Xây dựng phương pháp phân tích irbesartan và hydroclorothiazid trong huyết tương người

Bài viết Xây dựng phương pháp phân tích irbesartan và hydroclorothiazid trong huyết tương người trình bày quá trình xây dựng và thẩm định một phần quy trình phân tích irbesartan (IRB) và hydroclorothiazid (HCTZ) trong huyết tương người bằng kĩ thuật LC-MS/MS. Phương pháp phân tích đã sử dụng telmisartan làm chuẩn nội để xác định irbesartan và hydroclorothiazid. Mời các bạn cùng tham khảo bài viết!

Tạp chí Khoa học & Cơng nghệ Số 16 30 Xây dựng phương pháp phân tích irbesartan hydroclorothiazid huyết tương người Lê Thị Đào Khoa Kĩ thuật Xét nghiệm Y học, Đại học Nguyễn Tất Thành ltdao@ntt.edu.vn Tóm tắt Bài báo trình bày trình xây dựng thẩm định phần quy trình phân tích irbesartan (IRB) hydroclorothiazid (HCTZ) huyết tương người kĩ thuật LC-MS/MS Phương pháp phân tích sử dụng telmisartan làm chuẩn nội để xác định irbesartan hydroclorothiazid Các chất phân tích chất chuẩn nội chiết kĩ thuật chiết lỏng- lỏng với tert-butyl methyl ether, cột Gemini C18 (150 mm x mm; µm), pha động methanol – dung dịch đệm amoniformat mM, pH = (80:20), tốc độ dịng 0,4 mL/min, thể tích tiêm mẫu µL Irbesartan, telmisartan phân tích chế độ ion hóa dương hydroclorothiazid chế độ ion hóa âm Theo hướng dẫn USFDA EMA thẩm định phương pháp phân tích thuốc dịch sinh học, kết thẩm định phần quy trình phân tích cho thấy quy trình đạt tính đặc hiệu, hiệu suất chiết 95 %, tính tuyến tính khoảng nồng độ dự định, đạt độ độ xác ngày ngày, giới hạn định lượng IRB HCTZ l 0,005 àg/mL v 0,901 ng/mL đ 2022 Journal of Science and Technology - NTTU Đặt vấn đề Tăng huyết áp vấn đề thường gặp cộng đồng, nguyên nhân gây tử vong hàng đầu dẫn đến chết hàng triệu người năm, đồng thời nguyên nhân gây suy tim đột quỵ não; nguyên nhân hàng thứ hai gây nhồi máu tim cấp Tỉ lệ người bị tăng huyết áp ngày tăng tuổi bị bệnh ngày trẻ Trong điều trị bệnh nhân tăng huyết áp, đơn trị kiểm soát huyết áp khơng q 60 % trường hợp Vì vậy, để đạt mục tiêu điều trị kiểm soát huyết áp trở số bình thường, nhà nghiên cứu thường phải phối hợp nhiều thuốc Theo Tạp chí Dược học châu Á năm 2014, có phác đồ phối hợp thuốc ức chế men chuyển/chẹn thụ thể angiotensin II lợi tiểu thiazid, ức chế men chuyển/chẹn thụ thể angiotensin II chẹn kênh canxi, ức chế men chuyển/chẹn thụ thể angiotensin II chẹn beta, chẹn beta chẹn kênh Đại học Nguyễn Tất Thành Nhận 13.11.2021 Được duyệt 20.12.2021 Cơng bố 06.04.2022 Từ khóa Chiết lỏng- lỏng, Huyết tương người, Hydroclorothiazid, Irbesartan, LC-MS/MS canxi [1] Trong phối hợp irbesartan hydroclorothiazid định điều trị phù nề tăng huyết áp Các nghiên cứu lâm