều chỉnh lượng, chủng loại thức ăn cho phù hợp, siphon thức ăn thừa chất thải hàng ngày - Phương pháp cấy tinh Tôm đực chọn thu túi tinh phải khỏe mạnh, có ngoại hình đẹp, phụ đầy đủ, hoạt động tốt Đánh giá cảm quan túi tinh tôm đực cách quan sát vùng gốc đôi chân bị thứ thấy có màu trắng đục, khơng có dấu hiệu (vàng, vàng nâu, thâm đen) melanine hóa, hai túi tinh có kích thước tương đối Nếu tinh có dấu hiệu melanine hóa cần phải nặn bỏ để tơm hình thành tinh Túi tinh thu cách dùng đầu ngón tay ngón trỏ ấn nhẹ phần bụng gốc chân bò thứ năm Để tạo gia đình cha mẹ cha khác mẹ, tùy theo tình trạng chất lượng túi tinh đực áp dụng biện pháp sau: + Đối với tơm đực có túi tinh tốt: dùng túi tinh cấy cho tôm khác (mỗi tôm túi tinh) + Đối với tơm đực có túi tinh tốt: Cấy túi tinh tốt cho cái, sau chờ thời gian tôm đực lên tinh lại để cấy cho tôm khác dùng dao cắt túi tinh tốt làm sau cấy cho tơm khác Theo dõi q trình lột xác tôm cái, sau tôm lột xác 8-12 cấy tinh Túi tinh đực đưa nhẹ nhàng vào thelycum tôm vừa lột xác cịn chưa cứng vỏ hồn tồn, cách dùng cấy tinh hình trụ, trơn, có đường kính 0,5-1 mm mở nhẹ phần rãnh thelycum đưa túi tinh vào thelycum tôm Các thao tác kỹ thuật nhẹ nhàng, nhanh xác tránh làm tơm bị stress Các cá thể mẹ, có đeo dấu mắt, sau cấy tinh chuyển lại vào bể nuôi để theo dõi, sau 3-5 ngày cắt mắt cho đẻ - Phương pháp cắt mắt tôm mẹ Dùng khăn ẩm, quấn quanh thân tôm mẹ dùng tay giữ tôm mẹ đầu hướng ngồi tránh cho tơm vùng vẫy Kiểm tra hai mắt tiến hành cắt bên mắt kẹp inox nung đỏ đèn cồn, sau kẹp nhẹ vào cuống mắt đứt hẳn Ưu điểm phương pháp là: thao tác nhanh, tơm khơng dịch máu nhiều, có tác dụng tức thời sau cắt mắt, thể trạng tơm ổn 39 định sau cắt mắt, tơm bị sốc Tôm mẹ tắm Iodine 10 ppm thời gian 15 phút sau cắt mắt - Phương pháp kiểm tra tôm thành thục Sau cắt mắt ngày, tôm hoạt động tốt, ăn khỏe bắt đầu kiểm tra phát triển buồng trứng Hàng ngày khoảng 3-5 chiều, kiểm tra phát triển buồng trứng đèn soi trứng chống thấm nước theo cách rọi đèn ngược từ bụng tôm hướng ánh sáng lên, đặc biệt khu vực sau phần đầu ngực Tơm đẻ có trứng phát triển giai đoạn IV, kích thước buồng trứng đạt cực đại, căng tròn, màu xanh xám đậm, sắc nét, đốt bụng thứ nhất, buồng trứng phát triển lớn, chảy xệ bên tạo thành cánh tam giác Tôm chọn, nhúng qua dung dịch Iodine 100 ppm phút, sục khí mạnh Rửa lại nước biển cho vào bể sinh sản thể tích 1-2 m3, bể sinh sản chứa tôm mẹ - Phương pháp cho sinh sản: Mỗi bể sinh sản cho tôm mẹ, sử dụng bể composite thể tích - m3 hình trịn, đáy hình chóp, cấp nước 2/3 bể cho đủ thể tích tơm bơi đẻ tránh tơm nhảy ngồi Bể sinh sản sục khí liên tục, nhẹ Không sục mạnh, tránh tượng trứng bị vỡ Tôm mẹ sau sinh sản xong vớt vợt có mắt lưới thưa để trứng lọt qua Sau tôm đẻ giờ, trứng trương nước lơ lửng bể, điều chỉnh sục khí mạnh để trứng phân tán vớt sang xô nước vợt thu trứng mắt lưới 45%), ngày cho ăn lần, lượng cho ăn hàng ngày theo hướng dẫn nhà sản xuất khả sử dụng thức ăn cụ thể tôm bể Hàng