1 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP & PTNT VIỆN KHOA HỌC NN VIỆT NAM NGUYỄN NAM DƯƠNG NGHIÊN CỨU BỆNH DO NẤM PHYTOPHTHORA SPP GÂY HẠI TRÊN CÂY CÓ MÚI VÀ BIỆN PHÁP PHÒNG CHỐNG THEO HƯỚNG SINH HỌC T[.]
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP & PTNT VIỆN KHOA HỌC NN VIỆT NAM NGUYỄN NAM DƯƠNG NGHIÊN CỨU BỆNH DO NẤM PHYTOPHTHORA SPP GÂY HẠI TRÊN CÂY CĨ MÚI VÀ BIỆN PHÁP PHỊNG CHỐNG THEO HƯỚNG SINH HỌC TẠI CAO BẰNG Chuyên ngành: Mã số: Bảo vệ thực vật 9.62.01.12 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ NƠNG NGHIỆP HÀ NỘI - 2021 Cơng trình hồn thành tại: Viện Khoa học Nơng nghiệp Việt Nam Người hướng dẫn khoa học: TS Hà Minh Thanh TS Đặng Vũ Thị Thanh Phản biện 1: Phản Biện 2: Phản biện 3: Luận án tiến sĩ bảo vệ trước Hội đồng chấm Luận án cấp Viện họp Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam Vào hồi….giờ… phút ngày … tháng … năm 20… Có thể tìm hiều luận án thư viện: Thư viện Quốc gia Việt Nam Thư viện Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam Thư viện Viện Bảo vệ thực vật DANH MỤC CÁC CƠNG TRÌNH ĐÃ CƠNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN Nguyễn Thị Bích Ngọc, Nguyễn Nam Dương, Phạm Thị Dung, Lê Mai Nhất, Đỗ Duy Hưng, Ngô Thị Thanh Hường (2016), “Quản lý bệnh thối gốc, thối rễ quýt Trà Lĩnh Cao Bằng”, Tạp chí bảo vệ thực vật, số (264), ISSN 2354 – 0710, tr 39 - 45 Nguyễn Nam Dương, Ngô Thị Thanh Hường, Vũ Duy Minh, Hà Minh Thanh, Hà Viết Cường (2021), “Kết nghiên cứu vi sinh vật đối kháng nấm Phytophthora spp gây bệnh ăn có múi Cao Bằng”, Tạp chí bảo vệ thực vật, số (297), ISSN 2354 – 0710, tr - Nguyễn Nam Dương, Hà Minh Thanh, Nguyễn Thị Bích Ngọc, Ngơ Thị Thanh Hường, Vũ Duy Minh, Hà Viết Cường, Phạm Bích Hiên (2021), “Xác định nấm Phytopthora spp gây bệnh thối rễ, chảy gơm ăn có múi Cao Bằng”, Tạp chí Khoa học Cơng nghệ Nơng nghiệp Việt Nam, số 11 (132), ISSN 1859 – 1558, tr 82 – 92 Nguyễn Nam Dương, Hà Minh Thanh, Nguyễn Thị Bích Ngọc, Ngơ Thị Thanh Hường, Vũ Duy Minh, Hà Viết Cường, Phạm Bích Hiên (2021), “Khả sử dụng tổ hợp vi sinh vật đối kháng CB-1 phịng trừ bệnh thối rễ chảy gơm nấm Phytopthora ăn có múi Cao Bằng”, Tạp chí Khoa học Cơng nghệ Nơng nghiệp Việt Nam, số 11 (132), ISSN 1859 – 1558, tr 92 – 99 MỞ ĐẦU Tính cấp thiết đề tài Cao Bằng tỉnh miền núi phía Bắc, có điều kiện đất đai, khí hậu thích hợp cho ăn có múi phát triển Tại Cao Bằng giống quýt Trà Lĩnh, cam Trưng Vương với chất lượng cao có hương vị đặc biệt mang lại nguồn thu nhập đáng kể cho người nông dân Với định hướng phát triển số trồng địa thay số trồng hiệu quả, cam quýt lựa chọn cấu trồng nhiều địa phương Cao Bằng Tuy nhiên năm gần diện tích, sản lượng chất lượng cam quýt Cao Bằng bị suy giảm mạnh, nhiều vườn bị thối hóa nặng nề Việc mở rộng diện tích, đẩy mạnh thâm canh tăng suất điều kiện thích hợp cho nhiều lồi sâu bệnh phát sinh gây hại có múi Bên cạnh bệnh vàng greening, bệnh thối rễ, chảy gôm, thối gây phát hầu hết vùng trồng cam quýt Cao Bằng Khi bị bệnh có múi trở nên cịi cọc, tán biến vàng, thân cành đặc biệt phần gốc có xuất vết chảy gôm, gỗ bị biến màu nâu đen, rễ bị thối đen dễ tuột vỏ, hoa ít, bị bệnh nặng khơng cho bị chết Các vườn có múi bị bệnh nơng dân Cao Bằng gọi vườn "cam buồn" Bệnh gây hại nhiều vườn cam quýt vùng Hòa An, Trà Lĩnh, tỉnh Cao Bằng Bệnh thối rễ, chảy gôm cam quýt Cao Bằng sơ xác định nấm Phytophthora spp gây ra, chưa có nghiên cứu chun sâu, tồn diện bệnh Do việc thực đề tài Nghiên cứu bệnh nấm Phytophthora spp gây hại có múi biện pháp phịng chống theo hướng sinh học Cao Bằng điều cần thiết nhằm xác định nguyên nhân, đặc điểm, quy luật phát sinh gây hại bệnh, để từ đưa biện pháp quản lý bệnh an toàn hiệu quả, đảm bảo sản xuất ăn có múi Cao Bằng bền vững Mục tiêu, yêu cầu đề tài 2.1 Mục tiêu đề tài Xác định loài Phytophthora tác nhân gây bệnh ăn có múi Cao Bằng đặc điểm sinh học loài nấm yếu tố ảnh hưởng đến phát sinh gây hại bệnh thối rễ, chảy gơm ăn có múi biện pháp phòng trừ bệnh hiệu Cao Bằng 2.2 Yêu cầu đề tài Đánh giá thực trạng bệnh thối rễ, chảy gơm ăn có múi, xác