sàng irbesartan hydroclorothiazid cho kết hợp có hiệu lâm sàng [2-5] Muốn kiểm sốt tốt huyết áp điều trị cần phải theo dõi nồng độ thuốc huyết tương có đạt u cầu điều trị hay khơng để điều chỉnh liều cho phù hợp Vì thế, phương pháp phân tích irbesartan hydroclorothiazid huyết tương người thực để góp phần vào việc xây dựng quy trình định lượng nồng độ chế phẩm chứa irbesartan hydroclorothiazid huyết tương người để phục vụ cho công tác điều trị bệnh Đối tượng phương pháp nghiên cứu 2.1 Đối tượng nghiên cứu 2.1.1 Dung mơi, hóa chất chất chuẩn Tạp chí Khoa học & Cơng nghệ Số 16 Dung mơi, hóa chất: acetonitril acid formic đạt tiêu chuẩn tinh khiết dùng cho LC/MS Các dung mơi, hóa chất khác đạt tiêu chuẩn phân tích Chất chuẩn: - Irbesartan - chuẩn Viện Kiểm nghiệm thuốc Thành phố Hồ Chí Minh (Tp HCM); số lô: QT201 050719; hàm lượng 99,40 % (nguyên trạng) - Hydroclorothiazid - chuẩn Viện Kiểm nghiệm thuốc Tp.HCM; số lô: QT300 030321; hàm lượng 99,60 % (nguyên trạng) - Telmisartan (IS) - chuẩn Viện Kiểm nghiệm thuốc Tp.HCM; số lô: QT217 040619; hàm lượng 99,70 % (nguyên trạng) Huyết tương trắng: Bệnh viện Truyền máu Huyết học Tp HCM cung cấp, bảo quản  -25 0C 2.1.2 Thiết bị dụng cụ phân tích - Các thiết bị phân tích hiệu chuẩn theo yêu cầu GLP ISO/IEC 17025, bao gồm: hệ thống máy LC-MS/MS 8040 (Shimadzu - Nhật Bản); cân phân tích (Mettler Toledo - Thuỵ Sĩ); máy đo pH (Mettler Toledo – Thụy Sĩ) - Máy siêu âm, máy lắc, tủ đông bảo quản, máy li tâm; dụng cụ thuỷ tinh, bình định mức, micropipet có độ xác phù hợp 2.2 Phương pháp nghiên cứu 2.2.1 Nội dung phương pháp nghiên cứu 31 - Khảo sát điều kiện sắc kí lỏng, điều kiện khối phổ phương pháp xử lí mẫu thích hợp để định lượng IRB HCTZ mẫu huyết tương - Tiến hành thẩm định theo hướng dẫn thẩm định phương pháp định lượng thuốc dịch sinh học US-FDA EMA [6,7] tiêu: tính đặc hiệu, giới hạn định lượng dưới, khoảng tuyến tính, độ đúng, độ xác, hiệu suất chiết, ảnh hưởng lượng mẫu tồn dư độ ổn định hoạt chất Sau tham khảo tài liệu kết hợp với thử nghiệm, lựa chọn điều kiện để phân tích IRB HCTZ mẫu huyết tương người hệ thống sắc kí lỏng hiệu cao với đầu dò khối phổ (LCMS/MS) sau: Nghiên cứu xây dựng phương pháp phân tích Điều kiện sắc kí - Pha động: methanol – dung dịch đệm amoniformat mM, pH = (80:20) - Cột sắc kí: gemini C18 (150 mm x mm; µm) - Nhiệt độ cột: 40 0C - Tốc độ dòng: 0,4 mL/min - Thể tích tiêm: µL - Nhiệt độ khay chứa mẫu: 10 0C Điều kiện khối phổ Đầu dò khối phổ ba lần tứ cực (LCMS 8040 Triple Quadrupole - Shimadzu, Nhật Bản), với nguồn ion hoá ESI Các thông số thiết bị khối phổ tối ưu để phát IRB, HCTZ IS tóm tắt Bảng Bảng Các thông số khối phổ tối ưu để phân