Luan van Thao My CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM Độc lập – Tự do – Hạnh phúc Đơn vị chủ trì Trường Đại học Nguyễn Tất Thành BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI NCKH DÀNH CHO CÁN BỘ GIẢNG VIÊN 2016 2017 XÂY DỰN[.]
NTTU-NCKH-05 CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM Độc lập – Tự – Hạnh phúc Đơn vị chủ trì: Trường Đại học Nguyễn Tất Thành BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI NCKH DÀNH CHO CÁN BỘ - GIẢNG VIÊN 2016 - 2017 XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG CALOPHYLLOLID TRONG CHẾ PHẨM DẦU MÙ U BẰNG HPLC Số hợp đồng: 2017.01.46 Chủ nhiệm đề tài: ThS.DS Nguyễn Hoàng Thảo My Đơn vị công tác: Khoa Dược Thời gian thực hiện: 12 tháng Luận văn Thạc sĩ Dược học ii Mục lục MỤC LỤC MỤC LỤC ii DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT iv DANH MỤC HÌNH ẢNH v DANH MỤC BẢNG vi TÓM TẮT KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU vii ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 TỔNG QUAN VỀ MÙ U 1.1.1 Sơ lược Mù u 1.1.2 Tổng quan Dầu Mù u 1.1.3 Tổng quan hoạt chất Calophyllolid Dầu Mù u 1.2 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU VỀ DẦU MÙ U 10 1.2.1 Các nghiên cứu tiêu chuẩn kiểm nghiệm Dầu Mù u 10 1.2.2 Phương pháp định lượng hoạt chất Dầu Mù u 11 CHƯƠNG 2: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 12 2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 12 2.1.1 Nguyên liệu 12 2.1.2 Hóa chất – Dung môi 12 2.1.3 Trang thiết bị 12 2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 13 2.2.1 Khảo sát điều kiện xử lý mẫu 13 2.2.2 Khảo sát tính phù hợp hệ thống quy trình phân tích 15 2.2.3 Thẩm định quy trình phân tích 15 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 17 3.1 KẾT QUẢ KHẢO SÁT ĐIỀU KIỆN CHIẾT CALOPHYLLOLID TỪ DẦU MÙ U 17 3.1.1 Kết khảo sát dung môi chiết calophylloid từ dầu Mù U 17 3.1.2 Chiết cắn courmarin từ dầu Mù u 18 3.1.3 Xử lý mẫu kỹ thuật chiết pha rắn (SPE) 19 3.1.4 Khảo sát điều kiện sắc ký 20 Luận văn Thạc sĩ Dược học iii Mục lục 3.2 KẾT QUẢ KHẢO SÁT TÍNH PHÙ HỢP HỆ THỐNG 23 3.3 THẨM ĐỊNH QUY TRÌNH PHÂN TÍCH 24 3.3.1 Tính đặc hiệu 24 3.3.2 Tính tuyến tính 25 3.3.3 Độ lặp lại 26 3.3.4 Độ 27 CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN – KIẾN NGHỊ 28 TÀI LIỆU THAM KHẢO 29 Luận văn Thạc sĩ Dược học iv Danh mục từ viết tắt DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT ACN Acetonitril C Nồng độ CĐC Chất đối chiếu DCM Dicloromethan dd Dung dịch DĐVN IV Dược điển Việt Nam IV MeOH Methanol EtOH Ethanol H Chiều cao pic HL Hàm lượng HPLC High Performance Liquid Chromatography M Khối lượng N Số đĩa lý thuyết PA Purity angel PDA Photodiode array PT Purity threshold - ppm RS Độ phân giải S Diện tích pic SKC Sắc ký cột SKĐ Sắc ký đồ SKLM TLC Thin layer chromatography tR Thời gian lưu UV Định lượng Calophyllolide dầu Mù u HPLC - Nguyễn Hoảng Thảo My Luận văn Thạc sĩ Dược học Danh mục hình ảnh v DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 1.1 Một số sản phẩm từ Dầu Mù u .8 Hình 1.2 Cơng thức khai triển Calophyllolid Hình 1.3 Phản ứng mở vịng lacton Calophyllolid Hình 2.1 Mẫu dầu Mù u nguyên liệu 12 Hình 2.2 Cột chiết pha rắn (SPE ) cột sắc ký HPLC 13 Hình 2.3 Hình minh họa q trình “Thẩm định quy trình phân tích” 16 Hình 3.1 Kết khảo