định loài Phytophthora tác nhân gây bệnh đặc điểm phát sinh gây hại nấm gây cho ăn có múi Cao Bằng đại diện cho tỉnh miền núi Đông Bắc Phân lập, tuyển chọn chủng vi sinh vật đối kháng nấm Phytophthora có hoạt tính cao Thử nghiệm khả sử dụng vi sinh vật đối kháng để phòng trừ nấm Phytophthora gây bệnh ăn có múi Đề xuất biện pháp phòng chống hiệu bệnh nấm Phytophthora spp gây hại ăn có múi Cao Bằng Ý nghĩa khoa học thực tiễn đề tài Ý nghĩa khoa học Cung cấp bổ sung dẫn liệu khoa học bệnh loài nấm Phytophthora gây bệnh hại có múi Cao Bằng, yếu tố ảnh hưởng giải pháp phòng chống bệnh Tuyển chọn bổ sung số loài vi sinh vật đối kháng (tại Cao Bằng) có khả sử dụng phịng chống bệnh nấm Phytophthora gây Ý nghĩa thực tiễn Các kết đề tài tiền đề cho nghiên cứu xây dựng phát triển quy trình quản lý tổng hợp bệnh thối rễ, chảy gơm nhằm phát triển bền vững ăn có múi Cao Bằng địa phương có điều kiện tương tự, đồng thời nguồn tài liệu tham khảo có giá trị sử dụng nghiên cứu khoa học đào tạo chuyên ngành bảo vệ thực vật Đối tượng phạm vi nghiên cứu Một số loài nấm Phytophthora spp gây bệnh có múi Cao Bằng Một số vi sinh vật đối kháng với nấm Phytophthora spp Các giống ăn có múi Cao Bằng (Cam Trưng Vương, Quýt Hà Trì, Quýt Trà Lĩnh bưởi Phục Hịa) Tính đóng góp đề tài Đã xác định loài nấm Phytophthora palmivora, P nicotianae P citrophthora tác nhân gây bệnh thối rễ, chảy gôm ăn có múi Cao Bằng bổ sung thêm nấm Phytophthora palmivora vào danh sách loài nấm hại ăn có múi tỉnh miền núi phía Bắc Đã phân lập, tuyển chọn ba loài vi sinh vật Bacillus amyloliquefaciens, B methylotrophicus Streptomyces misionensis đối kháng nấm Phytophthora có hiệu lực ức chế đạt 82,2-85,7% môi trường nuôi cấy Chế phẩm CB-1 (hỗn hợp Bacillus amyloliquefaciens, B methylotrophicus Streptomyces misionensis) đạt hiệu lực phòng trừ nấm Phytophthora từ 75,85 - 83,18% nhà lưới 73,1% đồng ruộng Đề xuất qui trình sử dụng chế phẩm CB-1 phịng chống bệnh thối rễ, chảy gôm ăn có múi Cao Bằng CHƯƠNG I TỔNG QUAN VỀ VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1.1 Cơ sở khoa học đề tài Các loài nấm thuộc chi Phytophthora tác nhân gây bệnh thối rễ, chảy gôm loại dịch hại kinh tế cho vùng trồng ăn có múi giới Trong chi nấm xác định 10 loài gây bệnh cho ăn có múi, lồi P palmivora, P nicotianae P citrophthora loài gây hại phổ biến quan trọng Quy luật phát sinh gây bệnh, biện pháp quản lý bệnh nấm Phytophthora nghiên cứu toàn diện hệ thống vùng trồng ăn có múi giới Tại Việt Nam loài nấm Phytophthora phát gây hại trồng nông nghiệp Các loài P palmivora, P nicotiane, P cinamomi, P capsisi P infestans loài gây hại quan trọng trồng có giá trị kinh tế cao sầu riêng, dứa, hồ tiêu, cao su thực phẩm họ Solanaceae (Đặng Vũ Thị Thanh, Ngô Vĩnh Viễn, Drenth,2004) Các nghiên cứu quy luật phát sinh gây hại biện pháp quản lý bệnh Phytophthora sầu riêng, hồ tiêu, dứa thực phẩm nghiên cứu cách hệ thống nhiều tác giả Việt Nam (Mai Văn Tri cs (2001), Nguyễn Vĩnh Trường (2008), Phạm Ngọc Dung cs (2007) Nấm P citrophthora phát hại lần cam Việt Nam vào năm 50 kỷ 20, sau nấm P.nicotianae tiếp tục phát khắp vùng trồng ăn có múi Việt Nam (Đặng Vũ Thị Thanh, Ngô Vĩnh Viễn, Drenth, 2004) Tuy nhiên nghiên cứu bệnh Phytophthora có múi Việt Nam cịn rời rạc khơng liên tục thường hạn chế mức điều tra tỷ lệ bệnh Chưa có nghiên cứu phát triển chiến lược quản lý bệnh, quản lý vườn ươm, tạo giống kháng bệnh Đặc biệt Cao Bằng chưa có nghiên cứu nguyên nhân gây bệnh biên pháp quản lý bệnh thối rễ, chảy gôm cam quýt đặc sản Nghiên cứu nấm Phytopthora hại ăn có múi sử dụng chế phẩm sinh học quản lý bệnh Cao Bằng điều cần thiết để đáp ứng nhu cầu phát triển vùng ăn có múi đặc sản tỉnh Cao Bằng vùng trồng ăn có múi Việt Nam 1.2 Tổng quan ăn có múi Hiện nay, có múi quan trọng giới Sản lượng có múi giới ước tính khoảng 124,246,000 (Citrus Fruit – Fresh and Processed Statistical Bulletin 2016, FAO) Cây có múi có khả sinh trưởng vùng có vĩ độ 400 N tới 400 S Tuy nhiên, vùng trồng có múi thương mại chủ yếu phân bố hạn chế hai vành đai vùng cận nhiệt đới, khoảng 20 đến 400N