ngày theo dõi hoạt động tôm thường xuyên kiểm tra chất lượng nước Dựa vào giá trị chọn giống gia đình kết hợp với kết đánh giá sinh trưởng thu từ thí nghiệm ni vùng sinh thái khác nhau, tơm ni bể an tồn sinh học sử dụng để chọn lọc tôm bố mẹ tạo quần đàn tôm sú hệ G0 bệnh - Phương pháp nuôi tăng trưởng ao đất vùng địa lý khác Ba vùng nuôi lựa chọn đại diện cho vùng sinh thái khác gồm: Khánh Hịa, Bạc Liêu Vũng Tàu Q trình ni thử nghiệm tiến hành điều kiện sản xuất thực tế theo quy trình ni thương phẩm quy mơ nơng hộ Ao ni có diện tích 1500 m2 ao ni Khánh Hịa 2000 m2/ao ao nuôi Bạc Liêu Vũng Tàu Mỗi ao ngăn thành ô lưới cước, mắt lưới ly ngăn theo chiều dọc ao có diện tích (do thời gian sinh sản ương nuôi tổ hợp lai khác nên chia thành đợt thả) Số lượng tôm sau đánh dấu trung bình 120 cá thể/gia đình lấy ngẫu nhiên thả nuôi ao, mật độ thả 15 con/m2, thả bổ sung tôm không đánh dấu cho đủ mật độ Ao ni có bố trí dàn quạt khí, chế độ chăm sóc quản lý, cho ăn áp dụng quy trình ni thương phẩm tơm sú nơng dân áp dụng địa phương 43 Thời gian nuôi 80 ngày tôm đạt đến khối lượng trung bình 25 g/con Tơm cho ăn thức ăn viên công nghiệp hãng CP Việt Nam (hàm lượng protein > 45%), lượng cho ăn theo hướng dẫn nhà sản xuất khả sử dụng thức ăn cụ thể tôm 2.3.2.6 Phương pháp đánh dấu cá thể - Chuẩn bị phẩm màu Phẩm màu huỳnh quang (VIE) chuẩn bị theo hướng dẫn nhà sản xuất (công ty Northwest Marine Technology) Pha dung dịch màu (VIE) với chất xúc tác (cures) theo tỷ lệ 10 : Dung dịch sau trộn chuyển vào xi lanh 0,3 ml gắn với dụng cụ đánh dấu cầm tay Màu sau pha bảo quản điều kiện lạnh để tủ lạnh ngăn 40C đơn giản giữ hộp kín có nước đá tránh không để tiếp xúc trực tiếp với nước Phẩm màu bảo quản tốt sử dụng vịng 12 nữa, nhiên khơng nên sử dụng lại VIE bảo quản qua đêm - Phương pháp đánh dấu Phẩm màu tiêm vào lớp mặt bụng tôm giống, song song với lớp kitin Tiêm nhẹ nhàng tránh làm tổn thương lớp thịt tôm kết thúc trước kim tiêm rút khỏi thể tơm Trong q trình đánh dấu khơng cần phải gây mê tôm Các màu sử dụng gồm màu xanh dương, xanh cây, đỏ, hồng vàng Kết hợp loại màu vị trí tiêm (đốt bụng số số 6; bên trái, bên phải) với dấu đánh nhằm xác định tổ hợp dấu, sử dụng màu kết hợp tạo tương ứng 150 216 tổ hợp khác Trên thực tế nhà sản xuất phẩm màu huỳnh quang - công ty Northwest Marine Technology cung cấp 10 màu khác (5 màu phát xạ huỳnh quang, màu khơng) đánh dấu vị trí, sử dụng dấu tạo 600 tổ hợp dấu Các cá thể thuộc gia đình đánh dấu tổ hợp màu Tôm sau đánh dấu lưu giữ bể composite, sau ngày kiểm tra tỷ lệ sống, tỷ lệ tồn dấu trước thả nuôi đánh giá tăng trưởng hệ thống nuôi khác 44 2.4 Bố trí thí nghiệm 2.4.1 Bố trí thí nghiệm chọn lọc cặp mồi sử dụng để đánh giá biến dị di truyền microsatelite Sử dụng 29 cặp mồi tham khảo từ báo công bố tác giả Li (Li ctv, 2007); Pan (Pan ctv, 2004); Wuthi (Wuthi ctv, 2003); Xu (Xu ctv, 1999) Dựa cặp mồi có sản phẩm khuyếch đại 19 cặp mồi từ 29 cặp mồi để phân tích mồi đa hình 28 mẫu DNA tơm ngẫu nhiên, từ đánh giá hiệu suất PCR số allen cặp mồi để sàng lọc chọn cặp mồi cho hiệu suất PCR cao (15 cặp mồi), đồng thời có số alen cao thể tính đa hình để tiến hành chạy PCR đồng loạt để phân tích biến dị di truyền quần thể tôm Phân tích đa dạng di truyền mẫu tơm sú bố mẹ ban đầu thuộc bốn quần thể mẫu khác 15 cặp mồi sau chọn lọc từ 29 cặp mồi khảo sát 2.4.2 Bố trí tổ hợp lai tồn phần dịng tơm sú Các gia đình hệ G0 tạo từ 16 phép lai tổ hợp tồn phần dịng tơm (4 x = 16 tổ hợp lai) gồm tổ hợp lai nội dòng (AxA, TxT, NxN GxG) 12 tổ hợp lai khác dòng gồm (AxT, AxN, AxG, TxA, TxN, TxG, NxA, NxT, NxG, GxA, GxT, GxN) Sơ đồ lai trình bày Bảng 2.7 Bảng Bảng bố trí tổ hợp lai tồn phần dịng tơm Tơm đực Tơm Ấn Độ Dương (A) Thái Bình Dương (T) Nội địa (N) Gia hóa (G) Ấn Độ Dương (A) AxA TxA NxA GxA Thái Bình Dương (T) AxT TxT NxT GxT Nội địa (N) AxN TxN NxN GxN Gia hóa (G) AxG TxG NxG GxG 2.4.3 Bố trí lai tạo gia đình hệ G0 tạo hệ G1 2.4.3.1 Các tiêu chí chọn ghép cặp gia đình hệ G0 tạo G1 Dựa vào số chọn lọc: số chọn lọc (selection Index) phương pháp phối hợp giá trị kiểu hình tính trạng xác định thành điểm tổng hợp vào giá trị để định chọn không chọn cá thể Chỉ số chọn 45 lọc H Smith xây dựng từ năm 1936 ứng dụng vào chọn lọc trồng Hazel người ứng dụng số chọn lọc vào chọn giống động vật năm 1943 Trong nghiên cứu này, số Index xác định sau: - Từng gia đình xếp theo trung bình LSM khối lượng thu hoạch thứ tự từ cao xuống thấp - Từng gia đình xếp theo tỉ lệ sống theo thứ tự từ cao xuống thấp - Từng tính trạng (khối lượng tỉ lệ sống) cho hệ số Cho khối lượng xi, cho tỉ lệ sống yi - Như index gia đình i Ii = (xi  LSM khối lượng gia đình i) + (yi  tỉ lệ sống gia đình i) (Smith,1936; Hazel, 1943) - Các gia đình xếp theo giá trị Index, chia thành nhóm theo màu sắc khác để thuận lợi cho việc thao tác ghép cặp thiết kế sẵn theo sơ đồ lý thuyết Cụ thể đỏ (kí hiệu Đ) cho nhóm tơm có giá trị Index cao (> 110), vàng (kí hiệu V) cho nhóm tơm có giá trị Index Trung bình (110 − 90) xanh (kí hiệu X) cho nhóm tơm có giá trị Index thấp ( 110 đưa vào nhóm Cao; nhóm tơm Trung bình có Index nằm khoảng 110 – 90; nhóm Thấp có Index nhỏ 90 Tỉ trọng nhóm mong muốn giữ lại là: Cao 65 – 75%; Trung bình 20 – 30%; Thấp 5% tổng số gia đình G1 tạo Bảng Sơ đồ ghép cặp 16 tổ hợp tôm hệ G0 tạo hệ G1 Nhóm tơm Tơm đực AA AA AG AN AT GA GG GN GT NA NG NN NT TA TG TN TT AG 2 1 2 1 1 0 1 0 AN 2 1 2 1 AT 1 0 1 0 1 GA 2 1 2 1 1 0 1 0 GG 0 2 0 0 GN 1 2 1 2 1 47 Tôm GT NA 1 1 1 1 0 1 1 1 1 NG 1 2 1 2 1 NN 0 0 2 0 NT 0 1 0 1 1 2 1 2 TA 1 0 1 0 1 TG 1 2 1 2 TN 0 1 0 1 1 2 1 2 TT 0 0 0 2 2 2.4.4 Nuôi tăng trưởng đánh giá tương tác kiểu gen mơi trường - Ni bể an tồn sinh học: Tơm đánh dấu, trung bình 35 cá thể lấy ngẫu nhiên từ gia đình chia ni chung bốn bể an tồn sinh học bao gồm hai bể có diện tích 70 m2 hai bể có diện tích 60 m2 Các bể có diện tất gia đình nhằm đề phịng rủi ro nhiễm bệnh tơm chết hết bể Phương pháp nuôi mô tả chi tiết mục 2.3.2.4 - Nuôi ao đất: Sau đánh dấu, trung