tích IRB, HCTZ IS Hoạt chất Thơng số Điện ion hố (V) Nhiệt độ khí bay (0C) Tốc độ dịng khí phun (L/min) Tốc độ dịng khí bay (L/min) Nhiệt độ buồng ion hoá (0C) Thế Q1 (V) Năng lượng va chạm (V) Thế Q2 (V) MRM Mảnh ion mẹ Mảnh ion 2.2.2 Chuẩn bị dung dịch gốc chất phân tích nội chuẩn: pha dung dịch chuẩn gốc IRB, HCTZ IS nồng độ (0,5; 0,3 0,1) IRB HCTZ IS 000 250 000 250 000 250 15 15 15 400 -24 -26 -20 + 429,15 207,00 400 14 20 16 295,90 268,95 400 -24 -50 -26 + 515,00 276,10 mg/mL hòa tan methanol Pha dung dịch làm việc mức nồng độ khác từ dung dịch chuẩn gốc methanol Đại học Nguyễn Tất Thành Tạp chí Khoa học & Cơng nghệ Số 16 32 Chuẩn bị đường chuẩn mẫu kiểm chứng Lấy xác 50 µL hỗn hợp dung dịch làm việc gồm IRB, HCTZ cho vào 950 µL huyết tương trắng, lắc Pha dung dịch chuẩn nồng độ (5; 15; 300; 600; 500; 800; 000; 600; 800 000) ng/mL IRB (0,9; 3; 15; 30; 75; 90; 150; 180; 240 300) ng/mL HCTZ Mẫu kiểm chứng cho IRB HCTZ pha chế nồng độ cao (HQC) 800; 240, kiểm sốt chất lượng trung bình (MQC) 000; 150, kiểm soát chất lượng thấp (LQC) 15; kiểm soát chất lượng giới hạn thấp (LLOQ) 5; 0,9 ng/mL,tương ứng Điều kiện xử lí mẫu huyết tương Mẫu huyết tương xử lí phương pháp chiết lỏng - lỏng sau: lấy xác mL huyết tương có chứa chất phân tích cho vào ống nghiệm, thêm dung dịch chuẩn nội (irbesartan nồng độ 40 ng/mL), acid hóa 50 µL acid phosphoric 10 % Sau chiết với dung môi tert-butyl methyl ether, chiết lần lần mL Gộp dịch chiết bốc dung mơi tới cắn khí nitơ Hồ tan cắn 500 µL hỗn hợp pha động, lọc qua màng lọc millipore 0,22 µm, tiêm sắc kí 2.2.3 Phương pháp thẩm định Phương pháp thẩm định theo hướng dẫn US-FDA EMA Tính đặc hiệu Sáu mẫu huyết tương trắng riêng lẻ phân tích để khảo sát đỉnh nhiễu thời gian lưu chất phân tích Đáp ứng đỉnh gây nhiễu thời gian lưu IRB HCTZ coi chấp nhận chúng nhỏ 20 % đáp ứng LLOQ Các phản hồi đỉnh gây nhiễu thời gian lưu IS chấp nhận chúng nhỏ % IS Khoảng tuyến tính giới hạn định lượng Khoảng tuyến tính đánh giá cách sử dụng mười điểm đường chuẩn phân tích vào ngày riêng biệt Để xác nhận, đường cong xây dựng cách tính tốn tí lệ diện tích peak hợp chất với chất chuẩn nội vẽ biểu đồ dựa nồng độ thực mẫu Các đường chuẩn mơ tả phương trình tuyến tính: y = ax + b, y tỉ số peak chất phân tích peak IS tương ứng x nồng độ (µg/mL) Hệ số hồi quy, độ dốc hệ số chặn y đường chuẩn thu được xác định cách sử dụng hồi quy bình phương nhỏ với hệ số trọng số / x2 Đại học Nguyễn Tất Thành Nồng độ khơng xác định tính tốn từ phương trình đường chuẩn Giới hạn định lượng lượng tử (ULOQ) coi nồng độ chuẩn cao mà độ lệch chuẩn tương đối độ lệch phần trăm so với nồng độ danh nghĩa nhỏ 15 % LLOQ định