sát dung mơi chiết calophyllolid từ dầu Mù u 17 Hình 3.2 SKĐ mẫu thử Dầu Mù u với phương pháp chiết cắn courmarin qua tỉ lệ dung môi methanol – nước 18 Hình 3.3 Mẫu chuẩn trước sau xử lý qua SPE .19 Hình 3.4 SKĐ mẫu dầu Mù u chưa xử lý qua SPE .19 Hình 3.5 SKĐ mẫu dầu Mù u xử lý qua SPE methanol 90% 19 Hình 3.6 SKĐ mẫu Dầu Mù u qua SPE methanol 100% 20 Hình 3.7 Kết khảo sát Dầu Mù u hệ acetonitril – acid acetic (pH 3,0) 21 Hình 3.8 Kết khảo sát Dầu Mù u hệ methanol – acid acetic (pH 3,0) 22 Hình 3.9 Phổ overlay khảo sát tính phù hợp hệ thống quy trình định lượng calophyllolid Dầu Mù u HPLC 23 Hình 3.10 Các SKĐ thẩm định tính đặc hiệu quy trình định lượng calophyllolid Dầu Mù u phương pháp HPLC 25 Hình 3.11 Đường biểu diễn tương quan nồng độ diện tích pic calophyllolid 26 Hình 3.12 SKĐ overlay liệu SKĐ kết Độ lặp lại 27 Định lượng Calophyllolide dầu Mù u HPLC Nguyễn Hoảng Thảo My Luận văn Thạc sĩ Dược học vi Danh mục bảng DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1: Hàm lượng acid béo Dầu Mù u [13] .4 Bảng 1.2: MIC (µg/ml) dầu Mù u số vi khuẩn Bảng 3.1: Kết khảo sát tính phù hợp hệ thống quy trình định lượng calophyllolid Dầu Mù u (n=6) .23 Bảng 3.2: Kết thẩm định tính tuyến tính mẫu đối chiếu calophyllolid 25 Bảng 3.3: Kết khảo sát độ lặp lại quy trình định lượng calophyllolid Dầu Mù u phương pháp HPLC (n=6) 26 Bảng 3.4: Kết khảo sát độ .27 Bảng 3.5: Kết thẩm định quy trình định lượng calophyllolid dầu Mù u 28 Định lượng Calophyllolide dầu Mù u HPLC Nguyễn Hoảng Thảo My Luận văn Thạc sĩ Dược học Lời cam đoan vii TÓM TẮT KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU Sản phẩm đạt Sản phẩm đăng ký thuyết minh 01 quy trình định lượng Calophyllolid 01 quy trình định lượng Calophyllolid trong dầu Mù u phương pháp sắc ký dầu Mù u phương pháp sắc ký lỏng hiệu lỏng hiệu cao cao 01 báo cáo tổng kết đề tài 01 báo cáo tổng kết đề tài 01 báo 01 báo Thời gian đăng ký : từ ngày đến ngày Thời gian nộp báo cáo: ngày Định lượng Calophyllolide dầu Mù u HPLC Nguyễn Hoảng Thảo My Đặt vấn đề ĐẶT VẤN ĐỀ -Dầu Mù u, nguyên liệu ép từ Mù u (Calophyllum inophyllum Linn., Balsamaria inophyllum Lour.), thuộc họ Bứa (Guttiferae, Cluciasceae) Dầu Mù u nguyên liệu dân gian sử dụng từ thập niên 20 kỷ trước để điều trị bệnh thần kinh tọa Từ năm 1918, nhà khoa học Pháp bắt đầu nghiên cứu tác dụng chỗ da khả làm lành da dược liệu Khoa học đại có nhiều cơng trình chứng minh tác dụng dược lý dầu tính kháng viêm, kháng khuẩn [25], [20], trị sẹo [34],[42] chữa bỏng [18] mau lành vết thương [35], [38], Y học không ngừng phát triển, sản phẩm điều trị vết thương da cải tiến, nguyên liệu dầu Mù u vị thuốc thu hút quan tâm nhà Dược học nước sản phẩm [6], [7], [22], [31] -Kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu cao với đầu dò PDA cho phép định lượng hàm lượng hoạt chất lẫn độ tinh khiết đỉnh sắc ký để xác định xác hàm lượng mẫu phân tích mang lại nhiều ứng dụng ngành phân tích, kiểm nghiệm Việc xác định hàm lượng Calophyllolid dầu Mù u chưa có DĐVN IV hướng nghiên cứu nhiều nhà khoa học chế phẩm dạng dầu Trên sở đó; tơi tiến hành đề tài “Định lượng calophyllolid chế phẩm dầu Mù u HPLC ” nhằm giới thiệu kỹ thuật kiểm nghiệm dạng bào chế cách xử lí mẫu để làm sở cho việc đánh giá, quản lý chất lượng sản phẩm từ dược liệu Mù u Trong