S đường xích đạo (Castle, 1987) Tại Việt Nam, theo số liệu thống kê Cục trồng trọt (Bộ Nông nghiệp Phát triển Nông thôn, 2020), tổng diện tích có múi nước 235.216 Trong đó, diện tích trồng có múi tỉnh phía bắc 106.125 ha, tỉnh Bắc Trung Bộ 29.630 ha, tỉnh duyên hải Nam Trung Bộ Tây Nguyên 7.761 tỉnh phía nam 91.702 Cam loại có múi trồng phổ biến với diện tích 130.000 ha, sau bưởi với diện tích 85.500 1.3 Những nghiên cứu nấm Phytophthora hại trồng 1.3.1 Thông tin chung nấm Phytophthora Nấm Phyophthora mô tả lần Heinrich Anton de Bay năm 1875 Ngày có 170 lồi phát Có 60 lồi Phytophthora mơ tả lồi gây bệnh cho trồng Mỗi lồi gây bệnh cho từ vài 1000 loài trồng khác (David and André Drenth, 2004) Các loài nấm Phtophthora gây hại cho trồng cách phá hủy tế bào, gây hoại tử cho lá, thân rễ Nấm làm cháy (blight), nấm làm nứt vỏ thân cành gây chảy gôm, loét (canker), điểm xung quang thân, cành Cành nhánh bị chết khơ (dieback) Nấm Phytophthora thâm nhập vào mạch dẫn xylem, làm cho phần toàn tán thiếu nước, bị héo (wilt) Rất nhiều loài Phytophthora xâm nhiễm rễ gây thối rễ (root rot), số trường hợp hại toàn rễ tơ, số trường hợp gây hoại tử dẫn đến tượng thối chóp rễ (crown rot) Rễ tơ bị hoại tử dẫn đến cây, bị thiếu nước, thời gian dài bị héo tàn lụi (decline) Rễ bị thối dẫn đến rễ thân bị tàn lụi bị chết nhanh (sudden death) Vết bệnh từ rễ lan gây hại phần thân sát mặt gây thối thân (foot rot) hay thối cổ rễ (collar rot), nấm gây thối nâu (brown rot) 1.3.2 Nghiên cứu nấm Phytophthora hại ăn có múi 1.3.2.1 Những nghiên cứu nấm Phytophthora giới Nấm Phytophthora tồn đất nước, gây bệnh cho có múi (Graham and Menge 2000) Nấm phân bố khắp giới gây tổn thất sản lượng đáng kể cho có múi vùng cận nhiệt đới có nhiều mưa (Graham Feichtenberger, 2015) Trong 10 lồi Phytophthora báo cáo gây hại có múi tồn giới, có loại gây hại nghiêm trọng gây bệnh chảy gôm, thối rễ thối Phytophthora citrophthora, P nicotianae P palmivora (Erwin and Ribeiro, 1996; Graham and Menge, 2000) Nấm P citrophthora P parasitica (P nicotianae) xác định nguyên nhân gây bệnh chảy gơm bệnh thối rễ ăn có múi tồn giới (Martin et al., 2001; Siviero et al., 2002; Timmer et al., 2003) Nấm P nicotianae gây bệnh thối cổ rễ thối rễ gây hại phần xa mặt đất Nấm P palmivora gây bệnh thối nâu, nấm P citrophthora gây bệnh thối rễ xì mủ phần thân cành to Nấm Phytophthora tồn đất độ ẩm nhiệt độ cao, rễ bị nhiễm nấm sản sinh bọc bào tử giải phóng du động bào tử Du động bào tử bơi nước khoảng cách ngắn di chuyển mưa nước tưới Khi tiếp xúc với rễ, du động bào tử tạo nang, nảy mầm sau xâm nhiễm vùng đầu rễ (Duniway, 1983) Sử dụng phương pháp bẫy để phân lập nấm Phytophthora spp Nấm P parasitica, P citrophthora P palmivora, nuôi cấy mà phân lập nhiều loại môi trường đặc hiệu khác Xác định loài Phytophthora dựa vào đặc điểm hình thái: Phương pháp dựa vào đặc điểm bọc bào tử, cấu trúc sinh sản hữu tính bao đực (antheridium), bao trứng (oogonium), bào tử trứng (oospore), hình thức sinh sản hữu tính (đồng tản- homothallic hay dị tản-heterothallic), có hay khơng có bào tử hậu (chlamydospores) để xác định loài nấm Xác định loài Phytophthora phương pháp sinh học phân tử: Hiện nay, trình tự nucleotide ITS thường áp dụng để xác định đánh giá mối quan hệ loài Phytophthora (Blair cs., 2008) Appiah cs (2004) sử dụng trình tự ITS để đánh giá 88 mẫu phân lập P palmivora thu thập từ ca cao từ khu vực khác giới Cacciola cs báo cáo việc sử dụng trình tự ITS để xác định lồi P palmivora gây hại cọ rẻ quạt (Trachycarpus fortunei) Quản lý bệnh Phytophthora Có yếu tố bản, liên quan chặt chẽ để quản lý bệnh là: (1) kỹ thuật canh tác, (2) tạo giống kháng, (3) phịng trừ sinh học, (4) phịng trừ hóa học (David and André Drenth, 2004) Kỹ thuật canh tác: Áp dụng tổng hơp biện pháp canh tác giúp giảm đáng kể nguồn nấm Phytophthora đất Phòng trừ thuốc hóa học: Việc sử dụng thuốc hóa học để phịng trừ bệnh Phytophthora sử dụng rộng rãi từ thuốc trừ nấm lưu dẫn có hiệu lực cao sản xuất metalaxyl Al ethyl-phosphyte (hay fosetyl-Al) (Davis, 2004; Timmer & Broadben, 2003) Phòng