Tổng hợp 2-methylketone nhờ cải biến biến dưỡng tế bào vi khuẩn
Khuất Lê Uyên Vy cộng Tạp chí Khoa học Đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh, 13(1), 55-65 55 Tổng hợp 2-methylketone nhờ cải biến biến dưỡng tế bào vi khuẩn Metabolic engineering of bacteria for the production of 2methylketones Khuất Lê Uyên Vy1*, Phạm Thị Mỹ Bình1, Nguyễn Thị Hồng Thương1, Mai Huỳnh Hạnh Phúc2, Đinh Minh Hiệp3 Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh, Việt Nam Công ty Cổ phần dịch vụ Khoa học Công nghệ Chấn Nam, Việt Nam Ban quản lý Khu Nơng nghiệp Cơng nghệ cao Thành phố Hồ Chí Minh, Việt Nam * Tác giả liên hệ, Email: kluvy@hcmus.edu.vn THÔNG TIN DOI:10.46223/HCMCOUJS tech.vi.13.1.801.2018 Ngày nhận: 29/12/2017 Ngày nhận lại: 12/01/2018 Duyệt đăng: 15/01/2018 Từ khóa: 2-methylketone, kỹ thuật biến dưỡng, methylketone synthase TÓM TẮT 2-Methylketone chất tạo hương quan trọng ngành công nghiệp thực phẩm mỹ phẩm Ở thực vật, 2Methylketone chủ yếu có vai trị giúp trồng đối kháng với sâu hại Gần đây, 2-Methylketone xem nguồn nguyên liệu tiềm cho sản xuất lượng sinh học Việc khám phá hai gene methylketone synthase (ShMKS1) methylketone synthase (ShMKS2) mã hóa cho hai enzyme tham gia sinh tổng hợp methylketone loài cà chua dại Solanum habrochaites gene tương đồng với chúng số loài thực vật khác tạo nguồn gene cho nghiên cứu cải biến vi sinh vật nhằm tạo chủng có khả sinh tổng hợp methylketone Trong báo này, số kết đạt bước đầu nghiên cứu kỹ thuật biến dưỡng (metabolic engineering) hướng đến tối ưu hóa khả sản xuất methylketone nhờ vi khuẩn cập nhật phân tích Trên sở đó, chúng tơi bàn luận hội thách thức kèm, đồng thời thảo luận số đề xuất cải tiến cho nghiên cứu ABSTRACT 2-Methylketone is a class of compounds that are commonly used to flavor some foods and to improve the appeal of cosmetics 2-Methylketones can act as a natural insecticide with low mammalian toxicity and little or no impact on the environment Recently, methylketone has received more attention as a potential source of biodiesel The discovery of two 56 Khuất Lê Uyên Vy cộng Tạp chí Khoa học Đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh, 13(1), 55-65 Keywords: 2-methylketone, methylketone synthase, metabolic engineering genes encoding two enzymes necessary for methylketone biosynthesis in the wild type tomato Solanum habrochaites, designated methylketone synthase (ShMKS2) and methyl ketone synthase (ShMKS1), and their homogeneous genes in some other plants have provided sources of the gene for metabolically engineering bacteria for the production of the 2methylketone In this paper, we include new results achieved in this area in the past few years The study sought to identify challenges and opportunities posed by the examples and to develop innovative suggestions for further research 2-Methylketone tiềm ứng dụng 2-Methylketone nhóm hợp chất hữu có nguồn gốc từ axit béo chứa nhóm ketone nguyên tử carbon thứ hai 2-Methylketone phát vào năm 1858 tinh dầu cửu lý hương Ruta graveolens (Williams, 1858) sau tìm thấy vi sinh vật, thực