nghĩa nồng độ thấp đo với hệ số biến thiên ngày (CV) khoảng ± 20 % Ảnh hưởng mẫu (matrix) Sáu lô huyết tương trắng người khác xử lí phân tích mẫu riêng biệt sáu lần lặp lại nồng độ QC cao thấp Hệ số chuẩn hóa IS xác định riêng biệt cho mẫu cách xác định diện tích peak huyết tương sau chiết xuất với diện tích peak methanol Độ độ xác Độ xác độ chụm phương pháp phân tích xác định cách phân tích mẫu nồng độ LLOQ, LQC, MQC HQC, chuẩn bị mô tả Sáu lần lặp lại cấp độ mẫu định lượng lần chạy để có độ xác độ xác ngày Sáu lần lặp lại cấp độ mẫu thử nghiệm vòng ba ngày khác (tổng cộng 18 lần lặp lại cho cấp độ nồng độ) Hiệu suất chiết Khả thu hồi (hiệu suất chiết) chất phân tích xác định cách phân tích mẫu QC tăng đột biến nồng độ cao, trung bình thấp Sáu lần lặp lại mẫu QC chuẩn bị tiêm vào hệ thống LC-MS/MS Hiệu suất thu hồi xác định cách so sánh diện tích peak thu từ mẫu huyết tương chiết xuất với diện tích peak thu từ mẫu methanol mức nồng độ Ảnh hưởng lượng mẫu tồn dư Sự nhiễm chéo đánh giá cách tiêm huyết tương trắng sau tiêm giới hạn định lượng (ULOQ) Độ nhiễm chéo chấp nhận thấp 20 % LLOQ chất phân tích % diện tích IS Độ ổn định Độ ổn định ngắn hạn sau điều chế, độ ổn định sau ba chu kì đông lạnh - rã đông, xác định cho tất chất phân tích huyết tương cách sử dụng mẫu QC thấp cao cách tính Tạp chí Khoa học & Cơng nghệ Số 16 33 toán độ chệch nồng độ quan sát nồng độ lí thuyết Tính ổn định ngắn hạn khảo sát cách phân tích sáu lần lặp lại mẫu nồng độ (-70 0C) giữ nhiệt độ phòng trước chuẩn bị mẫu Độ ổn định đông lạnh xác định ba chu kì Trong chu kì, mẫu huyết tương tăng đột biến đông lạnh -70 0C 24 rã đông nhiệt độ phòng Độ ổn định sau điều chế kiểm tra cách giữ sáu lần lặp lại nồng độ thấp cao lấy mẫu tự động trì 10 0C 48 Các mẫu phân tích, kết so sánh với kết đạt từ mẫu tươi Độ ổn định chấp nhận độ lệch (%) nằm khoảng ± 15 Kết thảo luận Kết thẩm định quy trình phân tích 3.1 Độ đặc hiệu phương pháp Tiến hành phân tích mẫu huyết tương trắng, mẫu huyết tương tự tạo chứa hoạt chất nồng độ LLOQ xử lí Kết cho thấy sắc kí đồ mẫu huyết tương trắng, thời điểm 3,704 phút; 1,612 phút 4,287 phút (tương ứng với thời gian lưu IRB, HCTZ IS) xuất nhiễu Như phương pháp đặc hiệu chọn lọc IRB HCTZ Hình Hình minh họa sắc kí đồ mẫu trắng mẫu huyết tương tự tạo nồng độ LLOQ Hình Sắc kí đồ mẫu huyết tương trắng Hình Sắc kí đồ tự tạo chứa chất phân tích nồng độ LLOQ 3.2 Đường chuẩn khoảng tuyến tính Pha mẫu huyết tương có chứa chuẩn IRB có nồng độ (5-6 006) ng/mL, HCTZ có nồng độ khoảng từ (0,9-300) ng/mL Xử lí mẫu phân tích theo quy trình xây dựng Đánh giá tương quan nồng độ chất phân tích (x) huyết tương với tỉ số diện tích đỉnh đo (y) khoảng nồng độ khảo sát phương pháp hồi quy tuyến tính với trọng số 1/X2 Kết xác định mối tương quan tuyến tính trình bày Bảng Bảng Tương quan nồng độ tỉ số diện tích đỉnh Mẫu C-1 C-2 (LLOQ) (LQC) Nồng độ thực (µg/mL) Độ (%) IRB Phương trình hồi quy theo trọng số (1/X2) Nồng độ thực (ng/mL) HCTZ Độ (%) Phương trình 0,005 C-3 C-4 C-5 C-6 0,015 0,300 0,601 1,501 1,802 C-7 (MQC) C-8 3,003 3,603 C-9 C-10 (HQC) (ULOQ) 4,805 6,006 100,41 98,66 96,57 104,39 101,84 100,56 103,72 102,48 98,38 ŷ = 1,3453x + 0,0005 92,99 R2 = 0,9987 0,900 3,001 15,007 30,014 75,035 90,043 150,071 180,085 240,113 300,142 101,15 95,99 102,91 102,39 95,01 103,32 97,43 106,36 99,98 ŷ = 0,0001x 98,37 Đại học Nguyễn Tất Thành Tạp chí Khoa học & Cơng nghệ Số 16 34 hồi quy theo trọng số (1/X2) 3.3 Giới hạn định lượng phương pháp Tiến hành xử lí mẫu huyết tương chứa IRB IS nồng độ khoảng ng/mL 0,9 ng/mL (mẫu LLOQ), tiến hành sắc kí xác định diện tích đỉnh IRB, HCTZ IS, tính nồng độ IRB HCTZ dựa vào đường chuẩn tiến hành song song điều kiện có S/N lớn Bảng Kết xác định giới hạn định lượng Lô huyết tương S/N IRB 19,170 14,690 19,380 HCTZ 22,580 34,300 21,810 R2 = 0,9985 24,860 17,750 15,150 14,230 8,740 16,680 16,998 21,225 Trung bình 3.4 Độ đúng, độ xác phương pháp Tiến hành sắc kí mẫu huyết tương chứa chất phân tích mức nồng độ LLOQ, LQC, MQC HQC, nồng độ mẫu Kết thẩm định cho thấy phương pháp đạt độ ngày (n = 6) khác ngày (n = 18) với tỉ lệ thu hồi nằm khoảng 85 % - 115 % (trừ LLOQ có độ từ 80 % đến 120 %) đạt độ xác với giá trị CV < 15 % Kết tóm tắt Bảng Bảng Kết xác định độ đúng, độ xác ngày khác ngày Mẫu LLOQ Ngày (n = 6) LQC MQC HQC LLOQ Ngày (n = 6) LQC MQC HQC LLOQ Ngày (n = 6) LQC MQC HQC Giữa ngày LLOQ TB CV (%) TB CV (%) TB CV (%) TB CV (%) TB CV (%) TB CV (%) TB CV (%) TB CV (%) TB CV (%) TB CV (%) TB CV (%) TB CV (%) TB Gộp CV Gộp (%) Đại học Nguyễn Tất Thành Nồng độ thực tế IRB HCTZ (µg/mL) (ng/mL) 0,005 0,910 Nồng độ lí thuyết IRB HCTZ (µg/mL) (ng/mL) 0,005 0,901 0,016 2,936 0,015 3,003 2,962 167,939 3,003 150,146 4,440 267,367 4,805 240,233 0,004 0,925 0,005 0,901 0,015 2,957 0,015 3,003 2,619 160,191 3,003 150,146 4,326 229,037 4,805 240,233 0,004 0,964 0,005 0,901 0,014 2,959 0,015 3,003 3,011 161,052 3,003 150,146 4,270 257,690 4,805 240,233 Độ (%) IRB HCTZ 104,71 3,06 103,89 2,68 98,63 0,79 92,41 4,54 95,423 4,350 101,13 2,80 87,23 2,46 90,03 3,14 93,553 7,189 94,71 5,72 100,26 3,02 88,87 4,30 97,90 6,97 101,03 16,78 97,78 6,92 111,85 2,64 111,30 3,25 102,78 7,52 96,01 8,85 106,69 3,15 95,34 10,19 107,07 7,87 103,51 3,68 107,27 2,41 107,27 5,97 103,62 11,00 Tạp chí Khoa học & Cơng nghệ Số 16 (n=18) LQC MQC HQC 35 TB