trừ biện pháp sinh học: Trên giới nhiều vi sinh vật đối kháng tuyển chọn, sử dụng cho sản xuất chế phẩm sinh học kiểm soát nấm Phytophthora, tiêu biểu số loài Streptomyces, Bacillus, Trichoderma, … 1.3.2.2 Tình hình nghiên cứu nấm Phytophthora ăn có múi Việt Nam Nấm Phytophthora citrophthora phát cam vùng đồng sông Mekong vào năm 1950 (Roger, 1951) Năm 1970 nấm phát gây hại cam miền Bắc miền Trung Từ bệnh nhanh chóng lan rộng tất vùng trồng ăn có múi Kết điều tra sâu bệnh hại có múi Viện Bảo vệ thực vât năm 2006-2010 phát nấm Phytophthora gây hại có múi vùng Hà Giang, Tun Quang, Phú Thọ, Hịa Bình, Nghệ An, Hà Tĩnh thuộc loài P citrophthora P nicotiana Cả loài nấm phát cam, bưởi phát P citrophthora, quýt chanh phát P nicotiana (Đặng Vũ Thị Thanh & nnk, 2010) Bệnh chảy gơm có múi sử dụng thuốc Ridomil MZ 72WP Aliette 80WP quét vào gốc, thân cành tưới vòng quanh tán cho hiệu cao (Nguyễn Thị Kim Sơn, 2003) Phun bổ sung phân bón qua kết hợp với thuốc Kasuran 47WP 0,2%, Kocide 51,8DF 0,2% dầu Caltex DC Tron Plus 0,5% có hiệu hạn chế bệnh đốm dầu có múi (Nguyễn Thị Bích Ngọc, 2009) Chế phẩm sinh học SH-1, Phyto-M FusaT Viện Bảo vệ Thực vật sử dụng để hạn chế gây hại tuyến trùng số nấm gây hại vùng rễ hồ tiêu, cà phê, sầu riêng, xồi, ăn có múi loại rau mầu (Lê Thu Hiền cs 2014; Hà Minh Thanh cs 2013) 1.4 Sản xuất ăn có múi Cao Bằng Cao Bằng có điều kiện khí hậu khắc nghiệt, mùa đơng lạnh chênh lệch nhiệt độ trung bình ngày đêm cao, khắc nghiệt đó, với tiến hố tự nhiên góp phần làm nên hương vị cho nhiều giống cam quýt tỉnh cam Trưng Vương Quýt Hà Trì, quýt Trà Lĩnh…., trở thành trồng mũi nhọn nhiều địa phương tỉnh Năm 2003, Chi cục bảo vệ thực vật Cao Bằng thực đề tài điều tra đánh giá sâu bệnh hại cam quýt Cao Bằng cho thấy ghi nhận 12 loại bệnh hại, có loại bệnh hại vi rút vi khuẩn, loại bệnh hại nấm Có loại bệnh gây hại quan trọng làm ảnh hưởng rõ đến suất chất lượng cam Trưng Vương quýt Hà Trì bệnh Greening, bệnh Tristeza, vàng thối rễ, bệnh chảy gôm Cây cam quýt vùng tỉnh bị suy thoái nặng, nguy bị bệnh vàng ngày cao 1.5 Nhận xét chung vấn đề quan tâm Nấm Phytopthora loài nấm gây hại quan trọng ăn có múi Các lồi nấm P nicotianae, P citrophthora, P.palmivora xác định tác nhân gây bệnh thối rễ, chảy gôm, thối ăn có múi nghiên cứu tồn diện vị trí phân loại, đặc điểm sinh học biện pháp phòng trừ vùng sản xuất ăn có múi giới Tuy nhiên nghiên cứu bệnh Phytophthora có múi Việt Nam cịn rời rạc khơng liên tục thường hạn chế mức điều tra tỷ lệ bệnh Chưa có nghiên cứu phát triển chiến lược quản lý bệnh, quản lý vườn ươm, tạo giống kháng bệnh Đặc biệt Cao Bằng chưa có nghiên cứu nguyên nhân gây bệnh biên pháp quản lý bệnh thối rễ, chảy gôm thối cam quýt đặc sản Việc nghiên cứu sử dụng vi sinh vật đối kháng, để sản xuất chế phẩm sinh học phịng trừ bệnh Phytophthora trồng nước ta có kết ban đầu thử nghiệm phịng thí nghiệm hay vườn diện tích nhỏ chưa đáp ứng với yêu câu sản xuất Hướng nghiên cứu nấm Phytopthora hại ăn có múi sử dụng chế phẩm sinh học quản lý bệnh điều cần thiết để đáp ứng nhu cầu phát triển vùng ăn có múi đặc sản Cao Bằng CHƯƠNG II VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Nội dung nghiên cứu Điều tra trạng bệnh nấm Phytophthora spp gây hại ăn có múi Cao Bằng Nghiên cứu đặc điểm sinh học, quy luật phát sinh gây hại nấm Phytophthora spp gây hại có múi Cao Bằng Phân lập, tuyển chọn vi sinh vật đối kháng nấm Phytophthora spp Cao Bằng Đánh giá khả sử dụng vi sinh vật đối kháng phịng trừ bệnh Phytophthora ăn có múi Cao Bằng hệ thống quản lý tổng hợp trồng 2.2 Địa điểm thời gian nghiên cứu 2.2.1 Địa điểm nghiên cứu Các vùng trồng ăn có múi Cao Bằng Nhà lưới, Phịng thí nghiệm Bộ mơn Bệnh - Viện Bảo vệ thực vật 2.2.2 Thời gian nghiên cứu Từ năm 2014 – 2020 2.3 Vật liệu nghiên cứu Các nguồn nấm Phytophthora phân lập ăn có múi Cao Bằng nguồn vi sinh vật đối kháng Các môi trường nuôi cấy vi sinh vật, hóa chất sử dụng phương pháp PCR, Cặp mồi ITS4 ITS5 Một số thuốc trừ nấm hóa học chế phẩm sinh học Máy PCR, máy điện di, kính hiển vi quang học, kính lúp soi nổi, máy