vật, côn trùng tế bào động vật hữu nhũ (Forney & Markovetz, 1971) Methylketone tồn tự nhiên đa dạng chiều dài chuỗi: methylketone chuỗi ngắn có khung carbon dài 3-9 nguyên tử carbon, methylketone chuỗi trung bình gồm 11-13 nguyên tử carbon, methylketone chuỗi dài 15-17 nguyên tử carbon Tùy thuộc vào chiều dài chuỗi, hợp chất methylketone có vai trò khác sinh giới ứng dụng lĩnh vực khác Methylketone tìm thấy thực vật thường có từ 7-15 ngun tử cacbon: 2-heptanone (7C), 2-nonanone (9C), 2-undecanone (11C), 2-tridecanone (13C) 2-pentadecanone (15C) Một vài nghiên cứu chứng minh 2-methylketone, đặc biệt 2-tridecanone, tìm thấy thực vật nhóm hợp chất có tính kháng sâu tự nhiên, hỗ trợ trồng chống lại sâu bệnh gây hại (Dimock & Kennedy, 1983) Một số nghiên cứu tác động gây độc methylketone người gia súc cho thấy methylketone gây chết loại trùng gây hại khơng có tác động gây độc người gia súc (Antonious, 2004) Ngoài thực vật, methylketone phát số lồi trùng 2-Pentadecanone xác định thành phần chất dẫn dụ giới tính (pheromone) tổng hợp nhiều ruồi giấm Drosophila busckii (Schaner, Tanico-Hogan, & Jackson, 1989) 2-Tridecanone, 2-pentadecanone 2-heptadecanone phát thành phần hợp chất bay tiết từ tuyến hậu mơn lồi ong Frieseomelitta varia (Patricio, López, Maile, & Morgan, 2003) 2-Heptanone cịn tìm thấy tuyến hàm kiến Atta texana Conomyrma pyramica có tác dụng thu hút xua đuổi loài khác tùy thuộc vào hợp chất tiết với hàm lượng thấp hay cao (Blum & Warter, 1966; Moser, Brownlee, & Silverstein, 1968) Trong năm 1950 -1970, nhà khoa học phát methylketone diện môi trường nuôi cấy nhiều lồi vi khuẩn nấm Điển Mycobacterium rhodochrous tổng hợp 2-undecanone từ n-undecane (Lukins & Foster, 1963) hay Pseudomonas methanica Mycobacterium smegmatis tổng hợp methylketone chuỗi ngắn 2-butanone, 2-pentanone 2-hexanone từ nguồn alkane tương ứng chúng (Leadbetter & Foster, 1959; Lukins & Foster, 1963) Nấm Penicillium caseicolum phân lập từ phơ mai Camembert có khả tạo lượng lớn methylketone có mạch carbon dài từ Khuất Lê Uyên Vy cộng Tạp chí Khoa học Đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh, 13(1), 55-65 57 C3-C13 từ chất sữa bột (Karahadian, Josephson, & Lindsay, 1985) Từ lâu, methylketone sử dụng làm chất tạo hương cho sản phẩm từ sữa (Forney & Markovetz, 1971) Một số methylketone chuỗi ngắn thành phần tạo hương vị đặc trưng cho phô mai xanh 2-propanone, 2-pentanone, 2-heptanone 2-nonanone (Alonso, Fontecha, & Juárez, 1999) Tại Mỹ, hỗn hợp tạo hương vị đặc biệt kem nhiều người ưa thích bao gồm axit 9-decenoic hỗn hợp 2-undecanone, 2-tridecanone 2-pentadecanone (Sevenants, 1983) 2-Nonanone, 2-undecanone, 2-tridecanone, 2-pentadecanone cho phép sử dụng làm hương liệu cho thực phẩm, nước hoa tinh dầu Cục Quản lý Thực phẩm Dược phẩm Mỹ (như GRAS) (Hall & Oser, 1965) Đáng ý hơn, gần methylketone nhận nhiều quan tâm nhà nghiên cứu lượng sinh học nhóm hợp chất có trị số kích nổ cetane cao Hỗn hợp 2-undecanone 2-tridecanone với tỉ lệ 50/50 khối lượng có trị số kích nổ cetane 58,4 (Goh, Baidoo, Keasling, & Beller, 2012) Methylketone