Gộp CV Gộp (%) TB Gộp CV Gộp (%) TB Gộp CV Gộp (%) 99,91 5,38 95,37 6,62 90,44 4,15 3.5 Hiệu suất chiết Xác định hiệu suất chiết IRB, HCTZ IS cách so sánh diện tích peak IRB, HCTZ IS mẫu có qua chiết tách khơng qua chiết tách (mẫu 99,10 7,12 108,60 3,38 104,63 9,15 pha pha động) Kết xác định hiệu suất chiết IRB, HCTZ IS mức nồng độ LQC, MQC, HQC trình bày Bảng Bảng Hiệu suất chiết IRB, HCTZ IS (n = 6) IRB HCTZ Telmisartan (IS) LQC MQC HQC LQC MQC HQC LQC MQC HQC Hiệu suất chiết (%) 90,80 98,20 103,53 93,51 94,89 100,60 97,76 88,49 103,12 CV (%) Hiệu suất chiết TB mức nồng độ (%) CV (%) 5,46 2,05 2,09 8,46 5,49 2,41 3,60 1,49 3,11 97,51 96,33 96,45 6,56 3,90 7,67 3.6 Ảnh hưởng mẫu (Matrix effect) Tiến hành phân tích lơ huyết tương trắng xử lí thêm chất phân tích nồng độ LQC HQC với chuẩn nội Song song tiến hành phân tích mẫu LQC HQC có chuẩn nội pha động Ảnh hưởng mẫu chất phân tích trình bày Bảng Tỉ số MFIRB/IS tỉ số MFHCTZ/IS mức nồng độ LQC HQC có giá trị CV (2,615,38) % (1,74-6,22) % Phương pháp phân tích có bị ảnh hưởng mẫu nằm mức cho phép đáp ứng yêu cầu phương pháp phân tích thuốc dịch sinh học Bảng Kết đánh giá ảnh hưởng mẫu phân tích IRB HCTZ Mẫu LQC TB CV (%) HQC TB CV (%) MF IRB 89,52 116,11 106,15 108,23 109,17 117,48 107,78 MF HCTZ 99,82 109,16 103,72 115,89 112,11 117,54 109,71 MF IS 106,22 114,90 115,15 118,61 118,24 124,69 116,30 108,34 105,36 106,78 101,74 98,40 98,56 103,20 109,34 110,54 107,41 107,56 92,60 108,59 106,01 122,20 119,25 122,22 119,48 114,22 110,76 118,02 MF IRB/MF IS 0,84 1,01 0,92 0,91 0,92 0,94 0,93 5,83 0,89 0,88 0,87 0,85 0,86 0,89 0,87 1,74 MF HCTZ/MF IS 0,94 0,95 0,90 0,98 0,95 0,94 0,94 2,61 0,89 0,93 0,88 0,90 0,81 0,98 0,90 6,22 Đại học Nguyễn Tất Thành Tạp chí Khoa học & Cơng nghệ Số 16 36 3.7 Ảnh hưởng lượng mẫu tồn dư (carryover) Tiến hành thử nghiệm lượng mẫu tồn dư để kiểm tra có mặt chất phân tích từ lần tiêm trước Các mẫu tiêm theo thứ tự sau: mẫu có nồng độ cao (ULOQ) mẫu trắng, tiêm lặp lại lần, tiêm lần mẫu có nồng độ LLOQ để đánh giá Kết trình bày Bảng 7, cho thấy khơng có ảnh hưởng lượng mẫu tồn dư IRB, HCTZ IS Bảng Ảnh hưởng lượng mẫu tồn dư (carryover) Chất phân tích IRB HCTZ IS Mức nồng độ Diện tích peak trung bình 11 919 16 498 344 525 165 318 869 508 994 923 LLOQ ULOQ Mẫu trắng LLOQ ULOQ Mẫu trắng LLOQ ULOQ Mẫu trắng 3.8 Độ ổn định hoạt chất huyết tương Tiến hành xử lí mẫu huyết tương chứa chất phân tích mức nồng độ LQC HQC điều kiện bảo quản sau: sau nhiệt độ phịng; sau xử lí dung dịch mẫu 24 (2-8) 0C; sau chu kì đơng - rã đơng -70 0C sau xử lí đặt 48 Lượng mẫu tồn dư (%) 0,00 0,00 0,00 buồng tiêm mẫu Kết tóm tắt Bảng 8, cho thấy hàm lượng