đo pH, tủ sấy, nồi hấp, dụng cụ vật liệu thí nghiệm, cần thiết khác 2.4 Phương pháp nghiên cứu 2.4.1 Điều tra trạng bệnh Phytophthora có múi Cao Bằng Điều tra thu thâp mẫu bênh thối rễ, chảy gôm, thối vùng sản xuất có múi huyện Hịa An, Trà Lĩnh, Thạch An, Ngun Bình Phục Hịa Theo phương pháp nghiên cứu Bảo vệ thực vật, 1997, Quy chuẩn kỹ thuật Quốc gia (QCVN 01 - 119: 2012/BNNPTNT) * Phương pháp xác định tác nhân gây bệnh Phân lập nấm Phytophthora: Phân lập nấm từ mẫu bệnh phân lập nấm từ mẫu đất: Sử dụng phương pháp mồi bẫy cánh hoa hồng Erwin & Riberrio, 1996 Nấm sau phân lập lây bệnh nhân tạo trở lại con, xuất vết bệnh mô tả triệu chứng, tái phân lập nấm So sánh triệu chứng bị + Môi trường chọn lọc để xác định tính yếm khí nguồn vi khuẩn xạ khuẩn đối kháng: Peptone 2g; NaCl 5g; KH2PO4 0.3g; Agar 3g; Bromthymol blue (1%) 3ml; nước cất 1000 ml; pH = 7,0 + Môi trường chọn lọc để thử khả khử Nitrat: Nước thịt pepton1000 ml; KNO3 10 g; pH = 7,0 - 7,6 + Mơi trường khống khả đồng hóa nguồn bon từ đường Glucose Sacarose nguồn vi khuẩn xạ khuẩn có triển vọng: NH4)2SO4 g MgSO4.7H2O 0,2 g; NaH2PO4.H2O 0,5 g; CaCl2.2H2O 0,1 g; K2HPO4 0,5 g; Nước cất 1000 ml Hoạt độ enzym chitanase, ß-glucanase cellulase vi khuẩn xạ khuẩn định tính phương pháp đo đường kính vịng phân giải môi trường cảm ứng tổng hợp loại enzym (Đánh giá theo phương pháp tuyển tập vi sinh vật học Nguyễn Đức Lượng, 2004) 2.4.3.2 Khả đối kháng vi sinh vật đối kháng điều kiện đất nhà lưới Thí nghiệm gồm 04 cơng thức, công thức 05 cây, nhắc lai 03 lần CT1: B amyloliquefaciens (BHA12.2), CT4: S misionensis (STL2.7) CT2: B methylotrophicus (BNB3.8), CT5: Đối chứng xử lý nước cất CT3: S misionensis (STL2.7) Kiểm tra Mật độ nấm Phytophthora tồn đất sau 15 ngày, tháng, tháng tháng bẫy cánh hoa hồng 2.4.3.3 Khả hạn chế nấm Phytophthora chế phẩm CB-1 nhà lưới Cơng thức thí nghiệm: Cơng thức CT1 CT2 CT3 CT4 P palmivora (Phyto-1) 2,5 5,0 10 Đ/C P nicotia)nae (Phyto-3) 2,5 5,0 10 Đ/C P citrophthora (M2) 2,5 5,0 10 Đ/C Kiểm tra mật độ nấm Phytophthora tồn đất sau tháng, tháng tháng mồi bẫy cánh hoa hồng Hiệu phịng trừ tính theo cơng thức Abbott 2.4.3.4 Khả hạn chế nấm Phytophthora chế phẩm CB-1 số chế phẩm sinh học khác ngồi đồng ruộng Thí nghiệm thực cam – năm tuổi xã Trưng Vương, huyện Hòa An với thuốc trừ nấm sinh học Actinovate 1SP (Streptomyces lydicus WYEC 108), chế phẩm sinh học SH-BV Viện Bảo vệ thực vật, chế phẩm Trico ĐHCT Đại học Cần Thơ chế phẩm CB-1 Cơng thức thí nghiệm: Công thức Nồng độ Công thức Nồng độ CT 1: Actinovate 1SP 2,5g/cây CT CB-1 80g/cây CT SH-BV 80g/cây CT Bio-VAAS.1 80g/cây CT Phyto-M 80g/cây CT Đ/C (không xử lý) 10 CT Tricô ĐHCT 2,5g/cây Chỉ tiêu theo dõi: Tỷ lệ bệnh, số bệnh, trước 3, tháng sau sử lý, đánh giá hiệu giảm bệnh, suất cơng thức thí nghiệm 2.4.3.5 Thử nghiệm hiệu thuốc BVTV bệnh thối rễ, chảy gơm Cơng thức thí nghiệm CT Tên thuốc Hoạt chất Nồng độ (%) CT1: Aliette 80WP Fosetyl-aluminium 80% 0,25 CT2: Ridomil gold 68WP Mancozeb 64%+Metalaxyl 4% 0,3 CT3: Vidoc 80WP Copper Oxychloride 80% 1% CT4: Agri fos – 400 Axit Phosphoric 0,5% CT5: CB-1 VSV đối kháng 80g/cây CT6: Bio-VAAS.1 VSV đối kháng 80g/cây CT7: Đ/C không xử lý Thử nghiệm diện hẹp bố trí vườn quýt 10 năm tuổi xã Quang Hán, huyện Trà Lĩnh với 05 công thức, công thức 10 cây,nhắc lại lần Theo dõi: TLB (%) CSB (%) 1, tháng sau xử lý lần hiệu lực thuốc (%) 2.4.4 Nghiên cứu khả sử dụng vi sinh vật đối kháng phòng trừ bệnh thối rễ chảy gôm nấm Phytophthora ăn có múi hệ thống quản lý tổng hợp trồng 2.4.4.1 Nghiên cứu phương pháp sử dụng chế phẩm CB-1 Thử nghiệm diện rộng gồm 04 công thức vườn trồng quýt Trà Lĩnh 10 năm tuổi, công thức 30 Mỗi công thức thu điểm, điểm thu 03 mẫu đất xung quanh tán Đánh giá tỷ lệ cánh hoa bị mầu 1, tháng sau xử lý 2.4.4.2 Thử nghiệm số lần thời điểm sử dụng chế phẩm CB-1 Thử nghiệm diện rộng gồm 04 công thức vườn trồng quýt Trà Lĩnh 10 năm tuổi, công thức 30 Mỗi công thức thu điểm, điểm thu 03 mẫu đất xung quanh tán Đánh giá tỷ lệ cánh hoa bị mầu 1, tháng sau xử lý 2.4.4.3 Sử dụng chế phẩm CB-1 phân bón Thí