đó, đặc biệt trọng việc định lượng với chất đối chiếu marker phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao Định lượng Calophyllolide dầu Mù u HPLC Nguyễn Hoảng Thảo My Tổng quan tài liệu CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 TỔNG QUAN VỀ MÙ U 1.1.1 Sơ lược Mù u Tên khoa học: Calophyllum inophyllum Linn (Balsamaria inophyllum Lour.), thuộc chi Calophyllum chi lớn họ Bứa (Guttiferae, Cluciasceae) Tên gọi khác: Hồ đồng, Kungtung, Khchyong (Campuchia),YaraboTetihabocu (Nhật Bản), Alexandrian Laurel (Pháp), Dilo (Fiji), Kamanu (Hawail) [1], [3], [9] Mù u phân bố rộng rãi từ Thái Lan, Malaysia đến Lào, Campuchia, Indonesia số đảo Nam Thái Bình Dương số tỉnh miền Nam Trung Quốc, đặc biệt nhiều Ấn Độ Mù u thân mộc , cao đến 20 – 25 m, đường kính trung bình 30 – 35 cm Lá mọc đối, phía cuống lại, đầu tù, phiến dài 10 – 17 cm, gân nhỏ, chạy song song rõ hai mặt Hoa to, thơm, có màu trắng, mọc thành xim hay kẽ đầu cành đặc điểm bật phân biệt Mù u với loại thân mộc khác [5] Tại Việt Nam, dược liệu dân gian phân bố chủ yếu vùng núi thấp miền Bắc, miền Trung đặc biệt khu vực Tây Nam Bộ Khu vực miền Tây Nam Bộ với số tỉnh điển hình như: Tiền Giang, Long An, Bến Tre, Vĩnh Long, Đồng Tháp, Cần Thơ… thường gặp Mù u dọc theo bờ kênh rạch cao vùng cát ven bờ biển [5], [11] 1.1.2 Tổng quan Dầu Mù u Theo chuyên luận Mù u DĐVN IV; dầu Mù u (Oleum calophylii inophylii) định nghĩa dầu ép từ hạt Mù u tinh chế loại bỏ phần “nhựa” với thể chất dầu lỏng, sánh, màu vàng tới vàng sậm, mùi thơm hắc đặc trưng.[14] Các nghiên cứu nước việc ly trích Dầu Mù u từ hạt với phương pháp khác cho hàm lượng hoạt chất thành phần hóa học có khác biệt Năm 2016, Nguyễn Hữu Hiếu cộng khoa Kỹ thuật Hóa học – trường Đại học Bách Khoa TP.HCM tối ưu hóa q trình kỹ thuật lưu chất siêu tới hạn (SCF – CO2) phân tích thành phần hệ thống GC – MS so sánh với phương pháp ép học chiết với ether dầu hỏa.[8] Trước đó, xét quy mơ cơng nghiệp, luận án Đinh Văn Trạch (2013) sâu vào phương pháp ép lạnh học với hệ thống Định lượng calophyllolid dầu Mù u HPLC Nguyễn Hồng Thảo My Tổng quan tài liệu thu hồi dung môi nhằm nâng cao hiệu suất chiết xác định số thành phần kỹ thuật GC – MS HPLC.[21] Nghiên cứu công bố vào tháng 8/2017 Malaysia dùng kỹ thuật chiết siêu âm (Ultrasonic – assisted extraction, gọi tắt UAE) dùng mơ hình Patricelli để đánh giá động học q trình chiết xuất tối ưu hóa quy trình.[36] 1.1.2.1 Thành phần hóa học Từ năm 1985, nghiên cứu Mù u Khoa Dược – Đại học Y Dược TP.HCM PGS.TS Nguyễn Khắc Quỳnh Cứ cho thấy hạt Mù u chứa 41-51 % dầu thô, hàm lượng dầu béo chất nhựa dầu thô 71,5% 28,5% Các nghiên cứu tiếp nối Khoa Dược năm 2009 xác định rõ thành phần kỹ thuật GC-FID.[13] [17] Bảng 1.1: Hàm lượng acid béo Dầu Mù u [13] Thành phần acid béo Hàm lượng (%) Acid oleic 37,35 Acid linoleic 28,67 Acid palmitic 18,34 Acid stearic 15,32 Hoạt chất hạt Mù u thuộc nhóm 4-phenyl courmarin; hàm lượng courmarin xác định dầu Mù u thô 0,77% ; Dầu Mù u tinh chế 0,5% ; nhựa dư phẩm 0,15% bã phương pháp ép lạnh để chiết xuất dầu 1,75 – 2,13 % Các dẫn xuất courmarin quan trọng biết đến bao gồm: calophyllolid (C25H22O5), inophyllolid (C25H22O5), acid calophyllolid (C25H24O6), acid inophyllolid (C17H22O3)… [12], [13], [14] Theo liệu chuyên mục Mù u “Những thuốc vị