IRB, HCTZ IS nằm khoảng (85-115) % so với nồng độ ban đầu với giá trị CV < 15 % Như vậy, hoạt chất huyết tương ổn định điều kiện khảo sát Bảng Độ ổn định IRB, HCTZ IS Điều kiện bảo quản IRB HCTZ Độ phục hồi TB CV (%) Độ phục hồi TB CV (%) Nhiệt độ phòng (25 0C) - LQC 98,32 4,67 99,59 7,38 HQC 87,32 1,45 109,10 1,78 Kết luận đề xuất Ưu điểm phương pháp sử dụng định tính định lượng chất LC-MS/MS thông qua ion xác đặc hiệu Nghiên cứu xây dựng quy trình xử lí mẫu thích hợp nên có hiệu suất chiết trung bình IRB, HCTZ chuẩn nội telmisartan mức nồng độ khoảng (96,33-97,51) % với giá trị CV không % So sánh với số cơng trình cơng bố trước [3,4] quy trình xử lí mẫu có hiệu suất chiết cao ổn định Trong nghiên cứu này, LLOQ IRB HCTZ (5 0,901) ng/mL Ở mức nồng độ này, kết độ độ xác (104,71 Đại học Nguyễn Tất Thành Trong buồng tiêm mẫu (10 0C) - 48 LQC 97,28 5,14 99,45 7,71 HQC 90,18 5,24 100,41 3,79 Sau chu kì đơng - rã đông LQC 110,37 2,63 104,27 8,35 HQC 97,93 1,22 109,53 3,05 3,06) % IRB, (101,03 16,780) % HCTZ Tỉ lệ S/N mức LLOQ 16,998 21,225 IRB HCTZ LLOQ IRB HCTZ nghiên cứu thấp so với quy trình sử dụng kĩ thuật phân tích LC-MS/MS cơng bố trước Nghiên cứu Tutunji cộng năm 2010 có LLOQ IRB HCTZ 60 ng/mL ng/mL [3] Như vậy, độ nhạy phương pháp với kĩ thuật xử lí mẫu phương pháp chiết lỏng - lỏng cho phép xác lập giá trị LLOQ mức thấp với mức công bố trước Đây ưu điểm phương pháp phân tích Phương pháp phân tích IRB HCTZ huyết tương người kĩ thuật LC-MS/MS xây Tạp chí Khoa học & Công nghệ Số 16 dựng thẩm định đáp ứng yêu cầu theo hướng dẫn US-FDA EMA thẩm định phương pháp phân tích thuốc dịch sinh học Áp dụng phương pháp phân tích việc xác định nồng độ irbesartan hydroclorothiazid dịch sinh học để theo dõi hiệu điều trị bệnh nhân 37 Kiến nghị thực thêm độ ổn định dài hạn chất huyết tương để đánh giá sinh khả dụng thuốc chứa hoạt chất dịch sinh học Lời cảm ơn Nghiên cứu tài trợ Quỹ Phát triển Khoa học Công nghệ - Đại học Nguyễn Tất Thành, mã đề tài 2021.01.82/HĐ-KHCN Tài liệu tham khảo Wan X., Ma P Zhang X (2014) A promising choice in hypertension treatment: Fixed-dose combinations Asian Journal of Pharmaceutical Sciences, 9(1), 1–7 Bộ Y tế (2015), Dược thư Quốc gia Việt Nam Nhà xuất Y học, Hà Nội, tr 777-779, 835-837 Tutunji L.F., Tutunji M.F., Alzoubi M.I cộng (2010) Simultaneous determination of irbesartan and hydrochlorothiazide in human plasma using HPLC coupled with tandem mass spectrometry: Application to bioequivalence studies Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 51(4), 985–990 Qi-Fang Huang, Chang-Sheng Sheng, Yan Li cộng (2013) Efficacy and Safety of a Fixed Combination of Irbesartan/Hydrochlorothiazide