có tính ưa nước nhiệt độ nóng chảy thấp axit béo sử dụng nhiều sản xuất dầu diesel sinh học, nhóm hợp chất hứa hẹn lựa chọn việc sản xuất nguồn nhiên liệu sinh học tái sinh, an tồn thân thiện với mơi trường, thay cho nguồn nhiên liệu dầu mỏ khí đốt ngày cạn kiệt Sinh tổng hợp methylketone đường chuyển hóa chun biệt số lồi thực vật? Mặc dù ứng dụng 2-methylketone biết đến từ lâu, nghiên cứu sở phân tử trình sinh tổng hợp hợp chất methylketone thực vật công bố năm gần loài cà chua dại Solanum habrochaites Các nhà nghiên cứu nhận thấy hai gene ShMKS1 ShMKS2 biểu mạnh tế bào lông tiết thân cà chua dại tích lũy nhiều methylketone lại biểu cà chua hóa S lycopersicum tích lũy lượng khơng đáng kể methylketone Trên sở đó, hai gene phân lập nghiên cứu chức (Ben-Israel et al., 2009; Fridman et al., 2005; Yu et al., 2010) Gene thứ nhất, ShMKS2, mã hóa cho protein thuộc nhóm thioesterase II với đặc trưng chứa vùng gấp cuộn “hotdog” ShMKS2 có hoạt tính 3-ketoacyl-ACP thioesterase, xúc tác phản ứng thủy phân liên kết thioester chất 3-ketoacyl-ACP, chất trung gian đường sinh tổng hợp axit béo diễn lục lạp thể thực vật, để tạo thành 3-ketoaxit tương ứng Gene thứ hai, ShMKS1, mã hóa cho protein thuộc nhóm thioesterase I với đặc trưng chứa vùng gấp cuộn kiểu “α/β hydrolase” Tuy nhiên, loài cà chua dại, ShMKS1 khơng có hoạt tính hydrolase đa số thành viên khác nhóm enzyme mà lại thể hoạt tính 3-ketoaxit decarboxylase (Auldridge et al., 2012), xúc tác phản ứng khử nhóm carbonyl 3-ketoaxit để tạo thành sản phẩm chuyển hóa cuối 2-methylketone có chiều dài chuỗi ngắn nguyên tử carbon Hai bước phản ứng cuối đường sinh tổng hợp methylketone diễn loài cà chua dại mơ tả Hình 58 Khuất Lê Uyên Vy cộng Tạp chí Khoa học Đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh, 13(1), 55-65 Hình Chuỗi phản ứng tổng hợp methylketone (Yu et al., 2010) Một lượng nhỏ methylketone đơi tìm thấy lồi thực vật khác chi Solanum (Henricsson, Westerholm, Nilsson, & Berggren, 1996; Jasperson & Jones, 1947) chế sinh tổng hợp methylketone loài chưa xác định Sự diện protein tương đồng với MKS1 MKS2 lồi khác khơng thuộc chi Solanum đặt câu hỏi hai protein có tham gia q trình tổng hợp methylketone, dù với lượng nhỏ, loài thực vật không? Và cách hai protein ShMKS1 ShMKS2 có khả xúc tác sinh tổng hợp lượng đáng kể methylketone loài cà chua dại? Câu trả lời là: chức (hoạt tính) MKS2 gì, gia tăng biểu gene dẫn đến làm tăng hoạt tính enzyme thay thế, vốn mức thấp, protein mã hóa gene Kết kết hợp với gia tăng đồng thời dịng chuyển hóa tổng hợp axit béo làm tăng lượng methylketone tổng hợp so với ban đầu (do 3ketoaxit decarboxyl hóa phần điều kiện thường thành methylketone) Do methylketone có hoạt tính kháng trùng sâu hại, có khả tổng hợp methylketone có ưu so với khác kết đặc tính giữ lại qua q trình chọn lọc tự nhiên lâu dài Tuy nhiên, phần nhỏ 3-ketoaxit chuyển hóa thành methylketone biểu vượt mức protein ShMKS2 mà không kèm với diện enzyme decarboxylase dẫn đến tích lũy lượng lớn chất trung gian 3ketoaxit, gây trở ngại cho trình sinh tổng hợp axit béo Vì lẽ đó, enzyme MKS1 ngun với hoạt tính khử nhóm carbonyl 3-ketoaxit mức độ thấp chọn lọc tự nhiên giữ lại để mang lại lợi ích cho cách khử nhóm carbonyl 3-ketoaxit gia tăng tổng hợp methylketone kháng sâu hại Điều thú vị ShMKS2 cà chua dại protein tương đồng với ShMKS2 số loài thực vật khác xúc tác cho phản ứng thủy phân tương tự nhau, đề nghị hoạt tính thioesterase MKS2 vốn xuất từ lâu lịch sử tiến hóa Ngược lại, protein ShMKS1 SlMKS1a lại khác với protein tương đồng với chúng tìm thấy loài khác Sự thay Ser ba xúc tác cần thiết cho hoạt động α/β-hydrolase nhiều protein họ α/β-hydrolase Ala (ở vị trí 87 ShMKS1) khiến cho ShMKS1 SlMKS1a khơng có hoạt tính hydrolase protein tương đồng (Hotelier et al., 2004) Như vậy, hoạt tính 3-ketoaxit decarboxylase ShMKS1 dường xuất gần đây, chi Solanum Sự tiến hóa chức MKS1 thay đổi mức độ biểu ShMKS2 ShMKS1 cà chua dại khiến cho lồi thực vật có khả tổng hợp tích lũy nhiều methylketone lơng tiết thân Ngoài cà chua dại Solanum habrochaites có khả tổng hợp nhiều methylketone chuỗi trung bình, nghiên cứu sơ khởi gần nhóm chúng tơi xác định thêm lồi thực vật đặc hữu Việt Nam có khả tổng hợp nhiều methylketone chuỗi dài lan Giả hạc Dendrobium superbum (dữ liệu chưa công Khuất Lê Uyên Vy cộng Tạp chí Khoa học Đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh, 13(1), 55-65 59 bố) Những nghiên cứu sở di truyền sinh hóa q trình sinh tổng hợp methylketone lồi góp phần làm sáng tỏ thêm hiểu biết đa dạng nguồn gene MKS2 thực vật Kết từ công bố khoa học nêu phần cho thấy sinh tổng hợp methylketone đường chuyển hóa chuyên biệt số loài thực vật với chức tìm thấy kháng trùng sâu hại Hoạt tính enzyme protein mã hóa MKS2 MKS1 Khi biểu cà chua dại biểu tái tổ hợp vi khuẩn E coli, ShMKS2 thủy phân hiệu chất 3-ketomyristoyl-ACP 3-ketolauroyl-ACP tạo thành 3-ketoaxit tương ứng axit 3-ketomyristic (14C) axit 3-ketolauric (12C), ShMKS1 có hoạt tính decarboxylase khử nhóm carboxyl 3-ketoaxit tạo thành 2methylketone (Yu et al., 2010) Cấu trúc tinh thể protein enzyme ShMKS1 xác định (Auldridge et al., 2012) Kết phân tích cho thấy ShMKS1 thành viên khác biệt thuộc họ α/β-hydrolase (thioesterase nhóm I), ba axit amin có vai trò xúc tác đa số enzyme họ α/βhydrolase Ser-His-Asp thay ba Ala-His-Asn Kết ShMKS1 có hoạt tính decarboxylase thay hoạt tính hydrolase đa số thành viên khác họ enzyme Thông tin cấu trúc tinh thể ShMKS1 sở để tiến hành nghiên cứu vai trò số axit amin trung tâm hoạt động enzyme ShMKS1 tính đặc hiệu chất enzyme Cụ thể, thay đổi amino axit Cysteine thứ 125 thành Tryptophan (W) Glycine thứ 129 (G) thành Tryptophan (W) giúp tăng hoạt tính xúc tác enzyme ShMKS1 lên tương ứng 32 44 lần chất chuỗi ngắn 3-ketoheptanoate (C8) (Auldridge et al., 2012) Cho đến cấu trúc tinh thể ShMKS2 protein tương đồng với ShMKS2 từ loài thực vật khác chưa xác định Tuy nhiên, nhà khoa học có chứng thực nghiệm cho thấy ShMKS2 thioesterase có cấu trúc gấp cuộn kiểu “hotdog”tương tự với enzyme 4- hydroxybenzoyl-CoA thioesterase (4HBT) tìm thấy vi khuẩn Pseudomonas sp (Benning et al., 1998) hai protein tương đồng