thuốc Việt Nam (2007)” chuyên đề dầu Mù u (Tamanu oil) nhóm tác giả A.C.Dweck thành phần hóa học loại dầu Mù u thuộc khu vực Châu Á châu Phi cho thấy Tocopherol Tocotrienol xem chất chống oxi hóa tự nhiên tạo nên ổn định dầu Trong Calophyllum inophyllum L thành phần D-Tocotrienol (236,0 mg/kg), sau C-Tocotrienol với hàm lượng cao (64-130mg/kg) [5], [32] Định lượng calophyllolid dầu Mù u HPLC Nguyễn Hồng Thảo My Tổng quan tài liệu Nhìn chung, thành phần hóa học Dầu Mù u chia làm nhóm chính: nhóm lipid, chất có hoạt tính chống oxi hóa thành phần khơng lipid (các hợp chất courmarin, flavonoid…) 1.1.2.2 Tác dụng dược lý Hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm Các thực nghiệm nhóm nghiên cứu Đại học Paris Descartes (Pháp) cuối năm 2015 cho thấy nhóm hoạt chất phenyl courmarin cho hoạt tính kháng khuẩn điển hình nhất, kể vi khuẩn lao Mycobacterium tuberculosis Hoạt tính kháng khuẩn dầu Mù u thể mạnh vi khuẩn gram dương yếu vi khuẩn gram âm Dầu Mù u có hoạt tính kháng khuẩn rõ chủng Staphylococcus aureus Bacteroides fragilis tác dụng ức chế trực tiếp phân bào Các phân đoạn quy trình cho thấy tác động dầu Mù u tương tự ofloxacin khuyến nghị sử dụng điều trị bệnh ngồi da gây nhóm vi khuẩn gram dương.[35] Các nghiên cứu Khoa Dược – Đại học Y Dược TPHCM năm 2000 cho thấy hiệu diệt khuẩn tốt dòng vi khuẩn gram dương xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) dầu Mù u thô tinh chế Kết cho thấy dầu Mù u thô cho hiệu ức chế gấp đôi so với dầu qua tinh chế hay thành phẩm.[2] Bảng 1.2: MIC (µg/ml) dầu Mù u số vi khuẩn MIC Dầu Mù u thô MIC Dầu Mù u tinh chế (µg/ml) (µg/ml) Streptococcus faecalis 64 128 Streptococcus aureus 32 64 MRSA 64 128 Vi khuẩn Trong nhóm courmarin, calophyllolid có tác dụng ức chế tồn tăng trưởng Mycobacterium tubeculosis H37RV pha loãng nồng độ 1/20000 khơng có huyết , nồng độ 1/7500 với diện 5% huyết Acid calophyllic có hoạt tính với việc kìm hãm phát triển vi khuẩn nồng độ 1/7500 khơng có huyết 1/1000 có 5% huyết thanh.[16] [27] Định lượng calophyllolid dầu Mù u HPLC Nguyễn Hoàng Thảo My Tổng quan tài liệu Các xanthon phân lập từ Mù u cho thấy hoạt tính kháng khuẩn nhiều chủng vi sinh vật khác có Staphylococcus aureus theo thứ tự giảm dần 6-deoxyjacareubin, jacareubin calophyllin B 1,5-dihydoxyxanthon có tác dụng kháng Bacillus subtilis, Mycobacterium smegmatis, ức chế phát triển Cladosporium cucumerum với MIC 0,25 (µg/ml) 200 (µg/ml) với Staphylococcus aureus Hoạt chất thể tác dụng kháng nấm Aspergillus fumigatus Tác dụng mạnh vi nấm biết đến 1,3,5 – trihydroxy – 2- methoxyxanthon với tác dụng ức chế Aspergillus flavus, Aspergillus niger , Aspergillus fumigatus Candida albicans.[30], [33] Hoạt tính kháng viêm Các nghiên cứu Bangladesh vào năm 2017 cho thấy dịch chiết ethanol từ Mù u chứa flavonoid tương tự thành phần Dầu Mù u cho tác động kháng viêm, giảm đau rõ chế tác động cyclooxygenase làm giảm việc tiết prostaglandins gây đau Tác dụng giảm đau kháng viêm so sánh với chất đối chiếu Diclofenac.[25] Năm 2014, Muhamad Bin Zakaria cộng trường đại học quốc gia Malaysia tiến hành nghiên cứu hoạt tính kháng viêm dầu Mù u thô cho việc chiết xuất dầu Mù u thơ nồng độ 50µg/ml sẻ ức chế 77% cyclooxygenase 88% lipooxygenase cho thấy tác dụng kháng viêm tiềm dầu.