nghiệm bao gồm công thức, lần nhắc lại Mỗi lần nhắc 05 Chỉ tiêu theo dõi: Tỉ lệ bệnh số bệnh sau bón phân 1,2 tháng 2.4.4.4 Sử dụng chế phẩm CB-1 kết hợp với tỉa cành, tạo tán vệ sinh đồng ruộng Thí nghiệm diện rộng bố trí vườn cam 10 năm tuổi huyện Hịa An, 30 cây/cơng thức Thử nghiệm bắt đầu thực sau thu hoạch Mỗi công thức thu điểm, điểm thu 03 mẫu đất xung quanh tán Đánh giá tỷ lệ cánh hoa bị mầu 1, tháng sau xử lý 2.4.4.5 Nghiên cứu ảnh hưởng biện pháp canh tác bệnh thối gốc chảy gơm - Biện pháp phân bón: bố trí Hịa An, vườn cam Trưng Vương tuổi 11 Thí nghiệm bao gồm cơng thức, lần nhắc lại Mỗi lần nhắc 05 Chỉ tiêu theo dõi: Tỉ lệ bệnh số bệnh sau bón phân 1,2 tháng 2.4.5 Phương pháp xử lý số liệu: Số liệu tổng hợp phần mềm Microsoft Excel 2007 xử lý thống kê theo chương trình IRRISTAT 5.0 CHƯƠNG III KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 3.1 Hiện trạng sản xuất ăn có múi bệnh thối rễ, chảy gơm ăn có múi Cao Bằng 3.1.1 Hiện trạng sản xuất ăn có múi Cao Bằng Diện tích ăn có múi Cao Bằng: Diện tích trồng đến năm 2014 huyện đạt 208 với lồi ăn có múi đặc sản Cao Bằng Diện tích quýt Trà Lĩnh năm 2019 đạt 164,5 chiếm 62,5% diện tích có múi tồn tỉnh Hịa An vùng phù hợp cho cam quýt phát triển Hiện trạng sử dụng giống: Tại Hòa An trồng hạt (50%), cành chiết (23,3%), có 10% số hộ trồng ghép gốc bưởi 16,7 % số hộ trồng giống ghép gốc ghép chấp Tại Trà Lĩnh: Trước người dân dều trồng hạt cành chiết, năm gần đây, nhiều hộ gia đình tự nhân giống phương pháp ghép gốc bưởi tỷ lệ vườn quýt trồng giống ghép gốc bưởi cao, đạt 53,3% Tại Phục Hòa tỷ lệ hộ trồng cành chiết cao (66,7%) so với hộ trồng ghép gốc bưởi (33,3%) Hiện trạng tuổi cây: Các vườn ăn có múi Cao Bằng chủ yếu nằm độ tuổi từ – 15 năm tuổi, vườn năm tuổi chiếm 6,7 - 33,3%, từ đến 10 năm tuổi nhiều đạt 33,3 – 66,6% chiếm ưu vùng Hịa An, Phục Hịa Ngun Bình Thạch An Có 40% số vườn từ 10 đến 15 năm tuổi vùng Quýt Trà Lĩnh Vườn 15 năm tuổi đạt cao 13,3% vùng trồng bưởi Phục Hòa Các vùng Hòa An, Trà Lĩnh vườn ăn có múi 15 năm tuổi khơng cịn hay cịn ít, ngun nhân sâu, bệnh gây hại nặng người dân thường phải chặt trồng lại nhiều lần Kĩ thuật chăm sóc * Về bón phân: 100% hộ trồng quýt Trà lĩnh có bón phân cho cây, Hòa An 86,7%, huyện Phục Hòa, Thạch An ngun bình có tỷ lệ thấp từ 13,3 – 26,7% số hộ bón phân cho có múi * Về cắt tỉa: Số hộ áp dụng kĩ thuật cắt tỉa cao Trà Lĩnh (53,3%), huyện Hịa An, Ngun Bình, Thạch An có tỷ lệ từ 26,7 – 33,3%, Phục Hòa 100% hộ không cắt tỉa cho * Về tưới nước: Chỉ có 66,7% hộ trồng quýt Trà Lĩnh có tưới nước bổ xung cho vào giai đoạn mùa khơ 12 *Về phịng trừ sâu bệnh: Tỷ lệ hộ có sử dụng thuốc BVTV để phịng trừ sâu, bệnh đạt cao Trà Lĩnh, 100%, tiếp đến Hịa An 66,7%, huyện Ngun Bình Thạch An có tỷ lệ thấp từ 6,7 – 20,0%, Phục Hịa 100% số hộ khơng sử dụng thuốc bvtv để phòng trừ sâu bệnh 3.1.1.2 Thành phần bệnh hại có múi Cao Bằng Đã phát ăn có múi Cao Bằng có 13 loại sinh vật cơng gây hại Trong số sinh vât gây hại virus có lồi, vi khuẩn có lồi, nấm có lồi tảo loài 3.1.1.3 Triệu chứng bệnh thối rễ chảy gơm ăn có múi Cao Bằng Bệnh gây hại tất giai đoạn sinh trưởng cây, từ vườn ươm vườn sản xuất Bệnh hại rễ, thân, cành, Khi bị nấm xâm nhập gây bệnh, triệu chứng bị bệnh cam, quýt, bưởi thể giống Trên vườn kinh doanh rễ bị hại khả hút nước dinh dưỡng không cung cấp đủ cho nhu cầu phát triển Cây còi cọc, sinh trưởng phát triển không đồng đều, vỏ thân, cành bị nứt, chảy gôm phần, tán nhạt màu hay chuyển vàng, rụng, cành khơ chết Quả bị nhiễm bệnh có vết bệnh màu nâu, vỏ cứng giai đoạn ban đầu sau vết bệnh bị thối nứt, trời ẩm ướt bề mặt vết bệnh có lớp nấm trắng 3.1.2 Xác định nguyên nhân gây bệnh thối gốc chảy gôm 3.1.2.1 Phân lập tác nhân gây bệnh có múi nấm Phytophthora gây nên Từ 375 mẫu đất mẫu bị bệnh phân lập 142 mẫu nấm Phytophthora Kết phân lập trình bày bảng 3.6 cho thấy nấm Phytophthora có mặt tất vùng trồng gây hại tất lồi có múi Cao Bằng Có 59,2 % mẫu đất thu từ vườn bị bệnh phân lập nấm Phytophthora từ thân, lá, bị bệnh 33,6% từ rễ bị bệnh 20,8% Số mẫu nấm Phytophthora