bình 120 cá thể/gia đình lấy ngẫu nhiên để thả nuôi ao ni tơm sú Nam Trung Bộ (Khánh Hịa), Tây Nam Bộ (Bạc Liêu) Đông Nam Bộ (Vũng Tàu) Tôm thả nuôi vùng sinh thái bao gồm đầy đủ 69 gia đình hệ G0 Quy trình nuôi thương phẩm ba ao nuôi thử nghiệm áp dụng quy trình có sẵn sử dụng địa phương Thời gian ni khoảng 80 ngày (tương ứng tháng tuổi tính từ hậu ấu trùng 15 đến thời điểm thu hoạch, tuổi thu hoạch thực tiễn nuôi tôm) để tôm đạt đến khối lượng trung bình khoảng 25 g (được mơ tả chi tiết mục 2.3.2.5) 2.5 Phương pháp phân tích xử lý số liệu 2.5.1 Phương pháp phân tích xử lý số liệu đánh giá đa dạng di truyền Các số liệu sau kiểm tra phần mềm Micro- Checker Version 2.2.0 mã hóa thành liệu đầu vào cho phần mềm GenAlEx - Genetic Analysis in Excel (Peakall Smouse, 2006) để tính tốn tần số alen, mức dị hợp tử quan sát (H0), mức dị hợp tử mong đợi (He), hệ số sai khác di truyền (Fst), hệ số cận huyết (FIS) Kiểm định độ lệch so với cân Hardy-Weinberg dựa thuật toán Markov chain (Guo Thompson, 1992) sử dụng phần mền Genepop 4.2 Kiểu gen: Một đặc tính bề ngồi truyền từ hệ sang hệ khác (phù hợp với sơ đồ Mendel) đặc tính phụ thuộc vào hai nhân tố vào hai gen nhân tố di truyền Cả hai gen tạo kiểu gen (genotype) cá thể cho đặc tính Cơng thức tính : quần thể, số allen n Số kiểu gen n(n+1)/2 Sử dụng giá trị Fst để xác định sai khác di truyền quần thể Hệ số 48 đánh giá mối liên hệ không ngẫu nhiên alen quần thể Fst tính theo cơng thức: Fst = (Ho – He)/Ho Trong Ho giá trị dị hợp tử quan sát, He giá trị dị hợp tử mong đợi Fst tương ứng với tần số alen khác quần thể Nếu Fst < 0,05 sai khác di truyền nhỏ Nếu 0,05 < Fst < 0,15 sai khác di truyền trung bình Nếu Fst > 0,15 sai khác di truyền lớn (Nei, 1974) 2.5.2 Phương pháp phân tích xử lý số liệu phục vụ đánh giá tăng trưởng dịng tơm khác phép lai hỗn hợp Trước thả nuôi chung gia đình cân khối lượng ngẫu nhiên 30 cá thể để ghi nhận khối lượng bắt đầu thả vào bể an toàn sinh học ao Sau thời gian nuôi khoảng 80 ngày tiến hành thu hoạch tồn số tơm bể ao Số liệu thu thập gồm khối lượng thân (g, sai số 0,1g), giới tính (đực/cái), bể ni tổ hợp dấu (để truy xuất gia đình) - Ước tính trung bình bình phương tối thiểu (Least square mean, LSM) Số liệu khối lượng thân tất gia đình/phép lai kiểm tra, rà sốt nhằm loại bỏ sai sót lỗi ghi chép, nhập số liệu, số liệu ngoại cỡ Dãy số liệu khảo sát phân bố Kết tính trạng khối lượng thân tôm sú phân bố gần với phân bố chuẩn Các thống kê mô tả thực phần mềm SAS phiên 9.3 (SAS Institute Inc., 2011) Mức độ ảnh hưởng (có khơng có ý nghĩa) ảnh hưởng cố định (fixed effect) mơ hình tốn đánh giá dựa theo Type III sum of squares sử dụng hàm GLM (General Linear Model, mơ hình tuyến tính tổng qt) SAS phiên 9.3 với độ tin cậy 95% Các tương quan kép hai ba chiều (two and three-way interactions) ảnh hưởng kiểm tra Tương quan khơng có ý nghĩa thống kê (P> 0,05) loại khỏi mơ hình Mơ hình chọn sau sàng lọc tất ảnh hưởng cố định hiệp biến là: Khối lượngijkl = µ + tổ hợp laii + giới tínhj + tuổi + khối lượng đánh dấu + bể nuôik + (tổ hợp lai  bể nuôi)l + số dưijkl (Mơ hình 1) Trong ‘khối lượngijkl’ khối lượng cá thể tôm l thu hoạch, µ trung 49 bình khối lượng quần thể, ‘tổ hợp laii’là ảnh hưởng cố định 16 phép lai, ‘giới tínhj’ ảnh hưởng cố định hai giới tính (đực, cái), ‘tuổi’ ảnh hưởng hiệp biến số ngày ni (ngày) tính từ giai đoạn hậu ấu trùng 15 đến đạt kích cỡ thu hoạch, ‘khối lượng đánh dấu’ ảnh hưởng hiệp biến khối lượng (g) trung bình gia đình thời điểm đánh dấu với cá thể gia đình coi có khối lượng đánh dấu, ‘bể nuôik’ ảnh hưởng cố định bể nuôi khác nhau, ‘(tổ hợp lai bể nuôi)l’ ảnh hưởng cố định tương quan kép 16 tổ hợp lai khác nuôi bể nuôi khác nhau, ‘số dưijkl’ ảnh hưởng phần dư Trung bình bình phương tối thiểu (LSM) khối lượng thân ước tính cho tổ hợp lai, sử dụng trắc nghiệm Tukey (α = 0,05) So sánh theo tôm bố tôm mẹ dịng ảnh hưởng ‘tổ hợp lai’ thay ảnh hưởng ‘ tôm bố’ ‘tôm mẹ’ 2.5.3 Phương pháp thu thập, phân tích xử lý số liệu phục vụ tính tốn thông số di truyền Khối lượng tôm cân đo thu hoạch Các số liệu quản lý kiểm tra phần mềm Microsoft Excel® 2010 Thống kê mơ tả, ảnh hưởng giới tính (tức khác biệt khối lượng tôm tôm đực) ảnh hưởng tôm bố (hoặc tơm mẹ) phân tích sử dụng phần mềm R 3.2.1 (R Core Team, 2015) Các thành phần phương sai ước tính phần mềm ASReml 3.0 (Gilmour ctv., 2009) 2.5.3.1 Phương pháp ước tính thành phần phương sai phục vụ đánh giá tương tác kiểu gen - môi trường (G x E) Các thành phần phương sai khối lượng thân môi trường i ước tính phần mềm ASReml phiên (Gilmour ctv., 2009) sử dụng mơ hình tuyến tính cá thể hỗn hợp (mơ hình 1, mục 2.5.2) - Tương tác kiểu gen − môi trường (G  E) hai môi trường nuôi Tương tác kiểu gen – môi trường (G  E) ước tính thơng qua tương quan di truyền(rg) tính trạng khối lượng thu hoạch bốn môi trường nuôi (Bạc Liêu, Vũng Tàu, Khánh Hòa bể ATSH) Theo đó, tính trạng khối lượng thu hoạch 50 bốn mơi trường ni khác xem bốn tính trạng khác Nhằm tận dụng tối đa số liệu, tương quan kiểu gen ước lượng đồng thời mơ hình tuyến tính bốn biến Do cá thể tôm nuôi môi trường nhất, nên hiệp phương sai môi trường nuôi mơ hình bốn biến thiết lập khơng (zero) (Bentsen ctv., 2012) Tương quan di truyền (rg) tính trạng khối lượng thu hoạch hai mơi trường ni ước tính theo cơng thức 𝑟𝑔 = 𝜎12 √𝜎12 ×√𝜎22 , 𝜎12 hiệp phương sai ảnh hưởng di truyền cộng gộp khối lượng thu hoạch hai môi trường, 𝜎12 𝜎22 phương sai ảnh hưởng di truyền cộng gộp tính trạng khối lượng thu hoạch mơi trường (Falconer Mackay, 1996) Mức độ tương tác kiểu gen – môi trường đánh giá theo Robertson (1959) tương tác kiểu gen – mơi trường có ý nghĩa sinh học rg < 0,8 ngược lại Nhận định chấp nhận rộng rãi chọn giống động vật (bao gồm thủy sản) ngày (Bourdon, 1999; Gjedrem, 2012) Quan điểm chấp nhận rộng rãi rg > 0,8 khơng có tương tác kiểu gen – mơi trường, rg < 0,8 có tương tác, rg < 0,65 tương tác cao Nếu rg > 0,85 tương tác thấp Tuy nhiên, mặt tốn học hồn tồn khơng có tương tác rg = 1, rg