[28] Trước đây, thử nghiệm thỏ cho thấy Dầu Mù u có tác dụng làm mau lành vết thương Gây vết thương cách cắt bỏ miếng da đầu thỏ, hàng ngày bôi Dầu Mù u lên vết thương, theo dõi đo đường kính vết thương thực xét nghiệm vi khuẩn giải phẫu bệnh lý [24] Hoạt tính kháng virus Quả dịch chiết từ Calophyllum inophyllum phân lập hai courmarin có hoạt tính chống lại phiên mã ngược virus HIV (+) – Inophyllum B (+) – Inophyllum P.[38] Thử nghiệm in vitro xanthon phân lập từ rễ cho hoạt tính kháng virus với hoạt chất có giá trị bật caloxanthon với việc chữa trị nhiễm coronavirus.[26], [29] Nhóm nghiên cứu phối hợp Singapore Trung Quốc đầu năm 2017 cho thấy Mù u phận chứa hoạt chất amentoflavon nhân tố tiềm Định lượng calophyllolid dầu Mù u HPLC Nguyễn Hoàng Thảo My Tổng quan tài liệu kháng virus lẫn hoạt tính chống oxi hóa, kháng viêm, kháng khối u tác động hệ thần kinh trung ương lẫn tim mạch Amentoflavone thể khả chống lại bệnh sốt xuất huyết cách ức chế RNA polymerase Amentoflavone chứng minh chất chủ động ức chế coronavirus hô hấp cấp tính nghiêm trọng (SARS-CoA) với IC50 8,3 μM Hiệu kết luận tương ứng với ức chế protease giống chymotrypsin Hơn nữa, trường hợp suy giảm miễn dịch người, virus (HIV) virus đồng hợp hơ hấp (RSV), Amentoflavone có kết tốt với IC50 119 μM 5,5 μg / mL.[42] Hoạt tính bảo vệ chống tia UV Dầu Mù u có đặc tính hấp thụ tia UV đáng kể hay tác nhân quang học Shanmugapriya cộng (2016) làm rõ hoạt tính giá trị Mù u phương diện kháng khuẩn, kháng ung thư, chống lão hóa hay trị đái tháo đường Dữ liệu nghiên cứu cho thấy nồng độ dầu mức 1/10000 (v/v) có tác dụng tế bào nhằm chống lại việc gây tổn thương DNA tia cực tím Nồng độ dầu mức 1% khơng có tác dụng gây hại tế bào biểu mơ người nên thường sử dụng da tác nhân chống nắng [38] Các hợp chất tự nhiên dầu điển hình cho hoạt tính flavonoid polyphenol với khả hấp thụ xạ cao khu vực UV–C đến UV–B cuối UV–A [40] 1.1.2.3 Công dụng trị liệu - Các thử nghiệm lâm sàng cho thấy Dầu Mù u ép từ hạt già có tác dụng tốt để trị ghẻ thuốc mỡ bào chế từ Dầu Mù u có tác dụng trị bỏng, mụn nhọt, lở loét Tác dụng áp dụng điều trị 350 ca lộ tuyến lộ tuyến viêm tử cung đạt kết lành tính 92% [10] - Dân gian dùng dầu mù u xoa bóp chữa tê thấp, bơi trị mụn trứng cá, trĩ Dầu Mù u bơi ngồi da làm tan chỗ sưng tấy, mụn nhọt hay vết loét nhiễm trùng, chữa đau họng, làm lành sẹo, để trị bỏng.[14], [23] - Ngoài dầu Mù u giúp dưỡng da, chống nắng, giữ ẩm cho da, đặc biệt cịn có tác dụng trị vết thâm, thẹo, vẩy nến hiệu [10] Định lượng calophyllolid dầu Mù u HPLC Nguyễn Hoàng Thảo My Tổng quan tài liệu 1.1.2.4 Các sản phẩm từ Dầu Mù u Trong nước Một số chế phẩm với nguyên liệu từ dầu Mù u biết đến như: “Dầu Mù u” công ty cổ phần dược Minh Hải, thuốc mỡ “Trăn Mù u” công ty cổ phần dược phẩm Quang Minh, chế phẩm “Dầu Mù u Inopilo” công ty trách nhiệm hữu hạn thương mại sản xuất dược phẩm Bình Minh, chế phẩm “Dầu Mù u SP” công ty dược phẩm Phương Nam …với mức TCCS gần tương đương tiêu chuẩn DĐVN IV Dạng chế phẩm khác với tác dụng trị viêm loét hay nấm da biết đến phổ biến dạng kem (Balsino) hay thuốc mỡ (Mecalin).[19] Hướng nghiên cứu PGS.TS.Võ Thị Bạch Huệ mở rộng số dạng bào chế ứng dụng khác từ dầu Mù u xà bông, gạc tẩm, gel, dạng dầu phối hợp dược liệu…cũng nghiên cứu thực nghiệm tiêu chuẩn hóa.