phân lập từ mẫu thu thập Trà Lĩnh 35 mẫu, Hòa An Phục Hòa vùng 29 mẫu, Nguyên Bình 25 mẫu cuối Thạch An 24 mẫu 3.1.2.2 Xác định lồi Phytophthora dựa vào đặc điểm hình thái học Sự phát triển 142 nguồn nấm Phytophthora môi trường PDA chia thành nhóm khác Nhóm (1) Tản nấm phát triển dạng bơng, tản nấm có màu trắng môi trường V8, môi trường PDA, màu trắng đục Nhóm (2) tản nấm phát triển dạng mịn, màu trắng môi trường V8 mơi trường PDA có dạng cánh hoa, màu trắng đục Nhóm (3) tản nấm có màu trắng phớt hồng mơi trường V8, mơi trường PDA tản nấm phát triển hình cánh hoa đặc trưng, màu trắng Theo khóa phân loại Erwin Ribero (1996), nhóm gồm hai mẫu Phyt-01 Phyt-02 có hình thái tương tự với nấm Phytophthora palmivora, nhóm gồm hai mẫu Phyt-03 Phyt-04 thuộc nấm Phytophthora nicotianae Nhóm gồm mẫu M1 M2, M3, M4, 13 M5 M6 tương tự mô tả Erwin Ribero (1996), Hamm Hansen (1987) nấm Phytophthora citrophthora 3.1.2.3 Xác định loài Phytophthora kỹ thuật PCR Sử dụng cặp mồi ITS4 ITS5 để xác định mẫu nấm Phytophthora ITS4: 5’- TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’ ITS5: 5’-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3’ Bảng Kết tìm kiếm trình tự gần gũi GenBank mẫu Phytophthora, Phyt-01 Phyt-02, dựa trình tự ITS (Năm 2015) Phần trăm đoạn Mức đồng STT Loài xác định Mã GenBank so sánh (%) trình tự (%) P palmivora 100 99.9 MT052675 P palmivora 100 99.9 MK500842 P palmivora 100 99.9 MH401199 P palmivora 100 99.9 MF370566 P palmivora 100 99.9 MG434772 Ghi chú: trình bày trình tự gần Phân tích trình tự mẫu Phyt-01 Phyt-02 cho thấy loài gần gũi P palmivora Bảng Kết tìm kiếm trình tự gần gũi GenBank mẫu Phytophthora, Phyt-03 Phyt-04, dựa trình tự ITS (Năm 2015) Phần trăm đoạn Mức đồng STT Lồi xác định Mã GenBank so sánh (%) trình tự (%) P nicotianae 99 99.9 KR827692 P nicotianae 99 99.9 KJ865230 P nicotianae 99 99.9 JF792541 P nicotianae 99 99.9 JF792540 P nicotianae 99 99.9 GU111681 Ghi chú: trình bày trình tự gần Phân tích trình tự mẫu Phyt-03 Phyt-04 cho thấy loài gần gũi P nicotianae Bảng 3 Kết tìm kiếm trình tự gần gũi GenBank mẫu Phytophthora (M1 – M6) dựa trình tự ITS (Năm 2015) Phần trăm đoạn Mức đồng STT Loài xác định Mã GenBank so sánh (%) trình tự (%) P citrophthora 100 100 GU111603 P citrophthora 100 100 GU111602 P citrophthora 100 100 GU111601 P citrophthora 100 100 GU111600 P citrophthora 100 99.6 GU133066 Ghi chú: trình bày trình tự gần Phân tích trình tự mẫu cho thấy loài gần gũi P citrophthora 14 3.1.2.4 Kết lây bệnh nhân tạo Lây nhiễm bệnh nhân tạo cam Trưng Vương chín sinh lý cách áp miếng vải nhúng dịch nấm x 105 bào tử/ml với 03 loài nấm P palmivora, P nicotianae P citrophthora vào mặt cam, giữ ẩm đặt tối nhiệt độ từ 26 -280C Tất nấm P palmivora, P nicotianae P citrophthora lây bệnh cho cho cam 100% mẫu bị bệnh phân lập nấm Phytophthora, tản nấm có cách mọc giống tản nấm nguồn sử dụng để lây bệnh, thời gian tiềm dục bệnh từ 27 – 30 ngày sau lây nhiễm Kết lây bệnh nhân tạo quả, thân phân lập lại cho thấy, nguồn nấm P palmivora, P nicotianae P citrophthora phân lập từ bệnh thối rễ, chảy gôm ăn có múi Cao Bằng tác nhân gây bệnh thối rễ chảy gôm ăn có múi Cao Bằng 3.2 Nghiên cứu các đặc điểm sinh học, nuôi cấy nấm Phytophthora 3.2.1 Nghiên cứu đặc điểm sinh học nấm Phytophthora Ảnh hưởng nhiệt độ đến khả hình thành bọc bào tử 03 loài nấm Phytophthora Nấm P palmivora, điều kiện tốt để nấm sản sinh bọc bào tử điều kiện 250C, nấm P nicotianae nhiệt độ 300C thích hợp nhất, nấm P citrophthora thích hợp khoảng nhiệt độ từ 15-250C Ảnh hưởng môi trường nuôi cấy đến sinh trưởng nấm Phytophthora Cả loài P palmivora, P nicotianae P citrophthora phát triển loại môi trường Cả lồi nấm phát triển mơi trường PSA, phát triển tốt môi trường V8A Các loại mơi trường PDA, CRA V8A thích hợp cho ba loài nấm phát triển Ảnh hưởng pH đến sinh trưởng nấm Phytophthora Cả loài Phytophthora sinh trưởng phát triển phổ pH rộng từ chua đến kiềm nhẹ từ mức pH 4,5 – 8,0 mức pH từ đến thích hợp cho sinh trưởng phát triển loài 3.2.2 Quy luật phát sinh, gây hại nấm Phytophthora spp Trên có