in Chinese Patients with Moderate to Severe Hypertension Drugs in R&D, 13(2), 109–117 Qiu X., Wang Z., Wang B cộng (2014) Simultaneous determination of irbesartan and hydrochlorothiazide in human plasma by ultra high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry and its application to a bioequivalence study Journal of Chromatography B, 957, 110-115 FDA (2018), Guidance for Industry - Bioanalytical Method Validation, Rockville, MD, USA, pp 1-44 EMA (2015), Guideline on bioanalytical method validation, pp 1-23 Development of an analytical method for Irbesartan and Hydrochlorothiazide in human plasma Le Thi Dao Faculty of Medical Laboratory Technology, Nguyen Tat Thanh University ltdao@ntt.edu.vn Abstract This paper presents the process of developing and partially validating the analytical procedure for irbesartan (IRB) and hydrochlorothiazide (HCTZ) in human plasma via the LC-MS/MS technique The analytical method used telmisartan as an internal standard for the determination of irbesartan and hydrochlorothiazide The analytes and internal standards were extracted using liquid-liquid extraction technique with tert-butyl methyl ether, Gemini C18 column (150 mm ì mm; àm), Methanol mobile phase ammoniumformat buffer at mM, pH = (80:20), flow rate 0.4 mL/min, and sample injection volume µL Irbesartan and telmisartan were analyzed in the positive ionization mode and hydrochlorothiazide in the negative ionization mode According to the US-FDA and EMA guidelines for the validation of drug analytical methods in biological fluids, the results of partial validation of the analytical procedure showed that the procedure achieved specificity, extraction efficiency of more than 95 %, and linearity over the intended concentration ranges, and achieving intraday and intraday accuracy and precision, with the lower limits of quantification for IRB and HCTZ being 0.005 µg/mL and 0.901 ng/mL, respectively Keywords Liquid-liquid extraction, Human plasma, Hydrochlorothiazide, Irbesartan, LC-MS/MS Đại học Nguyễn Tất Thành ... với mức công bố trước Đây ưu điểm phương pháp phân tích Phương pháp phân tích IRB HCTZ huyết tương người kĩ thuật LC-MS/MS xây Tạp chí Khoa học & Công nghệ Số 16 dựng thẩm định đáp ứng yêu cầu theo... quy trình phân tích 3.1 Độ đặc hiệu phương pháp Tiến hành phân tích mẫu huyết tương trắng, mẫu huyết tương tự tạo chứa hoạt chất nồng độ LLOQ xử lí Kết cho thấy sắc kí đồ mẫu huyết tương trắng,... (0,9-300) ng/mL Xử lí mẫu phân tích theo quy trình xây dựng Đánh giá tương quan nồng độ chất phân tích (x) huyết tương với tỉ số diện tích đỉnh đo (y) khoảng nồng độ khảo sát phương pháp hồi quy tuyến