[8], [13], [25] Ngồi nước Một số chế phẩm từ Dầu Mù u lưu hành Pháp Inocalo huile (dạng ống, thuốc mỡ thuốc trứng) có tác dụng mau làm lành sẹo, tái sinh mô, viêm da hay bỏng; ngồi Inocalo có iod phối hợp hỗ trợ việc phòng phong thấp Dạng phối hợp Calophyllum inophyllum với morphin bazơ viên nén 1mg, thuốc đạn 3mg hay thuốc ống 5ml nhằm chữa rối loạn thần kinh hay triệu chứng ho lâu ngày Ngồi ra, dịng sản phẩm dưỡng da lotion, kem, sữa rửa mặt hay xà từ dầu Mù u Hoa Kỳ đem lại hiệu sử dụng rõ rệt Hình 1.1 Một số sản phẩm từ Dầu Mù u Định lượng calophyllolid dầu Mù u HPLC Nguyễn Hoàng Thảo My Tổng quan tài liệu 1.1.3 Tổng quan hoạt chất Calophyllolid Dầu Mù u Calophyllolid tinh thể hình trụ, không màu, dễ tan aceton, n – hexan, benzen, ether ethylic hay alcol… Nhiệt độ nóng chảy: 158 – 159 oC, khơng có tính quang hoạt Các nghiên cứu nước dựa phổ UV, phổ NMR, phổ tia X xác định công thức khai triển calophyllolid.[22], [34] Tính chất hóa học Calophyllolid thuộc nhóm courmarin nên phản ứng đặc trưng cho nhóm chức biết đến bao gồm: phản ứng mở vòng lacton, phản ứng diazo hóa, phản ứng phát huỳn quang, phản ứng FeCl3 hay phản ứng vi thăng hoa Với phản ứng mở vịng lacton, calophyllolid mơi trường kiềm cho acid calophyllolid đun nóng lacton hố trở lại cho dạng ester vịng Hình 1.2 Cơng thức khai triển Hình 1.3 Phản ứng mở vịng lacton của Calophyllolid Calophyllolid Chiết xuất calophyllolid Calophyllolid thuộc nhóm coumarin chất phân cực yếu nên đa số tan ether dầu ether ethylic Nhiều trường hợp thu tinh thể coumarin dung dịch ether dung mơi ether dầu Do có mặt nhóm lacton, số coumarin tan kiềm nóng, dịch kiềm acid hố thu lại courmarin Các glycosid coumarin chiết dung dịch cồn lỗng (EtOH, Methanol 60-80%) Dược liệu có nhiều chất béo nên sơ loại chất béo ether dầu Dịch chiết cồn loại chất béo kết tinh coumarin sau bốc dung môi.[30] Năm 2002, Trần Thanh Thạo nhóm nghiên cứu áp dụng phương pháp Spath Socias dựa vào đóng mở vịng lacton để chiết xuất calophyllolid Định lượng calophyllolid dầu Mù u HPLC Nguyễn Hoàng Thảo My 10 Tổng quan tài liệu Nghiên cứu sử dụng NaHCO3 làm tác nhân mở vịng acid hóa lại HCl 10% chiết với benzen để thu cắn courmarin Sau đó, sử dụng sắc ký cột để phân lập hoạt chất.[23] Đối với dẫn chất coumarin có nhiều nhóm OH coumarin glycosid khó tan dung môi hữu cơ, phenol coumarin dễ bị oxy hố khơng khí mơi trường kiềm, acyl coumarin dễ bị cắt nhóm acyl môi trường kiềm nên phương pháp Spath bị hạn chế Trong trường hợp nên chiết dung môi phân cực tăng dần độ phân cực Bốc dung mơi, kiểm tra có mặt coumarin tách biệt dẫn chất coumarin sắc kí cột Năm 2003, Chen cộng chiết từ dầu với EtOH phân bố EtOAc dùng sắc ký cột lẫn sắc ký lớp mỏng điều chế để phân lập [67] Năm 2009, Leu cộng phân lập calophyllolid từ nhựa trung tính nhựa acid thu tinh chế dầu thô ép từ hạt Calophyllum inophyllum vùng Polynesia (Pháp).[28] 1.2 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU VỀ DẦU MÙ U 1.2.1 Các nghiên cứu tiêu chuẩn kiểm nghiệm Dầu Mù u 1.2.1.1 Trong nước Các nghiên cứu nước tiêu chuẩn hóa dầu nhiều nhóm nghiên cứu chuyên ngành khác thực Nhóm tác giả thường tinh chế xây dựng quy trình điều chế đưa tiêu chuẩn sơ cho thành phẩm.