múi Cao Bằng 3.2.2.1 Diễn biến bệnh thối rễ chảy gơm ăn có múi Cao Bằng Bệnh thối rễ chảy gôm xuất hiện, phát sinh gây hại có múi suốt năm Các tháng mùa khô (từ tháng 11 đến tháng năm sau) bệnh có xuất với tỉ lệ thấp so với tháng mùa mưa (từ tháng đến tháng 10) Các cam, quýt bị bệnh nặng bưởi 15 Biểu đồ Diễn biến bệnh thối rễ, chảy gơm có múi Cao Bằng năm 2015 2016 3.2.2.2 Ảnh hưởng yếu tố sinh thái đến phát triển bệnh thối rễ chảy gơm Ảnh hưởng của địa hình đến mức độ nhiễm bệnh thối rễ chảy gôm Cả loại cam, quýt, bưởi có tỷ lệ bệnh cao vườn nằm gần chân núi đá (34,6 – 50,3%), tiếp đến khu vực trồng chân đồi, ven suối, đất ruộng (32,1 – 41,3%) Tỷ lệ bệnh thấp khu vực trồng đỉnh đồi (14,3 – 21,3%) Ảnh hưởng giống đến phát sinh phát triển bệnh thối gốc chảy gôm Điều tra mức độ nhiếm bệnh thối rễ, chảy gôm giống quýt Trà Lĩnh, Hà Trì, Hoa Thám Trọng Con Cả giống quýt bị bệnh thối rễ chảy gôm Giống quýt Trà lĩnh bị nhiễm bệnh cao có tới 42,5 – 45,1% số điều tra bị nhiễm bệnh với mức độ bệnh nặng số bệnh đạt 20% Giống quýt Hoa Thám bị bệnh nhẹ tỷ lệ bị bệnh từ 10,4 – 12,5% số bệnh từ 6,3- 6,8% (bảng 3.21) Ảnh hưởng tuổi đến phát sinh phát triển bệnh thối gốc, chảy gôm Tại Cao Bằng quýt bị bệnh thối rễ chảy gôm nặng sau 10 năm có tới 42,3% bị bệnh nhẹ bưởi sau 10 năm có 24,1% bị bệnh 3.3 Phân lập, tuyển chọn vi sinh vật đối kháng nấm Phytophthora từ đất trồng ăn có múi Cao Bằng 3.3.1 Phân lập, tuyển chọn chủng vi sinh vật đối kháng Từ mẫu đất thu thập Cao Băng phân lập 112 nguồn VSV Trong có nguồn có khả đối kháng mạnh với nấm Phytophthora, 31 nguồn có khả đối kháng trung bình 30 nguồn có khả đối kháng yếu 16 Lụa chọn mẫu VSV có khả ức chế cao mẫu nấm Phytophthora thu thập vùng khác Mẫu STL2.7 có khả ức chế cao đường kính vịng vơ khuẩn hình thành với mẫu nấm Phytophthora 28,4, 27,8 26,5 mm mẫu BNB3.8 có đường kính vịng vơ khuẩn 27,8, 28,6, 27,2mm Hiệu ức chế trung bình với mẫu nấm Phytophthora mẫu BNB3.8, STL2.7 BHA12.2 85,7; 84,8 82,2% 3.3.2 Xác định vi sinh vật đối kháng mức độ an toàn sinh học Định danh vi sinh vật đối kháng theo đặc điểm sinh hóa hoc Các kết nghiên cứu hình thái khuẩn lạc, tế bào, nhuộm Gram khả sử dụng oxy nguồn bon xác định đươc mẫu VSV BHA12.2 BNB3.8 thuộc giống Bacillus mẫu STL2.7 thuộc giống Streptomyces Định danh vi sinh vật đối kháng phương pháp PCR Cặp mồi Phy1F Phy1R Sử dụng để xác định mẫu BHA12.2, BNB 3.8 STL2.7 Trình tự gen 03 mẫu BHA12.2, STL2.7, BNB3.8 so sánh so sánh với mẫu gen ngân hàng gen quốc tế Trình tự gen mẫu BHA12.2 tương đồng 99,62% với loài Bacillus amyloliquefaciens đăng ký với mã số Genbank FN597644, mẫu BNB3.8 tương đồng 99,72 với loài Bacillus methylotrophicus đăng ký với mã số Genbank AB184285 mẫu STL2.7 tương đồng 100% với loài Streptomyces misionensis đăng ký với mã số Genbank AB184285 Bảng Kết định danh các chủng VSV đối kháng nấm Phytophthora gây bệnh ăn có múi (Năm 2017) Mẫu VSV Mã trình tự BHA12.2 13B5ZAA012 13B5ZAA013 BNB3.8 13B5ZAA004 13B5ZAA005 STL2.7 13B5ZAA024 13B5ZAA025 1321 Phần trăm đồng trình tự 99,62 1436 99,72 1421 100 Kích thước sản phẩm sau lắp ráp (bp) Mã GenBank Loài FN597644 Bacillus amyloliquefaciens AB184285 Bacillus methylotrophicus AB184285 Streptomyces misionensis Xác định mức độ an toàn sinh học nguồn vi sinh vật đối kháng Đối chiếu tên vi sinh vật đối kháng với thang phân cấp an toàn sinh học Mỹ Châu Âu Cả 03 loài vi sinh vật đối kháng cấp độ an toàn sinh học số theo cấp độ 17 ... vi sinh v? ?t đối kháng nấm Phytophthora có ho? ?t tính cao Thử nghiệm khả sử dụng vi sinh v? ?t đối kháng để phòng trừ nấm Phytophthora gây bệnh ăn có múi Đề xu? ?t biện pháp phòng chống hiệu bệnh nấm. .. mẫu nấm Phytophthora K? ?t phân lập trình bày bảng 3.6 cho thấy nấm Phytophthora có m? ?t t? ?t vùng trồng gây hại t? ? ?t lồi có múi Cao Bằng Có 59,2 % mẫu đ? ?t thu t? ?? vườn bị bệnh phân lập nấm Phytophthora. .. thực đề t? ?i Nghiên cứu bệnh nấm Phytophthora spp gây hại có múi biện pháp phòng chống theo hướng sinh học Cao Bằng điều cần thi? ?t nhằm xác định nguyên nhân, đặc điểm, quy lu? ?t ph? ?t sinh gây hại