[19] Các tiêu chung dạng dầu quan tâm là: số acid, số xà phịng hóa Chỉ số peroxyd, số iod, độ nhớt, tỷ trọng định tính, định lượng hàm lượng hoạt chất theo phương pháp thử DĐVN IV [28] 1.2.1.2 Nước Các tiêu quan tâm tiêu chuẩn hóa dạng dầu bao gồm tiêu lý hóa nghiên cứu Việt Nam bổ sung số tiêu chí phù hợp với khu vực độ ẩm, tỷ trọng mức nhiệt độ khác Những nghiên cứu đầu năm 2017 hướng đến điều chế dạng nhiên liệu sinh học dạng ester dầu Mù u, thơng số ban đầu để xác định nguyên liệu không bị pha lẫn cần thiết.[41] Ngoài ra, nghiên cứu dầu Nghệ trọng vào việc xác định thành phần dựa vào kỹ thuật sắc ký.[37] Định lượng calophyllolid dầu Mù u HPLC Nguyễn Hoàng Thảo My 11 Tổng quan tài liệu 1.2.2 Phương pháp định lượng hoạt chất Dầu Mù u 1.2.2.1 Phương pháp định lượng hoạt chất calophyllolid phương pháp HPLC Calophyllolid thuộc nhóm courmarin nên hướng nghiên cứu thường hướng đến chiết xuất định lượng nhóm chức Tùy vào loại mẫu khác mà cách xử lí mẫu có khác biệt Frederic cộng dùng cột silica (Uptisphere), lỗ sốp 120 Ao, hạt µm, kích thước 250 mm x 4,6 mm để tách coumarin khác có Mù u Calophyllum inophyllum hệ thống HPLC tiêm mẫu tự động với đầu dò UVDAD.[23] Những nghiên cứu sau xác định hàm lượng calophyllolid mẫu dầu Mù u khác theo hai hướng: tạo cắn courmarin bơm mẫu trực tiếp [6], [15], [21] Kỹ thuật HPLC thường dùng phối hợp với số kỹ thuật khác GC, NMR, IR…trong việc thiết lập chất chuẩn đối chiếu calophyllolid [4], [7] 1.2.2.2 Định lượng hoạt chất chế phẩm phương pháp khác Kỹ thuật GC-MS kỹ thuật thứ hai sau HPLC lựa chọn nghiên cứu định lượng hoạt chất calophyllolid Bên cạnh đó, phổ UV, IR , NMR giúp xác định cấu trúc chất phân lập Ngoài ra, kỹ thuật DSC góp phần xác định độ tinh khiết chất Một số nghiên cứu tiến hành so sánh hai kỹ thuật để đưa mức chất lượng chung cho tiêu hàm lượng [7], [29] Định lượng calophyllolid dầu Mù u HPLC Nguyễn Hoàng Thảo My 12 Phương pháp nghiên cứu CHƯƠNG 2: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 2.1.1 Nguyên liệu Nguyên liệu thử nghiệm: chế phẩm dầu Mù u nhóm nghiên cứu điều chế Hình 2.1 Mẫu dầu Mù u nguyên liệu 2.1.2 Hóa chất – Dung mơi Dung mơi - hóa chất sử dụng cho thử nghiệm số dầu Mù u, SKLM: benzene, diethyl ether, chloroform, aceton, ethyl acetat, ethanol, methanol, natri carbonat, acid acetic, hydrocloric, kali hydroxyd, natri hydroxyd phân tích Trung quốc sản xuất Dung mơi - hóa chất sử dụng cho thử nghiệm phương pháp HPLC SPE: methanol, acetonitril đạt tiêu chuẩn HPLC; acid phosphoric, acid acetic acid formic đạt tiêu chuẩn phân tích Merck sản xuất Tải FULL (38 trang): https://bit.ly/3RW7XW2 Chất đối chiếu: Dự phịng: fb.com/TaiHo123doc.net Calophyllolid (92,93%), số lơ Cal03/0-1/17 Dầu Mù u chuẩn Viện Kiểm nghiệm thuốc TpHCM cung cấp 2.1.3 Trang thiết bị Các trang thiết bị Hệ thống HPLC Alliance 2695-2996, đầu dò PDA Bản sắc ký silica gel F254 (Merck) Cân phân tích Sartorius PB 221S độ nhạy 0,1mg Cân phân tích Sartorius 255D độ nhạy 0,01mg Định lượng calophyllolid dầu Mù u HPLC Nguyễn Hoàng Thảo My 13 Phương pháp nghiên cứu Máy đo pH Metrohm 744 Cột sắc ký Inerstil (250 x 4,6 mm; μm) Cột chiết mẫu pha rắn SPE C18-E (Agilent) Cột chiết mẫu pha rắn SPE Strata C18-E (Phenomenex) Bể siêu âm Elma S30H, tần số 37kHz, công suất 280W Bếp cách thủy Memmert WNB29 Và trang thiết bị – dụng cụ thơng thường dùng phịng thí nghiệm Hình 2.2 Cột chiết pha rắn (SPE ) cột sắc ký HPLC 2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.2.1 Khảo sát điều kiện xử lý mẫu Khảo sát điều kiện xử lý mẫu thực mẫu Dầu Mù u (NCLo1016) theo bước sau: Tải FULL (38 trang): https://bit.ly/3RW7XW2 Dự phòng: fb.com/TaiHo123doc.net - Khảo sát dung mơi hịa tan mẫu: methanol acetonitril, chọn dung mơi hịa tan calophyllolid, tạp đường SKĐ HPLC ổn định - Chiết cắn courmarin: sử dụng dung mơi hịa tan khảo sát để chiết coumarin toàn phần từ dầu Mù u - Chiết kỹ thuật chiết pha rắn (SPE): mẫu coumarin toàn phần xử lý kỹ thuật SPE Khảo sát dung môi rửa giải qua SPE, chọn phân đoạn có tín hiệu tương đương với pic calophlloid SKĐ SKLM HPLC Tiến hành song song với mẫu chuẩn để đảm bảo tỷ lệ phục hồi calophyllolid > 98% Quy trình kiến nghị: Định lượng calophyllolid dầu Mù u HPLC Nguyễn Hoàng Thảo My 14 Phương pháp nghiên cứu - Khảo sát dung môi chiết: cân khoảng 2,0 g dầu Mù u cho vào bình định mức 20 ml, làm ấm mẫu 60 oC 10 phút, thêm 12 ml methanol acetonitril, siêu âm 15 phút, điền đến vạch, thu dung dịch thử, lọc qua màng lọc 0,45 µm triển khai HPLC với điều kiện dự kiến trình bày Mục 3.2.1.2 Chọn dung mơi chiết cho SKĐ có độ phân giải (Rs) pic calophyllolid > 1,5; pic tạp, đường ổn định - Chiết cắn courmarin toàn phần: chọn dung môi chiết thử nghiệm để chiết coumarin tồn phần từ Dầu Mù u Cân xác khoảng g dầu Mù u, thêm 15 ml methanol, khuấy từ 10 phút có gia nhiệt 60 oC (x lần) Để nguội, lọc lấy dịch cồn Gộp chung dịch chiết, thu hồi dung môi đến cắn Hoà tan cắn với 1,5 ml natri carbonat 10%, chuyển tồn lớp natri carbonat vào bình lắng 60 ml, chiết tiếp với 10 ml ether ethylic (x lần) Để yên cho tách lớp, rút gộp chung dịch ether ethylic, rửa nước cất đến trung tính Thu hồi dung mơi đến cắn courmarin tồn phần - Xử lý mẫu coumarin kỹ thuật SPE: - Cột SPE C18-E (Agilent) - Tiến hành: cho toàn lượng cắn courmarin thu qua SPE Dung môi rửa giải khảo sát có độ phân cực dần từ nước (điều chỉnh pH) phối hợp với acetonitril methanol Dịch rửa giải thu từ phân đoạn (PĐ) sau SPE tiêm vào hệ thống HPLC với điều kiện dự kiến trình bày Mục 3.2.1.2 Trên SKĐ HPLC thu được, lựa chọn PĐ rửa giải > 98% calophylloid Từ liệu thực nghiệm, hồn chỉnh quy trình xử lý mẫu dầu Mù u để phân tích định tính định lượng calophyllolid phương pháp HPLC Khảo sát điều kiện sắc ký Khảo sát điều kiện sắc ký sau: - Thành phần pH pha động: methanol acetonitril phối hợp với nước dung dịch acid tỷ lệ phù hợp cho tách độ cân đối pic calophyllolid đạt yêu cầu - Kỹ thuật rửa giải: sau lựa chọn điều kiện sắc ký cho SKĐ đạt yêu cầu độ phân giải, tiến hành khảo sát thêm hai kỹ thuật rửa giải đẳng dòng chương Định lượng calophyllolid dầu Mù u HPLC Nguyễn Hoàng Thảo My 6157170 ... hi? ?u [10] Định lượng calophyllolid d? ?u Mù u HPLC Nguyễn Hoàng Thảo My Tổng quan tài li? ?u 1.1.2.4 Các sản phẩm từ D? ?u Mù u Trong nước Một số chế phẩm với nguyên li? ?u từ d? ?u Mù u biết đến như: ? ?D? ?u. .. đạt Sản phẩm đăng ký thuyết minh 01 quy trình định lượng Calophyllolid 01 quy trình định lượng Calophyllolid trong d? ?u Mù u phương pháp sắc ký d? ?u Mù u phương pháp sắc ký lỏng hi? ?u lỏng hi? ?u cao... thẩm định quy trình định lượng calophyllolid d? ?u Mù u 28 Định lượng Calophyllolide d? ?u Mù u HPLC Nguyễn Hoảng Thảo My Luận văn Thạc sĩ Dược học Lời cam đoan vii TÓM TẮT KẾT QUẢ NGHIÊN C? ?U Sản phẩm